Способ очистки нуклеазы из проростков ячменя

 

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано для ферментативного синтеза нуклеозпдтрифосфатов. меченных фосфором -32(33) в «-положении фосфатной группы. Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта, свободного от примесных АТ-фазной, 5 -нуклеотидазной и неспецифической фосфатазной активностей. Способ заключается в том, что проростки ячменя 4- 6 дней гомогенизируют, экстрагируют, фракционируют экстракт сульфатом аммония 40- 80%, суспензию прогревают 15 мин при 60°С. хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе и силохроме 50/80 красно-коричневом 2К. Выход по активности 33%, степень очистки - 426 раз. 1 з.п. ф-лы., 6 ил., 5 табл. ё

r cicз ссuе скиx

СО(,ИАЛИСТИЧГС,VIX

РГ С !УБЛИК

rsIIs С 12 N 9/22

i ОСУДЯРСТВЕННЫ11 КОМИТЕ!

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

Г!РИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4728025/13 (22) 07.08,89 (4 6) 07. 01. 92. Б ю л. M 1 (71) Ленинградский государственный университет (72) А.В.Козлов, Л.Б.Ковалева и Ф.В.Мячин (53) 577.15.07 (088.8) (56) 1. Sung S.Ñ., Laskowski М.S. А nuclease

from bean sprouts.— Journal of Biological

Chemistry, 1962. v. 237, N 2, р. 506-511.

2, Prentice N.. Heisel S. Characterization

of nuclease from Barley Shoots.—

Phytochemistry. 1986. ч, 25, N 9. р, 20572062. (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ НУКЛЕАЗЫ ИЗ

ПРОРОСТКОВ ЯЧМЕНЯ

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано для ферментативного синтеза нуклеозидтрифосфатов, меченных фосфором-32(33) в

rz -положении фосфатной группы, Известен способ получения нуклеазы. базирующийся на традиционных приемах очистки — фракционирование солями. гель:, ильтрация. ионообменная хрол атография (1).

Способ не позволяет получать препараты, отвечающие требованиям в отношении примесных активностей. так как не содержат надежного этапа их устранения (особенно АТФ-аз).

Наиболее близким является способ очистки нуклеазы из проростков ячменя (2).

Способ включает четыре стадии очистки: сульфатаммонийное осаждение белков в интервале 40--80% насыщения. ионообмен„„,Я „„1703688 А1 (57) Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано для ферментативного синтеза нуклеозидтрифосфатов, меченных фосфором -32(33) в

ñt-положении фосфатной группы, Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта, свободного от примесных

AT-фазной, 5 -нуклеотидаэной и неспецифической фосфатазной активностей. Способ заключается в том, что проростки ячменя 46 дней гомогенизируют, экстрагируют, фракционируют экстракт сульфатом аммония 4080%, суспензию прогревают 15 мин при

60 С. хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе и силохроме 50/80 красно-коричневом

2К. Выход по активности 33%, степень очистки — 426 раз. 1 э.п. ф-лы., 6 ил., 5 табл. ную хроматографию на ДЕАЕ-трис-акриле

М при рН 8,0, гельфильтрацию ía G-75, афинную хроматографию на АМФ-сефярозе.

К недостаткам известного способа относятся низкий выход очищенного продукта— не более 1 %, нецелесообразность применения афинного сорбента АМФ-сефарозы для крупномасштабной очистки нуклеэзы ввиду малой емкости и нестабильности сорбента. отсутствие характеристики энзимологической чистоты препарата нуклеаза.

Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта, свободного от примесных AT-фазной, 5 -нуклеотидазной и неспецифической фосфатазной активностей.

Согласно способу очистки нуклеазы из проростков ячменя, включающему гомо1703688 генизацию сырья, сульфатаммонийное осаждение белков, ионообменную хроматографию при рН 8,0, в качестве сырья используют 4-6-дневные проростки ячменя, гомогенат из сырья подвергают очистке путем сульфатаммонийного осаждения белков в интервале 40-807, насыщения с последующим нагревом суспензии до 60 -1 С в течение 15 мин, после чего проводят хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией ферментов раствором 0,1 M NaCI u псевдоафинную хроматографию на силохроме 50/80 красно-коричневом 2К при рН

8,0 с предварительной элюцией примесных белков раствором 0,1 М NaCI и элюцией нуклеазы раствором 0,5 М NaCI.

