Способ титрования вируса иммунодифицита человека

 

Изобретение относится к вирусологии. Целью изобретения является упрощение способа титрования вируса иммунодефицита человека. Указанная цель достигается тем, что проводят заражение вирусом иммунодефицита человека клеточной системы. При этом клеточную систему создают путем культивирования диплоидных клеток человека до стадии монослоя, после чего на него наносят взвесь лимфоидных клеток в концентрации 1,5-2,Ох106 клеток в 1 мл, Титр вируса определяют путем подсчета бляшек на 5-7-е сутки после заражения. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (!9) (! !) (я)э С 12 N 7/00 . 5/00

Ф

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4663726/13 (22) 22.12.88 (46) 07.12.91, Бюл. N. 45 (71) Научно-исследовательский институт вирусных препаратов АМН СССР (72) Л.Г. Степанова, M.Н. Носик и С.С. Маренникова . (53) 578.085.23(088.8) (56) Анджапаридзе О.Г. и др. Культура ткани в вирусологических исследованиях.-M.:

Медгиз, 1962, с. 57 — 90.

Методы культивирования клеток. — Л.:

Наука, 1988, с. 232-290. (54) СПОСОБ ТИТРОВАНИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к вирусологии.

Целью изобретения является упрощение способа титрования вируса иммунодефицита человека (БИЧ).

Пример 1. Культивирование диплоидных клеток эмбриона человека штамма Л-68 проводят по известной методике. На монослой ДКЧ, выращенный в чашках Петри размером 36х10 мм, наносят взвесь лимфоидных клеток линии МТ-4 в количестве 1,5х10 кл/мл, чувствительные к цитопатическому действию ВИЧ, В культуру добавляют среду следующего состава: среда RPMI-1640, 10 сыворотки плодов коровы, 0,06 глутамина и 50 мкг/мл гектамицина. Чашки с культурой помещают в термостат с 5 COz при 37 С; На следующий день питательную среду удаляют, культуру просматривают под микроскопом и отбирают ту. где образовался монослой лимфоидных клеток. (57) Изобретение относится к вирусологии.

Целью изобретения является упрощение способа титрования вируса иммунодефицита человека. Указанная цель достигается тем, что проводят заражение вирусом иммунодефицита человека клеточной системы.

При этом клеточную систему создают путем культивирования диплоидных клеток человека до стадии монослоя, после чего на него наносят взвесь лимфоидных клеток в концентрации 1,5 — 2,0х10 клеток в 1 мл. Титр

6 вируса определяют путем подсчета бляшек на 5 — 7-е сутки после заражения. 4 табл.

На прикрепившихся лимфоидных клетках проводят титрование вируса, используя на каждое разведение по две чашки. Культуру оставляют для адсорбции вируса на 1 ч при 37 С в термостате с 5 С02. Затем жидкость удаляют, клетки промывают средой RPMI-1640 и заливают питательную среду RPMI-1640 с 20 сыворотки плодов коровы, 0,06 глутамина, 50 мкг/мл гектамицина и среду Игла в равных объемах.

Культивирование проводят в термостате при 37 С с 5$ СОг. На 6-е сутки питательная среда удаляется и на монослой клеток наносится 0,1 -ный раствор нейтрального красного в количестве 1 — 2 мл. Чашки с культурой помещают в термостат на 30 мин при 37 С, а затем их просматривают и подсчитывают образовавшиеся бляшки просветления на окрашенном в розовый цвет фоне.

1696474

Ытамм ВИЧ

Титр вируса, 60E/мл

Данные при разведении вируса

1 0-(10-2 10- 3 10-+

10

12х10

HTA-4 нтск v-In/â

HTA-4/1 8

Спл. Спл. Спл. 135

9хl р

7хl р

«I I»

100

88 7 Нет.,l l»

Нет

Таблица2

Титр вируса, 60Е/мл

Культура

Данные при разведении

» ««»

10-1 1Ð-2. 10-3 1Ð-4» «««Ь» Ю

1 5х10

Снл. Спл. 140

/Ъмфоидные клетки, прикрепленные поли-1-лизином

Спл.

° 16

11имфоидные клетки на монослое

ДКЧ-А-65

1,6х10

1 7хlр

136

«I I

lI»,«11»

«II»

«I!»!

17

ДКЧ-Л-68

В табл. 1 представлен протокол титрования ВИЧ трех штаммое на монослойной культуре лимфобластов, Пример 2. Лимфоидные клетки наносят на монослой ДКЧ линии Л-65 или Л-68, Остальные процедуры проводят аналогично примеру 1. В табл. М 2 приводятся данные сравнительного титрова ния ВИЧ íà лимфоидных клетках, прикрепленных на монослое

ДКЧ, и на монослое, сформированном с помощью поли-1=лизина.

Иэ табл, 2 видно, что качество монослойных лимфоидных культур, сформированных на основе ДКЧ с помощью поли-Е-лизина, равноценно.

Пример 3. Лимфоидные клетки культивируют совместно с диплоидными клетками человека для последующего инфицирования ВИЧ. Обоснование концентраций лимфоидных клеток представлено в табл. 3.

Как видно иэ табл. 3, на иболее э фективная концентрация клеток 1,5 — 2х10 /мл.

Кроме того, табл. 3 позволяет установить, что оптимальным сроком сокультивирования лимфоидных и диплоидных клеток является 24 — 48 ч. Сохранение монослоя на более поздних сроках может ухудшить условия репродукции ВИЧ до образования бляшек. Кроме того, культивирование клеток свыше 48 ч не оправдано экономически (дополнительная смена культуральной среды, использование дорогостоящих антибиотиков и др.), Пример 4, Для выбора оптимальных

5 сроков учета бляшкообразования ВИЧ в культуре клеток проводят ряд экспериментов, усредненные результаты которых представлены в табл. 4 (концентрация 1,5—

2х10 кл/мл).

10 Из табл, 4 видно, что оптимальным сроком для учета результатое титрования ВИЧ являются 5 — 7-е сутки, так как на более ранних сроках бляшки не образуются, а начиная с 8-х суток идет лиэис культуры клеток.

Формула изобретения

Способ титрования вируса иммунодефицита человека, включающий создание чувствительной клеточной системы, ее зара20 жение вирусом иммунодефицита человека с последующим определением титра вируса, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, создание чувствительной клеточной системы осуществляют путем

25 культивирования диплоидных клеток человека до стадии монослоя с последующим нанесением на монослой взвеси лимфоидных клеток в концентрации 1,5 — 2х10 клеток

6 в 1 мл, а определение титра вируса осуще30 ствляют путем подсчета бляшек на 5 — 7-е сутки после заражения, Таблица l

1696474 табли ца 3

Данные при времени культивирования, ч

М

72, 96

48

Ионослоя нет Монослоя нет Монослоя нет Ионослоя нет Ионослоя нет

Моно слой

То, же

Монослой

Ион оспой

Ионослой

Монослоя нет

Мои оспой наруюен

Таблиц а 4

Время культивирования, сут.

Наличие бляшек

Лизис клетки

Составитель С. Светлышев

Редактор И. Дербак Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор А. Осауленко

Заказ 4276 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Количество лимфоидных клеток на монослой, кл/мл

0 5""0 7х10

1, 5-2х10

3-5x10

Очень густой

СЛОйуМНОГО плавающих клеток

4

5 б

Очень густой слой, много плавающих клеток

Клетки отпадают, наруаается монослой