Рекомбинантная плазмидная днк @ 14, кодирующая полипептид, со свойствами лейкоцитарного интерферона @ 2 человека, и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона @ 2 человека

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медицине. Целью изобретения является повышение уровня синтеза интерферона. Получена плазмида pIF 14, кодирующая конститутивный синтез полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона человека. Рекомбинантная плазмида pIF 14 содержит тандем синтетических генов интерферона, экспрессия которых происходит путем трансляции полицистронной матричной РНК, в которой терминирующий кодон предшествующего цистрона ТАА является частью последовательности Шайн-Далыарно TAAGGA в участке инициации трансляции дистального цистрона. Экспрессия тандема генов интерферона контролируется тандемом конститутивных промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7.. Рекомбинантная плазмидная ДНК pIF 14 состоит из Hindlll/Kpnl- фрагмента ДНК плазмиды pTNF311 содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, ген/ -лактамазы и терминатор транскрипции фага Я, и Kpnl/Hindlll-фрагмента, содержащего синтетический сайт инициации трансляции и тандем двух искусственных генов лейкоцитарного интерферона человека. Получен штамм Escherichia coli, который обеспечивает высокий уровень биосинтеза лейкоцитарного интерферона а 2 человека (свыше 35% суммарного клеточного белка) при упрощенной технологии его выделения. 2 с.п. ф-лы. (Л С х| О со о ю

.,«ф, Гю фЯфф

:. ."

CОгОЭ СОНГ: TCKViX сОциАдистичГсклх

Р Г с I у ь.п и v.

IsI>s С 12 N 15/21. 1/21

ГОСУДлРСтВЕНГ)Ь Л K0>1UITEт

Г1О И.: . ЬР= Г НИЯ .l !, тКРо Г 1ЯГ1!

1РИ ГКН Г CC Р

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЪСТВУ (21) 4786850/13 (22) 24.01.90 (46) 07.01.92. Бюл. N. 1 (71) Институт биоорганической химии им

М.М.Шемякина (72) В.Г.Коробко, В.H Добрынин. С.А.Филиппов, В.В.Кравченко, И.П.Гилева и С.А.Чувпило (53) 575.224.2.577.2/048 (088.8) (56) Биоорганическая химия, 1987 т. 13, N. 9. с. 1186 — 1193. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК plF14, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД

СО СВОЙСТВАМИ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО

ИНТЕРФЕРОНАи2 ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ

БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI — ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ

ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА и2

ЧЕЛОВЕКА .(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медицине, Целью изобретения является повышение уровня синтеза интерферона. Получена плазмида plF 14, кодирующая конститутивный синтез полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона человека. РекомбинанИзобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. и может быть использовано в медицине.

Целью изобретения является повышение уровня синтеза интерферона.

Получена рекомбинантная плазмидная

ДНК plF14, кодирующая полипептид со свойствами интерферона человека и характеризующаяся следующими признаками: кодирует аминокислотную последователь„„5JJ„„ 1703691 А l тная плазмида plF 14 содержит тандем синтетических генов интерферона, экспрессия которых происходит путем трансляции полицистронной матричной РНК, в которой терминирующий кодон предшествующего цистрона ТАА является частью последовательности Шайн-Дальгарно TAAGGA в участке инициации трансляции дистального цистрона. Экспрессия тандема генов интерферона контролируется тандемом конститутивных промоторов А2 и АЗ ранней области бактериофага Т7.. Рекомбинантная плазмидная ДНК plF 14 сОстоит из Hindlll/Kpnlфрагмента ДНК плазмиды pTNF311 содержащего тандем промоторов А2 и АЗ ранней области бактериофага Т7, ген,в-лактамазы и терминатор транскрипции фага 1, и Kpnl/Hindlll-фрагмента, содержащего синтетический сайт инициации трансляции и тандем двух искусственных генов лейкоцитарного интерферона человека. Получен штамм Escherichla coll, который обеспечивает высокий уровень биосинтеза лейкоцитарного интерферона а 2 человека (свыше 35 g суммарного клеточного белка) при упрощенной технологии его выделения.