На фиг.1 показана динамика изменения активности целевого и примесных ферментов в зависимости от возраста (максимальная 3-нуклеотидазная активность обнаружена в 4-6-дневных проростках, а не в 6 — 7-дневных, как в известном способе); на фиг.2 — устойчивость нуклеазы к нагреванию до 60 С в течение 15 мин (при тепловой обработке происходит частичная инактивЭция примесных дефосфорилирующих ферментов 5 -нуклеотидазы и АТФ-аэы (до

60-70 ), отсюда целесообразность введения этого этапа в процедуру очистки); на фиг.З вЂ” профиль элюции белков с ДЕАЕцеллюлозы (рН 8,0) при осуществлении ступенчатой элюции раствором 0,1 М NaCI (на этом этапе происходит дополнительная очистки фермента в 4,1 раза, однако примесные дефосфорилирующие ферменты не отделяются от целевого фермента), на фиг.4 — профиль элюции белков при рН 8,0 с псевдоаффинного сорбента силохром

50/80 красно-коричневый 2К при осуществлении ступенчатой элюции примесных белков раствором 0,1 М NaCI и элюции нуклеазы с 3 -нуклеотидазной активностью раствором 0,5 M NaCI (в этих условиях проведения хроматографии неспецифичная фосфатаза и 5 -нуклеотидаза не адсорбиру-! ется, АТФ-аза связывается слабо и полностью элюируется с 0,1 М NaCI, тогда как нуклеаза связывается прочно и элюируется с 0,5 М NaCI); на фиг.5 — оптимум рН 3 -нуклеотидазной активности (рН 8,2); на фиг.б— диаграмма, поясняющая предлагаемый способ.

Пороговые концентрации растворов

NaC$, примененных при хроматографии на

ДЕАЕ-целлюлозе и силохроме красно-коричневом 2К, а также рН буфера при хроматографии на силохроме красно-коричневом

2К, подобраны экспериментально.

Схема процедуры очистки нуклеазы

Гомогенизация растительного материала

Ч

Экстракция белков буфером

Осаждение белков сульфатом аммония (40 — 80 насыщения)

Ч

Тепловая обработка (60 С, 15 мин) (Хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе, рН 8,0

15

0,1 М NaCI

Хроматография на силохроме красно-коричневом, рН 8,0 сс — —. неадсорбиро- 0,5MNaCI 0,1MNaCI ванные белки

20 l 1 нуклеаза с АТФ-аза

3 -нуклеотидазной активностью

М неспецифичная фосфатаза, 25 5 -нуклеотидаза, часть АТФ-азной активности

30 Концентрирование (диализ и ротив

50 -ного глицерина)

Пример 1. Все этапы очистки, кроме тепловой обработки и хроматографии на си35 лохроме с иммобилизованным красителем, проводят при 0-4 С.

Результаты выделения и очистки по этапам сведены в табл. 1, где показаны данные очистки нуклеазы с 3 -нуклеотидазной

40 активностью из 75 г проростков ячменя.

Этап 1. Получение исходного экстракта.

Зерновки ячменя (сорт "Пиркка") проращивают в кюветах 20 х 30 см на деионизованной воде в темноте при 20 С.

45 4 — 6-суточные проростки отделяют от семени и корней, растирают в ступке или гомогенизируют в ножевом гомогенизаторе с

0,1 M трис-HCI буфером, рН 6,5. Гомогенат ставят на качалку на 1 ч для полноты экст50 ракции фермента, после чего центрифугируют 1 ч при 8000 g. осадок отделяют, а супернатант фильтруют через М1гасЬсй.

Концентрация белка в исходном экстракте

20 — 30 мг/мл.

55 Этап 2. Осаждение белков сульфагом аммония.

