Способ получения ротавирусных антигенов

 

Изобретение относится к медицинской ч ветеринарной BHpvconorHH, в частности к технологии получения антигенных препаратов, Цель изобретения - повышение выхода биомассы ро- (Тавирусных антигенов. Это достигается предварительной обработкой культуры клеток гидрокортизоном в количестве 0,03-0,07 мг/мл за 24 ч до заражения, а затем внесением вируса и после завершения его репродукции очисткой и концентрированием антигенов адсорбцией ча частипах сорбента - аминоэтоксиазросила при кислых значениях рН 4,0-5,0 и элюпией при щелочных значениях рН 8,2. 12 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ по изоБРетениям и отнРытиям

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ «ЕНИЯ

= "1 -Я1Я 1О ТЕМ (21) 4678836/13 (22) ?3.01.89 (46) 23.12,91. Бюл. ¹ 47 (71) Киевский государственный институт усовершенствования врачей

МЗ СССР (72) В.Н.Гирин, И.И.Бойко, И.В.Дзюблик и В.II,Плугатырь (53) 576,8.097(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 789115, кл. А 61 К 39/225, А 61 В 10/00, 1980. (54) СПОСОБ ПОЦУЧЕНИЯ РОТАВИРУС(ЫХ

АНТИГЕНОВ (57) Изобретение относится к медицинИзобретение о. носится к медицинской и ветеринарной вирусологии, в частности к технологии получения антнгенных препаратов. .Цель изобретения — повышение выхода биомассы ротавирусных антигенов.

Способ осуществляют следующим образом. В культуру клеток человека или, животных, предварительно обработанную гидрокортиэоном в дозе 0,03-0,07 мг/мл среды в течение 24 ч, вносят ротавирус в заражающей дозе 0,35 ЩЛ<

48 ч. Затеи клетки вместе с культу ральной средой трижды эамораживают и оттаивают, клеточный детрит осаждают центрифугированиегя, вируссодержащую надосадочную жидкость обрабатывают 1М НС1 до рН 4,0-5,0. В подкисленную надосадочную вируссодержащую

„,SU„„) 7ооо54 (51) 5 С 12 N 7/00 А 61 К 39/00

2 ской и ветеринарной вирусологии, в частности к технологии получения антигенных препаратов. Цель изобретения — повышение выхода биомассы ро;тавирусных антигенов, Это достигается предварительнn÷ обработкой культуры клеток гяядрокор:иязоном в количестве

0,03-0,07 мг/мл эа 24 ч до заражения, а эатегя внесением вируса и после завершения eãо репродукции очисткой н концентрированием антигенов адсорбпией на частит ах сообента — амияоэтокснаэроси. а при кислых значениях рН 4,0-5 0 и элюпией при щелочных значениях рН = 8,2. 12 табл.

С:

;я=дикость вносят 175 :гg ë аминоэтоксиаэросила для адсорбции ротавирусных ант:ягенов, встр-iхивают 5 мин, центриАугируют при 2 тыс. об/мин — 15 мин, после чего надо адок, уже не содержащий ротавируснь.х антигенов, удаля- 1,,я ют. К осадку, представляющему собой вирусный антиген, сорбированный частицам- аминоэтоксиаэросила добав- д ,ляют для эяпоции 0,05!. трис-буйер д (pH 8,2) в количестве 1Е по отношению к исходному объему жидкости, встряхивают и освобождают от аминоэтоксиаэросила центряяяяяугированием при .. тыс. об/мнн — 15 минут, надоса-,фь док — готовый продукт, 3

П р и и е р !, Получение антиге-яов ротавируса обезьян SA-11.

Fo в -r-.eel клеток перевиваемой липни почки свиньи СПЗВ в питательной среде (45X среды 199,45К среды Игла

1700054 и 107. сыворотки к1)уппого рогатого сКОта) при посевной концентрации клеток

150 тыс/ил вносят 0,03 мг /мл гидрокортизопа, а при посевиo!» концентрации 200 тыс. кл./мл — 0,07 мг/мл.

