Способ обнаружения энтеробактерий в воде

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (д) 5 G 01 N 33/18

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР п(о ргв 4 р

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

0,001-0,01 (21) 4615334/13 (22) 01,12.88 (46) 23.12.91. Бюл. M 47 (71) Кишиневский медицинский институт (72) В,М,Никитин, А.П.Каланча, Ф,И,Георгица, В.M.Ñêóðàòîâ и Л.Б.Загибалова (53) 586(088.8) (56) Корш Jl.Е., Артемова Т.З. Ускоренные методы санитарно-бактериологического исследования воды. М., Медицина, 1978, с.164 — 165. (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ В ВОДЕ

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам обнаружения энтеробактерий в регенерированной воде.

Известны способы ускоренного обнаружения микроорганизмов в жидкостях по их способности редуцировать соли тетразолиев.

Наиболее близким по технической сущности является способ обнаружения кишечных палочек с помощью индикаторных бумажек, пропитанных питательной средой, содержащей мясо-пептонный бульон, лактозу, агар и ТТХ.

Недостатком известного способа является длительность обнаружения кишечных палочек (24 — 48 ч), а такх е его недостаточная чувствительность, Это связано с тем, что в состав среды внесен ТТХ, который при росте оказывает угнетающее действие на рост и размножение микроорганизмов, Кроме того, способ индикаторных бумажек позволяет обнаружить только кишечные палочки, тогда как в воде могут., . Ж,„, 1700468 А1 (57) Изобретение относится к микробиологии, s частности к способам обнаружения энтеробактерий в регененированной воде.

Цель изобретения — ускорение и повышение точности определения. Отобранную пробу воды вносят во флакон с питатгльной средой в виде пленки, содержащей сухой питательный бульон, углевод и индикатор, с последующей инкубацией и обнаружением энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор.

5 табл. находиться и другие представители энтеробактерий, Цель изобретения — ускорение и повышение точности определения энтеробактерий в регенерированной воде.

Поставленная цель достигается тем, что способ осуществляют путем посева отобранной пробы воды во флакон с питательной средой в виде пленки, содержащей сухой питательный бульон, углевод и индикатор, с последующей инкубацией и обнаружением энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор, При этом в сухой питательный бульон дополнительно введены нитрат натрия или калия двухзамещенный, фосфорнокислый натрий, глицерин и дистиллированная вода при следующем соотношении ингредиентов в мас.%:

Сухой питательный бульон 0,014-0,016; нитрат натрия или калия

1700468

Двухзамещенный фосфорнокислый натрий 0,0025-0,0035, Глицерин 0,0015 — 0,0025;

Вода дистиллированная Остальное, В качестве индикатора используют раствор, содержащий реактив Грисса, цинковую пыль и ледяную уксусную кислоту в соотношениях 1,0:0,001:0,25 на 10 мл дистиллированной воды.

Включенный в состав питательно-субстратной пленки нитрат натрия (калия) используют в качестве субстрата, который редуцируется абсолютно всеми энтеробактериями в нитрит натрия (калия) и определяется с помощью индикатора на нитриты по хромогенной реакции. Двухзамещенный фосфорнокислый натрий создает оптимальный рН 7,2 — 7,4 для роста и размножения энтеробактерий при растворении питательно-субстратной пленки в пробе регенерированной воды, которая имеет рН 6,4 — 6,6.

Глицерин совместно с бульоном в сочетании с нитратом натрия (калия) служат питательной основой для энтеробактерий, которая способствует их оптимальному росту и быстрому размножению (табл.1). Кроме того, глицерин совместно с питательным бульоном создает условия для образования пленки и фиксации ее на дне флакона, что способствует сохранности ее питательных качеств и стерильности (табл.2), Для обнаружения нитритов используется индикатор, содержащий реактив Грисса, цинковую пыль и ледяную уксусную кислоту в соотношениях 1,0:0,001;0,25 на 10 мл дистиллированной воды, который является наиболее чувствительным (табл.З).