К исходному энзимологическому экстракту медленно при непрерывном помешивании добавляют кристаллический сульфат аммония до 40ф, насыщения (243 г/л). Оса1 70."<<Я8

Л Еб6о 14.6 100 с 31

55 док, сформироеаешийся в течение 1 ч, отделяют центрифугированием при 100GO g

30 м«н. Осадок о<брась<еают. супернатант насыщают сульфатом аммония до 80% (561 г/л). Оставляют на 2 ч для формирования осадка.

Этап 3. Тепловая обрабогка.

Суспензио белков 40-80 насыщения сульфатом аммония подвергают нагреву до

60 С в течение 15 мин, после чего охлаждают в ледяной бане 20-30 мин. Суспензию центрифугируют в том же режиме. Осадок растворяют в 50 мМ трис-HCI буфере, рН 8,0 и подвергают диализу против 1 л этого же буфера с трехкратной заменой буфера.

Этап 4. Хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе.

Обессоленный растеор белка наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой (2,5 х 18 см). уравновешенной 50 мМ трис-HCI буфером. при скорости 25 мл/ч. После нанесения белка и промывки колонки буфером (100 мл) подают раствор 0.1 М NaCI для элюции фермента с 3 -нуклеотидаэной активностью (фиг.3). Фракции с 3 -нуклеотидазной активностью объединяют и диализуют против 1 л

50 мМ трис-HCI буфера, рН 8,0.

Этап 5. Хроматография на силохроме

50/80 красно-коричневом 2К.

Отдиализованный раствор белка наносят на небольшую колонку (2 х б см) с силохромом красно-коричневым, уравновешенным 50 мМ трис-НС1 буфером, рН 8,0, при 20 С, после чего колонку промывают

20 мл того же буфера для удаления неспецифичной фосфатазы и 5 -нуклеотидазы. Примесные белки с АТФ-азной активностью устраняют раствором 0,1 М NaCI (20 мл), нуклеазу с 3 -нуклеотидаэной активностью элюируют 20 мл 05 М раствора NaCI. Скорость элюции 40 — 50 мл/ч.

Этап 6. Концентрирование.

Обьединение фракции с 3-нуклеотидазной активностью диализуют против 500 -ного раствора глицерина, приготовленного на

50 мМ Na-ацетатном буфере рН 6 0 и хранят при — 10-20 С.

Определение активности ферментов.

Определение 3 -нуклеотидазной активности нуклеазы.

3 -Нуклеотидазную активность определяют по колориметрическому методу. 3а единицу активности принимают количество

Рн в микромолях, освобожденного за одну минуту гидролиза 3 АМФ при 37 С.

Метод определения следующий: в пробирку для л икропроб объемом 1,5 см помещают 50 мкл исследуемого образца белка, 100 мкл раствора 3 АМФ концентрации 7,5 мМ, 300 мкл буферного раствора—

50 мМ TEA HCI — NaOH. рН 8.0: г роб, <о бируют 30 мин при 37"С. Ре":i.«.<ю с;.:«:<ã.л и е а ю т добавлен .< å < 5 0 r- к,-. х;; о -р < о < . кислоты (9 н.). Иэ аналитическ,;.; г; об рск отбирают по 100 мкл раствора

G,4 мл 1 М ацетата натрия, татного буфера, рН 4, 0,4 мл г .,—, 1 -ного раствора аскорбиновой кислоты. приготовленного на 1 мМ раствора сернокислой меди. Оставляют смесь на 10 л<«н после чего добавляют 0,2 мл 1%-ного раствора молибдата аммония. приготовлен ого на 0,05 н. H2S04. Через 10 мин замеряют поглощенные пробы на спектрофотсметре при длине волны 660 нм. Расчет актиенссти производят по формуле где Л Елово — разность поглощения при i. =

= 660 нм между опытным образцом и контролем (проба беэ белка);

14,6 — коэффициент пересчета единиц поглощения, мкг Рн (определяемый по калибровке); с — время инкубации (30 мин);

31 — атомная масса P.

Определение активностей примеснь< дефосфорилирующих ферментов.

Определение активностей неспециф. чной фосфатазы, 5 -нуклеотидазы и АТФ-аэы проводят аналогичным образом, используя в качестве субстратов соответственно

j3-гл ицерофосфат, 5 АМ Ф, AT Ф. П ри вь< я влении фосфатазной активности с Р-глицерофосфатом применяют 50 мМ имидазольный буфер, рН 6,5.