Дозы г3(3(1)02(ортизо»»а I. B))(e 0,03 мг/мл недостаточно э()()фe!IT!(BI!I.I, а выше

О. О/ м! /мл принo;(s!T 3((! Iieтению реГц)адg:кш(и ро тапи()усов в:(летОчных 10 культура с (см. Табл. 1) . Обработанную ных шеикерах,, 1 oc3:.е чего повторно центр "(фу»ч»1) ую гри - ("»с- ° об/мин в Ге 35 чепие 15 мин. Надосадок удаляют и эл:опруют ротавирусные антигены О, 5И трио буфером (рП Л, .2) B ooúeì, состав3(я»ощии I % oт исхОдного .

Э «IIIepи;(е(»та3»ь((3;:е данные по влияни(о рН реакционной среды на адсорбцию рота)зир;-са о без ян НЛ-. 1 1 представлены в табл. 2. Установле((0,, что 93,8% ротавируса а, „cop,)è )óe -ся на частицах а(:иназ Гаксиазрос»(ла 1(р»» I(I»cJ!Bix значениях р.1 (4,0- 5,0) .

Да ..ные по 3»з.)=»Е(31! о З; )О)ЕКТИВ»(ОСти

BI!I()I

0 амина э Гак Jiiaopоc1»;(а 32 зйвиси IocTII от pFI элюирующего раствора представле 5 кы в табл, 3, (1аивысшей элюиру(ощей ,:.по" oбнО -.Т3»ю О())-:.(,()а(.Г О р 05 1 l трисбуфер -" р) I

0j)aH: .(те3(ь(11>! да((!»ь!е:; показ((ва(о

1(»»е -,р -.: Iy((!ecтна предложи(нного спасо- > ба по сравпенио с прототипом на эта-пах о-;I»c Tê!» и кон((еi(Tp!»puBa рога.ви»)ус» (;безь (1! НА-11 по таким харакT еристикам к .;с об:ем., (.о;(ержание белвзвесь клеток раз3(и)»а(от и выращива(от

»2 О Бра Цаю(1»ихс Я бут ылЯ х B y стр Ойс тве дХ(я ра) Пг(e!) I .О О ((" J(I-.Т(П""2)(JHHÍ»(ÿ, 1 а (I(2)op (IIo0BaBII33лц(-Я -.; ет)е з 24 )(мана(.лой

ПРЕ3(В-.I?II I (.)!1 1»0 «Шн (ТЫй OT

I20I)oтки ра(.твopo! I Эр3)а (рН 7, C)), наИОсят po Гав»»1)ус oб. з: Я((SA 1 1 B дОзе

0,.25 ХЦД(,-„/ (сл. 3;-:. Гем через 1 ч

Э "..

D адсорбцпп B!ij)yc(: на клетках ири 37 С 20 бутыли з(33(3 ва!."т подде1)жива(ощей средой сле,(у(()(;eBО саста»за-; 507, среды 199.,507 среды И» ла. 1 мкг/м3(трипсина.

Па слс - д() с т»03(сии)(макс»») ()Йль 3»ОГО цитопа:1 (г-.еск()го э(ь)()екта через 48 ч 25 ,":-ггыли и((то((с»п)1 о ьстряхива)от и пере220ДЯ! М(Е (3;и 0 ь за(ЗСЬ ) KO(OP))IO ТГИж ды замор;. п(32а(от и оттаива(от, клеточные обломки уда)(Я;)т цс)(три(()угированием при 2 -Гыс. с ()/(и! -- 15 мин. Нацосадок ц сгб(»1)аю(q п01(к» лл1от II 1(С1 ДО рН 4, 05, 0 . В и О с Я т 1 / 5 их- / 3 (а.(1И н 0 з Г 0 к с иа э р 0сила., встряхива)от 5 мин на лаборатop-ка, титр в РНГЛ антигена и выход конечного продукта, представлены в табл. 4,.

Пример ?. Получение антигенов ротавир тса свиней, штамм "К".

Ro взвесь клеток перевиваемой линии почки свиньи СПЭВ в питательной среде (45% среды 199,45% среды Игла и 10% сыворотки крупного рогатого скота) при посевной концентрации клеток 150 TI!c/мл вносят 0,03 мг/мл гидрокортизона, а при посевной кон— центрацг(и ?00 тыс.»(JI/мл — 0,07 мг/мл.