2 с.п. ф-лы. ность зрелого лейкоцитарного интерферона а2 человека, имеет молекулярную мас- .ь су 2,74 МД (4,21 т.п.о), состоит из

Hindlll/Kpnl — фрагмента ДНК плазмиды

pTNF3 l1 А содержащего тандем промоторов А2 и АЗ ранней области бактериофага

Т7, ген Р -лактамазы и терминатор транскрипции фага Я (3,4 т.п.о), Kpnl/Hindlllфрагмента, содержащего синтетический сайт инициации трансляции и тандем двух

1703691 синтетических генов лейкоцитарного интерферона человека (1,05 т.п.о), и содержит тандем двух синтетических генов, в качестве генетического маркера ген Р-лактамазы, детерминируюгций устойчивость трансформированных плазмидой plF14 клеток

Е.coli к пенициллиновым антибиотикам, уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях вправо от сайта

Крп1:Sah-1041 нуклеотид, Hindi ll-1059 нуклеотидов, Ncol-1375 нуклеотидов.

Рекомбинантная плазмида р I F14 содержит тандем синтетических генов интерферона, экспрессия которых происходит путем трансляции полицистронной матричной РНК, в которой терминирующий кодон предшествующего цистрона TAA является частью последовательности Шайн-Дальгарно TAAGGA в участке инициации трансляции дистального дистрона. Такая организация полицистронной мРНК приводит к сопряжению трансляции цистронов, что делает более эффективным биосинтез бел ка ри босо ма й.

Получен штамм — продуцент полипептида с биологической активностью лейкоцитарного интерферона человека путем трансформации компетентных клеток Е.coli

0 путем плазмидой plF14.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, Культуральные признаки. Клетки хорорастут на простых питательных средах.

При росте на агаре "Дифко" колонии круглые, гладкие, прижаты, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть, Физико-биологические признаки. Клетки растут при 4-40 С при оптимуме рН 6,8—

7,0. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до

300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды, а также к тетрациклину (до 500 мкг/мл) благодаря наличию транспозона.

Штамм Е,coli SG20050/plF14 обусловливает конструктивный синтез полипептида

55 со свойствами интерфеоона а 2 чел о в е ка н а уровне 1,5-2,5.10 МЕ/мл клеточной суспензии, что составляет более 35% суммарного клеточного белка бактерий.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов

"ВНИИгенетика" под номером ВКПМ В4788, Пример 1. Химический синтез олигонуклеотидов.

Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфорамидитным методом на ДН К-синтезаторе с наращиванием олиго-! нуклеотидной цепи в направлении от 3-конца к 5 -концу с помощью защищенных фосфамидитов-5 -диметокситаитил-N-ацилI

2 -дезоксинуклеозид-3 -0-(метоксидиизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе

0,5-0,7 мкмол ь, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А, размер частиц 40-80 мкм), к которому через 3-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеотидное звено (нагрузка 2030 мкмоль/г). Используют синтетический цикл, при этом после реакции конденсации проводят промывку смолы смесью теграгидрофурана, пиридина и воды (5:3:2). После окончания синтеза защитные группы удаляют последовательной обработкой тиофенолятом триэтиламмония и концентрированным аммиаком, При этом происходит отделение олигонуклеотида от носителя, 5 -Диметокситритильную группу удаляют кислотной обработкой и олигонуклеотид очищают электрофореэом в

20 ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Выход 1-5 о.е.

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК plF225.

Клетки бактерий E.cali НВ101, содержащие плазмидную ДНК рбА23, выращивают при 37"С в LB-бульоне, содержащем

100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Плазмидную ДНК выделяют и высаживают этанолом. Осадок растворяют в ТЕбуфере, содержащем 1 M NaCI, прибавляют полиэтиленгликоль ПЭГ-6000 до концентрации 1,5, выдерживают 1 ч при 0 С, центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин, осадок промывают 70 этанолом, высушивают и растворяют в ТЕ-буфере.