Пример 2. Выбор условий тепловой обработки.

Известно, что нуклеаза ячменя термостабильна при t = 60 С. Экспериментально показано (фиг.2), что при этой температуре происходит инактивация примесных дефосфорилирующих ферментов: 5 -нуклеотидазы

60 . АТФ-азы 70 . Поэтому целесообразно проведение при очистке целевого ферл ента тепловой обработки при 60 :1 С (погрешность термометра). Длительность прогрева подбирают экспериментально.

Наибольшее падение активности 5 -нуллеотидазы и АТФ-аэы происходит за первые

15 мин нагрева при 60 С (фиг.2). При более длительном воздействии прил<есные активности остаются на прежнем уровн, е то время как 3 -нуклеотидазная актиенссть снижается, Исходя из полученных данных. длительность прогрева выбрана 15 мин.

1703688

Пример 3. Подбор концентрации NaCI для ступенчатой десорбции нуклеазы с

ДЕАЕ-целлюлозы.

Процедура выполнения до этапа 4 аналогична примеру 1, после чего осуществляют в аналитическом варианте десорбцию целевого фермента в градиенте NaCI 0-0,2 M (150+ 150 мл) и определяют среднеарифметическое со среднеквадратичной ошибкой концентрации NaCI (фиг.б, срединная точка переднего фронта элюции).

B табл. 2 показаны срединные точки переднего фронта элюции нуклеазы в M

NaС! при хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе в градиенте NaCI (0-0,2) М, Как видно из табл. 2, концентрация

NaCI, необходимая для десорбции нуклеазы,о 110,01 М.

Пример 4. Подбор рН буферного раствора и концентрации NaCIдля проведения хроматографии на силохроме краснокоричневом, Процедура выполнения до этапа 5 аналогична примеру 1, после чего устанавливают интервал рН буфера для эффективной сорбции нуклеазы на силохроме при слабой сорбции дефосфорилирующих ферментов.

В табл. 3 представлены данные сорбции нуклеазы с 3 -нуклеотидазной активностью и примесных ферментов на силохроме красно-коричневом при разных рН.

Как видно из табл. 3, оптимальным значением рН является 8,0, так как несмотря на незначительную потерю активности при сорбции (порядка 10-",ь) при этом рН резко ослаблено связывание примесных ферментов по сравнению с рН 6,0. При рН 9,0 рассматриваемые белки не адсорбируются.

Выбор концентрации NaCI для ступенчатой адсорбции примесного и целевого ферментов определяется эффективностью десорбции при рН8,0.

В табл. 4 показана десорбция нуклеазы и примесных ферментов с силохрома красно-коричневого при различных концентрациях Na CI (р Н 8,0).

Как видно из табл. 4, при концентрации

0,1 M NaCI происходит десорбция оставшейся АТФ-азы и других белков, в то время как нуклеаза остается связанной с сорбентом. Десорбция целевого фермента начинается с концентрации 0,3 М NaCI u достигает максимальной эффективности с

0,5 М NaCI, Методика испытаний препарата.

Нуклеазу из пооростков ячменя применяют в синтезе (5 - P) dAMcD и (5 P) АМФ на стадии перехода метки из (y- 33P) АТФ в

35 (a — P) (d) АМФ: (у — P) АТФ + 3 (d) АМФ полинуклеотид/киназа 3 — (5 — Р)(0)АДФ; (3, 5 — P)(d) АДФ нуклеаза/ячменя (5Р)(б) АМФ + Фн.

Гидролиз 3 -фосфатной связи осуществляют как с очищенным после первой р . акции меченым продуктом (дифосфатом), так и в сквозном синтезе беэ предварительной очистки дифосфата. Существенно. что в обоих вариантах синтеза (а - Р)(4) АМФ рН реакционной среды 7,0-7,5.