Все это позволяет повысить чувствительность и ускорить обнаружение энтеробактерий до 6 — 4 ч при концентрациях . 104 — 106 и до 9 ч при концентрациях до 1 — 10 микробных клеток в 1 мл (табл.4).

Способ осуществляют следующим образом.

1. Приготовление питательно-субстратной пленки. Навеску сухого питательного бульона растворяют в дистиллированной воде, добавляют нитрат натрия (калия), двухзамещенный фосфорнокислый натрий и подогревают. Затем полученный раствор питательной основы фильтруют через бумажный фильтр, добавляют глицерин и вносят во флаконы, Затем воду выпаривают, получая питательно-субстратную пленку, фиксированную на дне флакона. Флаконы с пленками закрывают и стерилизуют.

2. Приготовление индикатора на нитриты. Навеску сухого реактива Грисса растворяют в дистиллированной воде, добавляют ледяную уксусную кислоту и цинковую пыль.

Полученный раствор фильтруют и хранят в холодильнике, 3. Обнаружение энтеробактерий. Испытуемую и робу регенерирован ной воды в стерильных условиях вносят во флакон с питательно-субстратной пленкой, инкубируют при 37 С. Для обнаружения нитритов смешивают каплю среды иэ флакона с индикатором на нитриты и определяют их по изменению цвета, что свидетельствует о наличии в воде энтеробактерий.

Пример 1. Методика приготовления питательно-субстрэтной пленки. Навеску питательного сухого бульона в 15 r тщательно размешивают в колбе со 100 мл холодной дистиллированной воды. Кипятят на медленном огне 1 — 2 мин, постоянно помешивая. В полученный раствор вносят 2 г нитрата натрия (калия) и 3 r двухзамещенного фосфорнокислого натрия, постоянно перемешивая до полного растворения. Затем полученный раствор дважды фильтруют через двойной бумажный фильтр, после чего добавляют 2 мл глицерина. Питательная основа имеет вид жидкости темно-коричневого цвета. Далее пипеткой-дозатором переносят по 0,2 мл жидкой питательно-субстратной основы в химически чистые сухие флаконы емкостью 10 мл. Для получения питательно-субстратных пленок выпаривают жидкую часть путем помещения флаконов под струю нагретого до 60 С воздушного потока на 1 ч. После получения пленок светло-коричневого цвета флаконы закры ва ют стерил ьн ыми рези новы ми и робками и стерилизуют.

Флаконы с питательно-субстратными пленками хранят при +4 — 7 С в условиях холодильника и используют для ускоренного обнару>кения энтеробактерий в регенерированной воде.

2, Методика приготовления индикатора на нитриты. В фарфоровую ступку вносят 1 г, cyxora реактива Грисса и тщательно его гомогенизируют пестиком до получения мелкодисперсной пудры, затем приливают

10 мл дистиллированной воды, постоянно перемешивая до полного растворения реактива. После чего раствор переносят в бактериологическую пробирку, к нему приливают

0,25 мл ледяной уксусной кислоты и вносят

0,01 г цинковой пыли, Полученный индикатор фильтруют и хранят в пробирке с плотно закрытой пробкой в холодильнике пыли в темном месте при комнатной температуре, 3. Обнаружение энтеробактерий в регенерированной воде. Для этого используют питательно-субстратные пленки во флако1700468

0,001 — 0,010

Таблица!

Влияние ингредиентов питательно-субстратной пленки на рост и размножение эчтеробактерий

Ингредиенты,входящие в состав питательно-субстратной пленки в пределах граничных значений и результаты обнаружения энфробактерий

1f1f п/и

Варианты состава питательно-субстратной пленки

1- 2 3 4 5

1. Сухой питательный агар

2. Нитрат натрия (калия) 3. Двухзаиещенный <рос@орнокиспый натрий

4. Глицерин

9. Концентрация энтеробактерий в

1 нл через 9 ч инкубации!

