Способ получения каллуса кукурузы

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры тканей и клеток, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности гибридов и исходных форм кукурузы, обладающих хозяйственно ценными признаками. Целью изобретения является повышение выхода змбриогенного каллуса. Способ состоит в том, что незрелые зародыши кукурузы культивируют на питательной среде Мурасиге- Скуга при температуре 29-32°С, при этом в среду дополнительно вносят Дикамбу, Пиклррам и 2,4-Д, 6 табл.

союз советских социмистическихРЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ пРи гкнт сссР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4771942/13 (22) 20.12.89 (46) 30.12.91. Бюл, N. 48 (71) Институт молекулярной биологии и биохимии им. M.A.Aéòõîæèèà (72) Л.Р.Сайб и M.Ê.Êàðàáàåâ (53) 578,085.23 (088.8) (56) Armstrong СЛ. et. al: Achievement and

maintenance of friable embryogenlc callus of

maize and moolvement of 1 — ргоИпе, — Р! апта, 1985, 6, ч. 64, N. 2, р. 207-214. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЛУСА КУКУРУЗЫ

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм кукурузы, обладающих хозяйственно ценными признаками.

Целью изобретения является повышение выхода эмбриогенного каллуса.

Способ состоит в mM, что эксплантаты культивируют при повышенной температуре(29 — 32 С) на питательной среде Мурасиге и Скуга, в которую совместно добавляют три ауксина в определенных концентрациях:

Дикамбу, Пиклорам и 2,4-Д (по 0,1-0,5 мг/л).

При совместном их внесении эмбриогенные каллусы образуются со значительно большей частотой, чем когда ауксины добавляются по отдельности.,, А2„„1701197 А1 (я)я А 01 Н 4/00, С 12 N 5/04 (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры тканей и клеток, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности гибридов и исходных форм кукурузы, обладающих хозяйственно ценными признаками. Целью изобретения является повышение выхода змбриогенного каллуса. Способ состоит в том, что незрелые зародыши кукурузы культивируют на питательной среде МурасигеСкуга при температуре 29 — 32 С, при этом в среду дополнительно вносят Дикамбу, Пиклррам и 2,4-Д. 6 табл.

Способ осуществляегся следующим образом.

В качестве зксплантатов используют незрелые зародыши кукурузы сорта Шиндельмайзер, линий ИК 226-ТВ, А 554, размером

1,5-2,5 мм(15-20дней после опыления). Незрелые семена поверхностно стерилизуют в

0,1 -ном растворе сулемы, после промывки из них вычленяют незрелые зародыши и Bbtсаживают щитком вверх на среду с минеральными солями по Мурасиге и Скугу (в основном варианте) с 30 г/л сахарозы, 1 мг/л тиамина, 1 мг/л пиродаксина, 1 мг/л никотиновой кислоть, 100 мг/л мезоинозита, 500 мг/л пролина, 100 мг/л гидролизата казеина.0,8 агара, 0,1 — 0,5 мг/л 2,4-Д, 0,1—

0,5 мг/л Пиклорама, 0,1-0,5 мг/л Дикамбы, рН среды доводят до 5,8. Культивируют в темноте при 29 — 32 С в течение трех недель.

Затем сформировавшиеся каллусы пассиру1701197 ют на свежую питательную среду каждые

2-3 недели. Для регенерации растений сформировавшиеся змбриогенные каллусы переносят на среду с 0,1 мгl л 2,4-Д, 0,1 мг/л

Дикамбы, 0,1 мг/л Пиклорама, 50 мг/л триптофана, 5 мг/л аденина и культивируют на свету при 26 -1ОС при 16-часовом фотопериоде.

Пример 1. Влияние температуры культивирования на выход эмбриогенного каллуса.

Изучают влияние температуры культивирования незрелых зародышей на выход змбриогенного каллуса кукурузы (линия В73), Для этого незрелые зародыши высаживают на среду МС с 1 мг/л 2,4-Д и культивируют: а) при температуре 26 1 С; б)притемпературе29 +1оС a) при32 1оС г) при 35 1ОС.

Через 3 недели определяют выход эмбриогенного каллуса. Культивирование при температуре 32 +I C увеличивает выход эмбриогенного каллуса в несколько раз (табл.

1).

Все далее описываемые опыты проводят при температуре 32 21 С.

Пример 2. Влияние минеральных солей на выход эмбриогенного каллуса кукурузы.

Для культивирования тканей кукурузы используют самые разнообразные среды, В связи с этим требуется выяснить, какая из наиболее часто употребляемых сред является наилучшей для образования эмбриогенных каллусов кукурузы из незрелых зародышей. Изучают влияние солей по Мурасиге и Скугу(МС), Гамборга (85), Чу-Вонга (М6) и Нича на частоту образования эмбриогенных каллусов из различных генотипов.

Результаты отражены в табл. 2, Эмбриогенные каллусы образуются с самой высокой частотой на среде Мурасиге и Скуга для всех генотипов. В связи с этим все дальнейшие опыты проводят на среде

Мурасиге и Скуга.

Пример 3. Влияние фитогормонов на выход эмбриогенного каллуса.