Реакцию проводят с 0,2 Е нуклеазы в течение 30 мин при 37 С; загрузка по радиоактивности составляет 45 мКи (y- Р) АТФ, зз

Переход метки иэ (3,5 - P)-дифосфата в (5 - P)-монофосфат составляет более 907,, что рассчитывают по соотношению площадей пиков на хроматограмме HPLC.

Специфичность нуклеазы из ячменя к 3

-субстратам.

Исследована субстратная специфич( ность нуклеаэы по отношению к 3 -нуклеозид-моно- и дифосфатам рибо- и дезоксириборяда.

В табл. 5 приведены относительные активности (с 3 АМФ-100 ), проявляемые в области рН 7,0-8,5 (субстратная специфичность нуклеаэы из проростков ячменя), Из табл, 5 видно, что нуклеаза иэ ячменя проявляет 3 -нуклеотидаэную активность и по отношению к 3 -субстратам дезокси-ряда, в том числе к 3 ТМФ и 3, 5 ТДФ, однако скорость гидролиза приблизительно в 100 раэ меньше, чем с 3 -рибонуклеотидами. Оптимум рН для рибонуклеотидов находится в области рН 8,0-8,5, для дезоксирибонуклеотидов — около 7,0.

Формула изобретения

1, Способ очистки нуклеазы из проростков ячменя, включающий гомогенизацию сырья, экстракцию гомогената, фракционирование экстракта сульфатом аммония в интервале концентраций 40-80 насыщения, ионообменную хроматографию на носителе, содержащем диэтиламиноэтильные группы, и хроматографическую очистку, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, своt бодного от примесных AT-фазной, 5-нуклеотидазной и неспецифической фосфатазной активностей, суспенэию белков после фракционирования сульфатом аммония подвергают термообработке при 60 =1 С в течение

15 мин, ионообменную хроматографию проводят на ДЭАЭ-целлюлозе при рН 8,0 с элюцией фермента 0,1 М NaCI, после чего проводят псевдоаффинную хроматографию на силохроме 50/80 красно-коричневом 2К

1703688 при рН 8,0с предварительной элюцией примесных белков раствором 0,1 М NaCI и элюцией целевого продукта 0.5 М NaCI.

Таблица 1

3 -нуклеотидазная активность

Примесные активно сти

Этап очистки

АТФ- Несп аза циф1

; фосфв5 -нуклеотидаза

Амд, Е/мл

Тдзд

0,701

1 !

18

81,8

2,82

0,403 93

7,0

22

0,296

0,175 50,8

68 0,045

1.7

7,5 по выяел. не вы0,522

0,05 28,2

10,4

<0,01

414 явл.

1,6

0,15 28,0

10,7 33

426 <0,001

<0,03 <0,0

Таблица 2

Таблица 3

Исходный экстракт

Осаждение сульфатом аммония (4080 $) и прогрев при 60 С

Хроматография на ДЕАЕцеллюлозе

Хроматография на краснокоричневом силохроме

Концентрирование диализом против

50%-ного глие ина

2. Способ по и 1, о тл и ч а ю щи и с я тем, что, в качестве источника фермента используют 4-6-суточные проростки ячменя.

1703688

Таблица 4

Таблица 5 ти

3 - -.лес-.щеза

А Ж-аз а

А> "/" ск;ого веса

5 - х-.ест деза весле;лж.гл фос, аза

I2 г ъ ч т г ъ т

3 4 5 6 7 8 9 IO П 12 I3 I4

1703688

3 -К -., 0Л.". В

A .. -ьза с 3 -, „ -,н----г. .л:-. я 0",,абаза

:5

Дчл щьнОсть п ОГ ЭВа

rrpa 60 С, кн

«-гг. 2

0II280

Риг .3

IS 20

240 З00

04Ъеп ка ii, <

1703688

0.1

О,i0

0,05

Жг. 4 ао

50! — j " t. 3 . г " = Э 3 —, -; - А.. -. за

-noh," = О . ю а = ь

I наслэ . 1дънъя уф&таЗЬ

Обьем злю=та щ рЦ

1703688

Редактор И. Шулла

Заказ 40 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва. Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

ОЛ22

5 IGO I25 I50 75 съем элзитй 03

Составитель А. Семенов

Техред М.Моргентал Корректор Т. Малец