09 1О

10 10 10 более

6. Обнаружение энтеробактерий в 1 через 9 ч инкубации нл обна ружеП р и и е ч а н и е. Вода дпя посева содержала 1-10 микробных клеток в 1 нл. нах, приготовленные из ингредиентов в пределах указанных граничных значений (табл.5). Все примеры состава реагента, приведенные в табл.5, выполняют аналогично.

Исследуемую регенерированную воду забирают стерильным шприцем в объеме 1 мл и вносят во флакон с питательно-субстратной пленкой путем прокола резиновой пробки иглой шприца. После легкого встряхивания для полного растворения и равномерного распределения питательной основы, флаконы направляют в термостат при 37 С. Регистрацию результатов проводят через 6 и 9 ч инкубации. Для этого с помощью шприца забирают 0,1 мл индикатора на нитриты и вносят во флакон путем прокола резиновой пробки иглой шприца.

При положительной реакции на нитриты происходит окрашивание содержимого флакона втечение 1 мин в вишнево-красный цвет, а при отрицательной — остается первоначальный цвет (соломенно-желтый). При положительной реакции через 6 ч в 1 мл регенерированной воды до подращивания содержится 105 — 10 микробных клеток в 1 мл, а при положительной реакции через 9 ч—

1 — 100 клеток в 1 мл.

Предлагаемый способ является более быстрым и позволяет повысить чувствительность обнаружения энтеробактерий при наличии единичных микробных клеток в 1 мл регенерированной воды.

Формула изобретения

Способ обнаружения энтеробактерий в воде, предусматривающий посев отобран5 ной пробы воды в питательную среду. содержащую сухой питательны!0 бульон, углевод и индикатор, последующую инкубацию и регистрацию энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор, 10 отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности определения, в сухой питательный бульон дополнительно введены нитрат натрия или калия, двухзамещенный фосфорнокислый натрий, 15 и глицерин и дистиллированная вода при этом ингредиенты взяты в следующем соотношении, мас.$:

Сухой питательный

20 бульон 0,014 — 0,016

Нитрат натрия или калия

Двухзамещенный фосфорнокислый

25 натрий 0,0025 — 0,0035

Глицерин 0,0015 — 0,0025

Вода дистиллированная Остальное, а в качестве индикатора используют рас30 твор, содержащий реактив Грисса, цинковую пыль и ледяную уксусную кислоту в соотношениях 1,0:0,001:0,25 на 10 мл дистиллированной воды.

1700468

Таблица 2 сохранность питательных качеств и стерильности питательно "субст ратной плен ки

»»

Время обнаружения энтеробактерий при кон"I"(" Х j I Г

Интервал наблюдений

Таблица3

Чувствительность и скорость определения энтеробактерий е зависимости от количественных соотношений ингредиентов индикатора на нитриты

Ледяная Результаты обнаружения энтеробактерий и их уксусная концентрации в 1 мл регенерированной воды .:::.:1: .-... .".....". .1 "1 "1"... ". ...Г ....".

0,23 0,23 С С С С С С

0,25 0,25 РП Pfl вП РП РП РП РП

О 27 0 27 С С С С С С С

0,28 0,28 С С

Н при- Реактив мера Грисса

Цинк бе а я пыль абс.

1. 0,07 0,07

2. 0,08 0 ° 08

3, 1,О 1,0

4. 1 2 1>2

5. 1 3 1,3

0,007 0,007

0,008 0,008

0>001 0,001

0,012 0,012

0,013 0,013

П р и и е ч а н и е. Регистрация результатов обнаружения энтеробактерий проводилась через 9 ч инкубации при 37 С вЂ” реакция отрицательная; нСи — реакция сомнительная;

»РПн - реакция резко положительная .