Выделяют ДНК плазмиды pLeuIFt17, содержащей синтетический ген а 2 интерферона в виде Bglll/Sall-фрагмента. 2 мкг плазмиды рбА23 инкубируют с эндонуклеазой рестрикции Hindlll (10 ед.) в 30 мкл буфера В, содержащего 20 мм трис-HCI. pH

7,5, 50 MM NaCI, 10 мМ М9С12, 7 мМ мерка1703691 птоэтанол, в течение 1 ч при 37 С. После инкубации реакцию останавливают двухкратной экстракцией смесью фенола и хлороформа (1:1) и ДНК высаживают 70 -ным этанолом. К раствору 0,2 мкг полученного таким образом вектора в 20 мкл буфера А, содержащего 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ

МоС4, 0,2 мМ гАТР и 5 мМ дитиотреит, прибавляют 0,1 мкг олигонуклеотида

AGCTTAAGTCGACTTA и 20 ед, Т4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15 С, затем аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток

Е.coli.

Клетки высевают на агар, содержащий среду М9, 0,27 глюкозы и 2 мкг/мл тиамина, Единичную колонию вносят в 50 мл питательного бульона LB и выращивают при

37 С до мутности 0,3-0,5. Клетки охлаждают, осаждают центрифугированием (10 мин, 5000 об/мин), промывают раствором 10 MM

MgClz, центрифугируют, суспендируют в

20 мл 0,1 М раствора CaClz и выдерживают при 0 С в течение 30 мин, После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл

0,1 М CaCIz и через 3 ч используют для трансформации. С этой целью 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл 0.05 М CaClz, затем прибавляют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают при 0 С, затем 2 мин при 42 С и снова 10 мин при 0 С, после чего прибавляют 1,4 мл LB-бульона, инкубируют 1 ч при 37 С и аликвоту высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (100 мкг-мл) и хлорамфеникол (50 мкг/мл). Клоны бактерий, содержащие целевую плазмиду р6А23/Яаб, идентифицируют гибридизацией с клонируемым олигонуклеотидом P-AGCTTAAGTCGACTTA.

Из гибридизующихся с этой пробой клонов выделяют плазмидную ДНК, строение которой подтверждают рестриктным анализом с помощью рестриктаз Ha5II, Mspl и HaHII + Sa0.

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды

P6A23/Бар в 80 мкл буфера В без МаСг прибавляют 20 ед. каждой из рестрикционных нуклеаз Safl u Kpnl и инкубируют 90 мин при 37 С. Анализ полноты гидролиза и выделение векторного Kpnl/Яа(1-фрагмента (3,4 т.п.о) проводят при помощи электрофореза в 1 -ном геле легкоплавкой агароэы.

Одновременно 10 мкг ДНК плазмиды

pLeulFt 17 в 100 мкл буфера В обрабатывают 1,5 ч при 37 С 20 ед. каждой из рестриктаэ BgLI(и Sall, после чего фрагмент величиной около 500 п,о., содержащий синтетический ген а 2 интерферона, выделяют при помощи электрофореза в 5ь-ном геле.

Далее этот фрагмент (0,2 MKf) соединя от в присутствии дуплекса:

CTAATTTAATTTAAGGATTATCGATATGTG T (I)

САТ66АТТАААТТАААТТССТААТАО СТАТАС

ACACTAG (II) с векторной ДНК (1,5 мкг) с помощью 30 ед.

Т4 ДНК лигазы в 50 мкл буфера А в течение

6 ч при 15ОС. Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli НВ101. Трансформанты высевают на агариэованную среду, содержащую ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (30 мкг/мл). Скрининг бактериальных клонов, содержащих рекомбинантную плазмиду plF225, проводят гибридизацией колоний in situ c P-мечен з ным олигонуклеотидом (I). Из клонов, гибридизующихся с радиоактивной пробой, выделяют плазмидную ДН К plF225, строение которой подтверждают гидролиэом рестриктазами Mspl и Haelll, а также определением нуклеотидной последовательности в районе вставки синтетического дуплекса

Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pIF226.