Дозы гидрокортизона ниже О, 03 мг/мл недоста Гачно эффективны.„ а выше

0,07 мг/мл приводят к угнетению репродукции ротавирусов в клеточных культурах. Данные по подбору опти-мальной дозы гидрокортизона приведе— ны н табл. 5. Обработанную взвесь клеток разливают и выращивают во вращающихся бутылях B устройстве для роллерного культивирования. На САормировавшийся через ?4 ч монослой клеток, предварительно отмытый от сыворотки раствором Эрла (рН 7,б), наносят ротавирус свиней, штамм "1(" в до;зе 0,25 ТЦД „ /кл. Затем через 1 ч адсорбцин вируса на клетках при 37 С бутыли заливают !Io I,((cpm(Ban!(!eA ср едой следу(о(;его состава: 5А% среды 199,50% а среды Игла, " мкг/мл трипсина

После достижения максимального цитопатического эо)(»)екта через 48 ч бутыли интенсивно BcTpII)5»Ba!0T и пере— водят клетки во взвесь, которую трижды замораживают и оттаива(от, клеточные обломки удаляют центрифугировани-, ем при 2 тыс, об/мин — 15 мин. Надосадок отбирают, подкисляют 11» НС1 до рН 4,0-5,0, вносят 175 ь(г/л аминоэтоксиа оросила, встряхивают 5 мин на лабора "орных шейкерах, после чего повторно центрифугируют iip!I 2 тыс. об/мин — 15 мин. Надосадок у!»аляют и э3поиру»от ротавирусные антигень)

0,511 трис-буфером (рН 8,2) в объем, сî0ñс òTàaâB3ë»)ÿ»iþ0(ù(»èHé 1% от исходного .

Экспериментальные данпь(с I о влиянию рН реакционной cpe3)II IIB адсорбцию ротавируса свиней, штамм K" представле п,(в табл. 6 . Устаповлено, чта

93,87, ротавируса свиней, штамм "К адсорбируется на частицах аминоэтаксиаэросила при кислых значениях рН (4,0-5„0).

Данные по э(()*екти)(ности элюции рставируса свиней, штамм ) К(с амино1700054

0,0r

0„02

О.О:

0,О5

0,06 ), 07

0, ОЙ

0,1

3,5

6,3

7,0

7,0

7,0

6,0

1,0 этоксиаэроси..=i . .;:- .висимости от оН элюирующего раствора представлены табл ° 7. Наивысшей элюирующей сггособностью обладает 0,05Р тряс-буфер с рН 8,?..

Сравнительные данные, показывающие преимущества предложенного способа по сравнению с известным на этапах очистки и концентрирования ротавируса 10 свиней, штамм "K" по таким характеристикам, как объем, содержание белка, титр в PHIA антигена и выход конечного продукта, представлены в табл.8.

Пример 3. Получение антигенов 15 ротавирусов свиней, штамм "T".

Во взвесь клеток перевиваемой линии почки свиньи СПЭВ в питательной среде (45.. среды 199,45 среды Игла и 10? сыворотки крупного рогатого ско 20 та) при посевной концентрации клеток

150 тыс.кл/мл вносят О,ОЗ Mr/mr гидро:кортизона, а при посевной концентрации 200 тыс.кл/мл — 0,07 мг/мл. Jlîçû гицрокортизона ниже 0,03 кг/мл недо статочно эффективны, а выше 0,07 мг/мл приводят к угнетению репродукции ро— тавирусов в клеточных культурах. Данные по подбору оптимальной дозы гидрокортизона приведены в табл. 9. 30

Обработанную взвесь клеток разливают и выращивают во вращающихся бутылях в устройстве для роллерного культивирования. На сформировавшийся через 24 ч монослой клеток, предварительно отмытый от сыворотки раствором

Эрла (рН 7,6), наносят ротавирус свиней, штамм "T" в дозе Э,25TIVI;>>/кл.