Т а бл и ц а 4

Скорость и чувствительность обнаружения энтеробактерий предлагаемын и изаестнын способом

Энтеробактерии

Концентрация энтеробактерий в 1 мл воды

Н пlп

Известным способом

10 1ОВ

1. Entегоbacter 298

2. Entегоbacter 447

3. Citrobacter 20

4. Citrobacter 117

5. Е. coli 088

6. P vulgaria 969

7. P,>nirabillis 234

8. Providencia 93/54

S.ariaonae 16159

+ +

+ +

+ + +

+ + +

+ 4 +

+ +

+ +

+ +

+ + +

+ + +

+ б +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + + при 10 и более

+ ь Еыявлена

+ +

+ +

+ +

+ ь

+ +

+ +

+ б

+ + +

П р и м е ч е н и е. 0 предлагаемом способе энтеробактерии в концентрациях 10 " 1О обнару4 4 живались через 6-4 и, а в концентрациях 1-100 - через 9 ч инкубации при 37 С.

0 известном способе обнаруживались только Е.coli в концентрациях 10 н более при инкубации в течение 24 ч..

1 МЕСЯЦ

3 месяца

6 месяцев

1 ГОД

1 год бмесяцев

2 года

+

1700468

+ + + о а m

Э

I- tC т X

A "У

Щ сс а

X 1Z Z

Э Э

» т ао сО

LO Х о х

Б X

IсО >х

I- X а

Э

» Iсб) (D m с! Io

Э л о с

Ц

+++

CL

>.5

X а

Э сО о

IZ (D

X а

Э

CL

Z

>т

Cl

Э

IХ

>Q о о а

Q)

1т

X а

Э

Ц

Z

Э

2 о

1о о о х

Z

Э

1о

Э г

Ц

К

?

Э

» о. (g

Ю о

1о о

Cl о

Y о

Y т

Э с с

1 I

I 1

I I

I Qxo I

1 !

l 1

1 I

1 1

1 ° 1 о! о

1 Ф 1

>т о

Iсс!

v

1 о

Z с

Э

IIQ

Is с сГ\

С> е

Ю Ю

Ю Q л °

О O

1

I

I оo P

1

1 ,> о

1 со

I б!!

Iо

1о о о

Z с

Ф! гл

1- tl

m x

С

Ig

1- Y

fg а

I- К

X X

Х Cl с.с\

Ю е—

D O

С> О л л

О Ю о

X о

1Z

Iо

I I

1 1

1 Ое 1

1 1

1 I

1 ° I о

1 !0 1

I Ig I

X а сц

C CL

Ф

k X б

Iw I

I Ю I

1 ° I !

I I ! М

Ti I Ю I

Ц 1 е- 1

О I — — I сп 1 1

1 сс> 1

>X О о

Z Й ! ! ь со

О 1

CL — — 4

X.1 I

CL 1 Iс> 1

Э I Ю I

1 е 1

Э I I

1 I 1

Э I а 1сС>

Ю

С I

1 1

1 1

I о о

5 !

1 I

1 ъ 1 о

I !О

1 Ф 1

>т >5

z o

Э X

Ы Y

Э O>s

Z X с!1 аа

Ig O1xe Ф

»o z

m o

1 >Х

s л с z .с> Z.

>s со о э х 1- с

»сО» с.) I- !О! + + +

I + + + +

LA LA — — сч сч м

Q OOOO

D D D D Ю

A A е е

QОOЮO

LA LA

- cv cv м

О О О О О

DOOOO л л л ° л

ОЮОЮЮ

М\ lA сч сч м м-з.

О О О О О

О О O O O л л л л л

ООООО с>\ сс1

cv cv м м\

OOOОО

O O Q O Q л ° л °

О О О О О

LA

o — сч

ОЮО

° л

ЮЮО

LA

О -СЧ

ООО

° л л

ОЮЮ

D О D О О л л л л л

OOOQQ м«г сл О

D D D С:> D л л л л

О О О О О

° е ° ° ° сч м-з N

1

I

1

I

1

1

1 (I

I

I

l

1

1

I

I !

1

1

1

I

I ! !

I

1

1

I

1

I

1

I

1 !

1

IQ о о а

Э

1Z сб!

К

Z

Э

» а

I0 о

О сэ

1-о

m л м с

» а

Ig C

Э

CL X

К

=т 10

»

Cl

1- Z о s

I 3

Ф а а

Ф

Z (Q

Э

X а