ДНК плазмиды pINF311 Л(10 мкг) гидролизуют совместно эндонуклеазами рестрикции (по 20 ед. каждой) Kpnl u Hindlll в

100 мкл буфера В без NaCt в течение 1,5 ч при 37 С, После инкубации раствор экстрагируют дважды смесью фенола и хлороформа (1:1) и векторный фрагмент величиной

3,17 т, п.о, выделяют зле ктрофо резо м в 1 7,ном агарозном геле, Затем 20 мкг ДНК плаэмиды plF225 гидролизуют в 150 мкл того же буфера 2 ч при 37 С смесью рестриктаз Kpnl и Hindlll (по 30 ед. каждой), после чего выделяют электрофорезом в 5 ПААГ фрагмент величиной около 620 п.о., содержащий синтетические участок инициации трансляции и ген а 2 интерферона. После этого лигируют 0,1 мкг этого фрагмента с 0,3 мкг векторного Hindlll/Kpnl-фрагмента в 25 мкл буфера А в присутствии 50 ед. Т4 ДНК-лигазы, Через 3 ч при 15 С 5 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli НВ 101. Трансформанты высевают на (В-агар. содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из восьми ампициллиноустойчивых клонов выделяют

ДНК и анализируют ее рестриктным анализом с помощью рестриктаз Haelll è Mspl. Из проанализированных шести препаратов

ДНК показывают нужный набор рестриктных фрагментов. Окончательно структуру рекомбинантной ДНК plF226 подтвержда1703691 ют определением нуклеотидной последовательности в области сайтов клонирования.

Пример 4. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК plF14.

Для приготовления вектора ДНК плазмиды plF226 (10 мкг) обрабатывают в 70 мкл буфера В рестриктазой Xhol (20 ед.) в течение 1 ч при 37 С, Смесь депротеинизируют двухкратной фенольной экстракцией, ДНК высаживают этанолом, промывают в 70 ным этанолом, высушивают и растворяют в

50 мкл воды. Затем гидролизуют 20 мкг ДН К плазмиды р280/21РМ в 200 мкл буфера В рестриктазой Xhol (50 ед.) в течение 1 ч при

37 С. Реакцию останавливают прибавлением 0,5 M раствора ЕДТА до ко <центрации 25 мМ и прогреванием в течение 3 мин при 100 С. Малый Xhol-фрагмент величиной 510 п.о. выделяют при помощи электрофореза в 1,5 -ном геле легкоплавкой агарозы. 0,3 мкг полученного таким образом фрагмента ДНК лигируют в 25 мкл буфера А с 1 мкг векторной ДН К, полученной укаэанным образом из плазмиды р TNF311 Л с помощью 50 ед. Т4 ДНК-лигазы в течение б ч при 15 С. Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli. Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (100 мкгlмл). Скрининг рекомбинантов проводят, анализируя минипрепараты ДНК, выделенные иэ отдельных колоний, с помощью рестриктаз Mspl u

Haelll по примеру 3. а также анализом клеточных лизатов на содержание интерферона по примеру 5.

Пример 5. Получение штамма— продуцента полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона а2 человека.

Плаэмидой plF14 трансформируют компетентные клетки Е.coli SG20050 по методу примера 2 и получают штамм — продуцент полипептида со свойствами интерферона человека. Клетки выращивают при 37 С в

20 мл LB-бульона в течение 20 ч на качалке, отбирают пробу 2 мл и клетки центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин. Содержание рекомбинантного интерферона а 2 определяют тремя способами.

Радиоиммуноанализ.

Клеточный осадок растворяют в 200 мкл раствора 8 M мочевины в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,0), содержащем 20 мкг/мл пметилсульфонилфторида. Перед внесением в лунки пробы центрифугируют в течение 2 мин при 12000 об/мин. Сначала в лунки полистирольного планшета вносят

50 мкл раствора кроли <ьих антител

55 (0,2 л<кг/мл) против интерферона а 2 в буфере

С, содержащем 0,02 М фосфат натрия. рН

7,5, 0,15 М NaCI, 1 мМ EDTA и 0,1 и инкубируют 1 ч при 20 С. Раствор удаляют из лунок, прибавляют 200 мкл 0,4 -ного раствора бычьего сывороточного альбумина в буфере С (буфер Б) и инкубируют 1 ч при

20 С. После этого лунки тщательно промывак буфером С, затем вносят исследуемые и калибровочные образцы и инкубируют 18 ч при 4 С. После трехкратной промывки

200 мкл буфера Б в лунки вносят раствор меченных J моноклональных антител NK-2

125 в буфере 6 и инкубируют б ч при 20"С. Лунки промывают несколько раз буфером С, разрезают и просчитывают на гамма-счетчике.