Затем через 1 ч адсорбции вируса на щ клетках при 37 С бутыли заливают под— о держивающей средой следующего состава:

507 срецы 199,50Е среды Игла, 1 мкг/мл трипсина.

После достижения максимального цитопатического эффекта, через 48 ч бутыли интенсивно встряхивают и переводят клетки во взвесь, которую трижды замораживают и оттаивают, клеточные обломки удаляют центрифугированием при ? тыс, об./мин — 15 мин.

Надосадок отбирают, подкисляют 1И НС1 до рН 4,0-5,0, вносят 175 мг/л амино— этоксиаэросила, встряхивают 5 мин на лабораторных шейкерах, после чего по-. вторно центрифугируют при 2 тыс. об/мин — 15 мин. Надосадок удаляют и элюируют ротавирусные антигены 0,51 трис-буфером (рН 8,2) в объем, сос— тагляющий 17 от исходного.

Экспериментальные данные по влиянию рН реакционноч среды на адсорбцию ротавируса свиней, штамм "Т". представлены в табл. 10. установлено, что 92? ротавируса свиней, штамм "Т", адсорбируется на частицах аминоэтоксиаэросила при кислых значениях рН (4,0 — 5,0) .

Данные по эффективности элюции ротавируса свиней, штамм "Т" с аминоэтоксиаэросила и зависимости от рН элюирующего раствора представлены в табл. 11. Наивысшей элюирующей способностью обладае= 0 )5N трис-буфер с рН 8,?.

Сравнительные данные, показывающие преимущества предложенного способа по сравне1лию с изв cтным на эгапах очистки и концентрирования ротавируса свиней, штамм Т по таким характеристикам как объем, содержание белка, титр в ГИГА антигена и выход конечного продукта, представлены в табл.12. о р и у л а и з о 6 р е т ения

Способ получения ротавирусных антигенов, включаю:шлйл выращивание ротавирусов в клеточных культурах, их выделение из ин пщированных клеток с последующей очисткой и концентрированием:, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта В средъ добавляют гидрокортизон в количестве "i,03-0,07 мг/мл ь за 24 ч .до заражения клеточной культуры, а очистку .:-: концентрирование осуществляют адсорбцией ротавирусного антигена Hp- сорбенте при кислых значениях рП 4,0 — 5,0 с п.следующей элюцией при щелочных значениях рН 8,? .

Та блица 1

Влияние доз гIfäðîêîðòèýîíà па ин- " фекционныч титр ротавируса обезъян

Доза ги.—, рокорти.-.n- Инфекционный титр

«.на, мг/мл 1ротавируса обе:-.ьян !

ЯА — 11. 1.,; Т Г /мл

1700054

Та блица

Влияние р11 1эеакционной среды на адсорбцию ротавируса обезьян

Процент адсорбированного ротавируса обезьян SA — 11, % рН реакционной ср еды

Т а б л и ц а 3

Эффективность элюции ротавируса обезьян с аминоэтоксиаэросила в зависимости от рН э.пюирующего раствора

Элюирующая система рН элюирую 1ей Титр ротасистемы вируса SA-11 в РНГА ф п/и

5120

7,2

8,0

8,2

9,3

1.

2.

3.

Та блица 4

Сравнительные характеристики биомассы продукта

Антиген- Удельная ная ак- антиген-.

Объем, мл

Ис следуежп материал

Способ

Степень конце нт

Содержание белрирования, 7 исход- конный центка по

Лоури, мг/мл тивность ная активтитр в ность, PHГА ед/мг м-л рат

Ротавирус обезьян

SA-1 1

Способ получения анти1:640

68,8

9,3

100 5

Ротавирус обезьян

SA-11

Способ получения рота1:20480 11252

100

100 1

1,82 гена для диагностики вирусного гастроэнтерита (по известному способу) вирусных антигенов (по предлагаемому способу) 3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

7,0

8,0

Раствор Эрла

Дистиллированная вода

0,05И трис-буфер

0,05И трис-буфер

75,0

93,8

93,8

93,8

87,5

87 0

75,"

75,0

1 7 )0054

Продолжение табл.6

Та блица 5

Влияние доз гидрокортизона на инфекционный титр ротавируса свиней

Доза гидрокортизона, мг/мл

Та блица 7

Эффективность элюции ротавируса свиней с аминоэтоксиаэросила в зависимости AT рН элюируюшегo раствора

Титр ротавирН элюир уюшей сист емы

Злюир уюшая система

zo -" " руса свиней, штамм К в Р11ГА

Та бли ца 6

Влияние рН реализационной среды на адсорбцию ротавируса свиней

25 1.

