Штамм бактерий bacillus cereus - продуцент эндонуклеазы все 751 1

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИК (g1)g С 12 И 9/22 1/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4495837/13 (22) 20.10„88 (46) 30.04.91. Бюл. К 16 (71) Всесоюэньш научно-исследовательский институт прикладной микробиологии и Институт микробиологии и вирусологии

АН УССР (72) В.В. Смирнов, С.P. Резник, И.В. Сорокулова, В.И„ Крамаров, В.В. Смолянинон и Н.,И. Иатвиенко (53) 577.15(080„8) (56) Pioberts R.I. restriction enzymes

and their isoshisomers. 11и<.1., Ас ids.

Pes. v. 16, Sequens e Suppl. р. 271—

313, 1988. (54) LIT%BI БаКТЕРИ11 BACILLUS CEREUS—

ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ВСЕ 751 1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии., Целью

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии и представляет собой штамм, продуцируюций эндонукпеазу Все 751 1, используемую как инструмент для получения фрагментов ДНК, картирования молекул ДНК и конструирования векторных молекул

ДНК.

До настояцего времени не обнаружено среди вида Bacillus cereus штамма, продуцируюцего эндонуклеазу, способную узнавать на ДНК последовательность 5 ...ССАТСС...З .

Цель изобретения — получение штамма В. cereus ВКПИ В-4246 (751 1), про дуцируюцего сайт-специфическую эндонуклеазу Все 751 1, способную узнавать

„„SU„„1645299 А 1

2 изобретения является получение штамма

В. cereus ВКП?1 В-4246 (751 1), продуцируюцего сайт-специфическую эндонуклеазу Все 751 1, способную узнавать на ДНК последовательность нуклеотидов 5 ...GGATCC...З . Для получения биомассы культуру засевают в колбу объемом 3 л, содержащую 700 мл среды, содержацей, г/л воды: дрожжевой экстракт 5, триптон 5, натрий хлористый 5, и инкубируют в условиях качалки до средней логарифмической фазы, затем клетки отделяют центрифугированием при 10000 g. Выход фермента

10000 ед/г биомассы. Активность эндонуклеазы определяют по гидролизу

ДНК фага, продукты реакции анализируют электрофорезом в геле 0,8Х-ной агарозы. на ДНК последовательность нуклеотидов 5 ...(САТСС... 3 . штамм В.cereus выделен из почвы и характеризуется следувцими признаками.

Иорфологические признаки. Прямые палочки, размер клеток 18 часовой культуры 3,5х1,1 мкм. Клетки располагаются одиночно или цепочкой. Эллипсовидные споры располагаются в клетке центрально. Клетки при спорообразовании не раздуваются.

Культуральные признаки. На твердом мясопепетонном агаре через 18 ч о роста при 37 С образуются колонии молочного цвета со слегка волнистым краем. Образование спор начинается через 48-72 ч при вырацивании на

1645299

Формула изобретения

Птамм бактерий Bacillus cereus

ВИП1 В-4246 — продуцент эндонуклеазы

Все 751 1.

Составитель И. Привалова

Техред М.Дндык Корректор М. Шарошн

Редактор С. Лисина

Заказ 1.322 Тираж 377 Подписное

BflHHJIH Государственного комитета по нзоьретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 мясопептонном агаре при 37 С. После роста на глюкозном агаре в протоплазме обнаруживаются глобулы. Рост на жидкой питательной среде характеризуется равномерньм помутнением.

Физиолого-биохимические признаки.

Грамположительные аэробные спорообразуюцие палочки. Продуцируют каталазу. Культура ферментирует глюкозу, 10 арабинозу, маннит с образованием кислоты, ксилоэу не использует. Утилизирует цитрат и пропионат, гидролизует крахмал, в анаэробных условиях из нитратов газ не образует, дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, обеспечивает метиленовую синь.

Растет в анаэробных условиях.

11тамм продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу Все 751 1, узнающую на двухнитевой .ДНК последовательность нуклеотидов 5 ...GGATCC...Ç

Пример. Получение сайт-специфической эндонуклеазы Все 151 1. штамм В. cereus 751 хранится в 35 пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом. Для оживления культуру пересевают на скошенный мясопептонный агари инкубируют в термостате при 37 С в течение 24-36 ч. Для 30 получения биомассы культуру засевают в колбу объемом 3 л, содержащую 700мл среды, содержащей, г/л, дрожжевой экстракт 5; триптон 5; натрий хлористый 5 и инкубируют в условиях качалки до средней логарифмической фазы, за-, 35 тем клетки отделяют центрифугированием при 10000 g. !

0,5 г клеток суспендируют в 0,5 мл буфера А (0,2 H НаС1; 0,01 H К-фосфат, рН 7,0; 2 мМ дитиотрейтол;

0,1 мИ ЭДТА) разрушают ультразвуком при охлаждении льдом, клеточные стенки осаждают при 40000 g. Надосадочную жидкость хроматографируют на колонке

1,5х30 см с Toyopearl Б4-55, уравновешенной в том же буфере со скоростью

20 мл/ч, фракции 0,8 мл. Активность эндонуклеазы определяют по гндролизу

ДНК фага ф, продукты реакции анализируют электрофорезом в геле 0,8Х-ной агарозы. Фракции, содержащие эндонуклеазу, объединяют, диалиэуют против буфера А, содержащего 507 глицеФ рин и хранят при -20 С. Выход фермента 10 тыс. ед/г биомассы.

Специфичность эидонуклеазы

Все 751 1 определяли по гндролизу ею различных ДНК с известной первичнсф структурой (ДНК фагов g H13

gfX174, плазмиды pBR322).

Установлено физическим картированием, что эндонуклеаэа Все 751 1 узнает и гидролизует ДНК pBR322 и точках с координатами 375 п.о., ДНК фага 9i -5505, 72346, 27972, 41732 п.о

ДНК фХ174 не гидролиэуется. Анализ этих данных приводит к заключению, что эндонуклеаза Все 751 1 узнает последовательность нуклеотидов GGATCC,