Для построения калибровочных кривых используют высокоочищенный препарат интер< ерона а 2 с удельной активностью

1,6 10 МЕ!мг. По данным радиоиммуноанализа продуктивность штамма составляет

3.8 10 МЕ/мл культуры клеток.

Определение биологической активности.

Клетки суспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 0,1 М трис-HCI, рН 7,0, 30 мМ

NaCt, 1 SDS, 1 меркаптоэтанола и 5 М мочевины, нагревают 3 мин на кипящеи водяной бане и центрифугируют 10 мин при

12000 об/мин. Из супернатантов готовят образцы путем последовательныМ двукратных разбавлений в среде Эрла (начиная с разбавления 1/100). Активность интерферона определяют стандартным способом по ингибированию цитопатического действия вируса везикулярногостоматита надиплоидные фибробласты человека. В качестве стандарта используют препараты лейкоцитарного интерферона человека, охарактеризованные относительно международного с та нда рта В 69/19.

По данным определения биологической активности продуктивность штамма Е.coli составляет 2,5 10 МЕ/мл культуры клеток.

Определение по отношению к суммарному клеточному белку.

Клетки суспендируют 120 мкл буфера, содержащего 125 мМ трис-HCI рН 6,8, 20 глицерин, 3 SDS, 3 меркаптоэтанол.

0,005 бромфеноловый синий, нагревают

10 мин на кипящей водяной бане и охлаждают во льду. Образцы 2,5 и 10 мкл подвергают электрофорезу в 12,5 SDS — ПААГ. По окончании электрофореза гель промывают

10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и прокрашивают при помощи кумлсси

R-250. После отмывки избытка красителя гель сканируют при 550 нм, используя лазерный сканиметр. По данным сканирова10

1703691 ния рекомбинантный интерферон а 2 соr гавляет 35 — 45;ь всего белка Е.coll.

Составитель Т. Забойкина

Техред М.Моргентал Корректор Т. Малец

Редактор И. Шулла

Заказ 40 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Таким образом, изобретение позволяет получить полипептид со свойствами лейгоцитарного интерферона человека, причем уровень его биосинтеэа составляет 2,53,8 10 МЕ/мл культуры клеток, что составт ляет свыше 35 (суммарного клеточного белка Е.соИ (или 150-200 мг полипептида со свойствами интерферона а 2 на 1 л культуры клеток), при этом возможно упрощение технологии его получения за счет исключения стадии индукции биосинтеза белка.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

plF14, кодирующая полипептид со свойствами лейкоцитарного интерферона а 2 человека размером 4,21 т.п.о. и молекулярной массой 2,74MB, содержащая: — Kpnl /B gal I-Sa fl/Hind ll I-фрагмент

ДНК плаэмиды pLeulFt17 с синтетическим геном интерферона размером 0,62 т,п.о.; — Kpnl — Hindi l!-фрагмент ДН К плазмиды

pTNF 311 Л размером 3,17 т,п.о„включающий тандем промоторов А2 и А3 ранней области бактериофага Т7, генP -лактамазы

5 и терминатор транскрипции фага k — Xho1-Xho1-фрагмент ДН К плазмиды, р280/2IFN размером 0,51 т.п.о.; — уникальные сайты рестрикции, распо10 ложенные на следующих расстояниях вправо от сайта Крп!:Яаг -1041 нуклеотид, Hindlll — 1059 нуклеотидов, Ncol — 1375 нуклеотидов; — ген Р -лактамазы, определяющий ус15 тойчивость к пенициллиновым антибиотикам; — тандем двух синтетических генов лейкоцитарного интерферона человека.

20 2. Штамм бактерий Escherlchia coll

ВКПМ В-4788 — продуцент полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона а 2 человека.