2. рН реакционной среды

Процент адсорбирован— ного ротавируса сви— ней, штамм "К", %

2560

7 2

1280

8,0

20480

8,2

4, 3,5

4,0

75,0, 93,.8

51? 0

Таблица8.

Сравнительные характеристики биомассы продук та

Т мл

Лнтиген- Удельная

Исследуемый материал

Способ

Объем, Степень

Содержание белконцентриная ак- антигенная исходный концентрат ка по

Лоури, и\ /, ÿ тнв HOCTb активность, ед /мг рова" ния, Х титр в

РНРА

Способ по- Ротавирус лучения свиней, антигена штамм "К"

100 . 5

1:640 75,2 для диагностики вирусного гастроэнтерита {по известному способу) 0,01

0,02

0,03

0,05

0,06

0,07

0,08

0,10

Инфекционный титр ротавируса свиней, штамм "К", 1.р Т1Д,)/мл

3,5

5,0

6,3

7,0

7,0

7,0

6,0

1,0

4,5

5,0

5,5

6, )

7,0

8,0

Раствор Эрла

Дистиллированная вода

0,0511 трис— буфер

0,0511 трисбуД>ер

93,8

93,8

87,5

87,0

75,0

75,0

1700054 сследуемый материал

Способ

Степень конОбъем, мл

Антигенная акСодержание белУдельная антигенная центрирования, Ж исход — концентный рат ка по

Лоури, мг/мл активность, ед/мг тивность титр в

РНГА м-л

Рот авирус

Способ пслуч ения ротави1:20480 10779

100 русных антиге нов (по прецлагаемому способу) Та блица 9

Влияние дo3 гицрокортизона на ин.фекционный титр ротавируса свиней

Доза гидр окортив эона, мг/мл

Инфекционный титр ротавируса свиней, штамм "Т

18 Те о/мл

Та блица 11

Эфектинность элюции ротавируса свиней с аминоэтоксиаэросила в зависимости от рН элюирующего раствора

Титр ротавируса свиней, штамм

"Т" в РНГА рН элюиРующей системы

Элк ир ующая система

Р п/и

Таблица t0

Влияние рН реакционной среды на адсорбцию ротавHpуса cBиней

Раствор Эрла 7,2

Дис.тиллировакная вода 8,0

0,05M трисбуфер 8,2

0905И трисбуфер 9,3

1280 рН оеакциош|ой среды

640

3. 51 20

2660

3 5

4,0

73

0,01

0,02

0,03

0,05

0906

0,07

0,08

0,1

I свинеи 9 штамм "1<" 100 1

1,5

3,0

4,3

5,0

5,0

5,1

4,0

0,5

Процент адсорбирован— ного ротавируса свиней, 111тамм 11Т11

4,5

5,0

5,5

6,0

7,0

8,0

Продолжение табл,8

Продолжение табл.10

92

92

87

87

73

1 700054

Та блица 12 .Сравнительные характеристики биомассы продукта

Объем, мл

Исследуемый материал

Способ

Степень концентриСодержание белАнтигенная актив ность

Удельная антигенная исходный концентка по

Лоури, мг/мл активность, ед/мг рат р онания

% титр в

РИГА м-л

Способ по- Ротавирус лучения ан- свиней, тигена для штАмм "Т" диагностики вирусного гастроэнтерита (по известно20 5,5

1:320 58, 100 5 му способу) P отавирус свиней, штамм ™Т" 100 1

Способ по1:5120 4266,6

100

Редактор Н.Козлова

Заказ 4443 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 луч ения антиген (по предлагаемому способу) Составитель С.Пылоза

Техред Л.Сердюкова Корректор А,Обручар