Далее исследуют влияние различных ауксинов (2,4-Д, Пиклорама, Дикамбы) и их комбинаций на образование эмбриогенного каллуса. Для этого готовят среду Мурасиге и Скуга в четырех вариантах; с 1 мл/л

Пиклорама (среда П), с 1 мг/л 2,4-Д (среда

Д), с 1 мг/л Дикамбы (среда Ди), и в четвертую среду вносят по 0,33 мг/л каждого фитогормона (среда ПДДи), Частота образования эмбриогенного каллуса является наиболее высокой на среде ПДДи для всех генотипов (табл. 3).

На других средах частота образования эмбриогенного каллуса различная для раз5 ных генотипов, причем характер действия фитогормонов различается для каждого генотипа. Так, для сорта Шиндельмайзер среды по способности образо вы вать эмбриогенный каллус можно расположить в

10 ряд: ПДДи >Д > П - Ди, для линии А 554:

ПДДи >Ди >П >Д,адлялинии 873: ПДДи>

>П >Ди = Д. Таким образом, обнаружен факт стимуляции образования эмбриогенного каллуса при совместном внесении в

15 среду культивирования трех фитогормонав:

Пиклорама, 2,4-Д и Дикамбы.

Пример 4. Подбор оптимальной концентрации фитогормонов для образования эмбриогенного каллуса кукурузы.

Далее требуется выяснить, какая кон20 центрация фитогормонов является оптимальной для каллусообразования, Для этого в среду МС вносят Пиклорам, 2,4-Д, Дикамбу в следующих концентрациях: по 0,1 мг/л каждого фитогормона (среда 0,1 ПДДи), по

25 0,3 мг/л каждого фитогормона (среда 0,3

ПДДи), по 0,5 мг/л каждого ауксина (среда

0,5 ПДДи), по 1 мг/л (1 ПДДи) и по 2 мг/л каждого фитогормона (среда 2 ПДДи). В качестве контроля используют среду MC с 1

ЗО мг/л 2,4-Д (среда Д), Частота образования эмбриогенных каллусов является максимальной (генотип — линия А 554) на среде 0,3

ПДДи, на средах 0,1 ПДДи и 0,5 ПДДи превышает контроль, а на средах 1 ПДДи и 2

35 ПДДи ниже, чем в контроле (табл. 4).

Таким образом, оптимум наблюдается при добавлении О,З мг/л каждого фитогормона. Граничными концентрациями предлагаемого способа будут концентрации

40 каждого фитогормона в 0,1 — 0,5 мг/л, поскольку при этих концентрациях выход эмбриогенного каллуса выше, чем в контроле.

Пример 5. Регенерация растений из эмбриогенных каллусов кукурузы.

45 Для регенерации растений эмбриогенные каллусы кукурузы переносят на среду

MC с 0,1 мг/л Пиклорама, 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л Дикамбы, 50 мг/л триптофана, 5 мл/л аденина и далее их культивируют на свету

50 при 26. +-1 С при 16-часовом фотопериоде.

Через две недели наблюдают регенерацию побегов. Определяют процент каллусов с регенерацией и количество побегов на каллус (табл. 5).

55 Таким образом, из эмбриогенных каллусов, полученных предлагаемым способом, возможна регенерация растений с высокой частотой.

1701197

Таблица 1

Влияние температуры культивирования на выход эмбриогенного каллуса

Таблица

Влияние минеральных солей на процент формирования эмбриогенного каллуса из незрелых зародышей для разных генотипов

Таблица 3

Влияние фитогормонов на процент образования эмбриогенного каллуса из незрелых зародышей для разных генотипов

Приведенные данные показывают, что использование способа позволяет увеличить выход эмбриогенного каллуса до 90 (34 в прототипе), причем эффект увеличения выхода наблюдается у различных генотипов. 5

Перечень компонентов среды, использовавшихся в осуществлении предлагаемого способа.

Состав питательной среды, мг/л:

NH4N03 1650 10

КЙОз 1900

СаОг 2НгО 440

MgS04 -7H20 370

КНгР04 170

Маг Е РТА .2НгО 37,3 15

FeSO4 7НгО 27,8

НзВОз 6,2

MnSO4 4НгО 22,3

ZnSO4 7НгО 86

KJ 0,83 20

Na2Mo04 2НгО 0,26

CuS04 5НгО 0,025

СоСЬ 6НгО 0,025

Сахароза 30000

Пролин 500

Мезоинозит 100,0

Никотиновая кислота 0,5

Пиридоксин HCI 1,0

Тиамин HCI 1,0

Агар 7000 рН 5,8

Гормоны (табл. 6)

Формула изобретения

Способ получения каллуса кукурузы, включающий эксплантацию незрелых зародышей на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга и последующее культивирование, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода эмбриогенного каллуса, зародыши эксплантируют на питательную среду, дополнительно содержащую

0,1-0,5 мг/л натриевой соли дихлорфенилуксусной кислоты, 0,1-0,5 мг/л Пиклорама и 0,1-0,5 мг/л Дикамбы, и культивирование проводят при 29-32 С.

Таблица 4

Влияние концентраций фитогормонов на выход эмбриогенного каллуса кукурузы линии А 554

Таблица 5

Регенерация растений из полуяенного по данному способу эмбриогенного каллуса

Таблица 6

Гормоны, необходимые для осуществления способа

Составитель В.Демкин

Техред M,Моргентал Корректор Л.Патай

Редактор Л.Павлова

Производственно-издательский комбинат ",Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4485 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035„Москва, Ж-35. Раушская наб„4/5