Рекомбинантная плазмидная днк @ 22, кодирующая синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии рsеudомоnаs sp. -продуцентинтерферона @ -11 человека

 

Изобретение относится к биотехнологии , генной инженерии, микробиологической и медицинской промышленности и представляет собой сконструированную in vitro плазмиду. обеспечивающую биосинтез лейкоцитарного интерферона человека, и штамм Pseudomonas sp. - продуцент лейкоцитарного интерферона, содержащий эту плазмиду. Целью изобретения является повышение выхода интерферона сг-П человека . Рекомбинантная плазмидная ДНК pVN 22. кодирующая синтез интерферона с:-И человека, состоит из и НтсПП-фр&гментов плазмиды pAYC37. Штамм Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) ВКМВ-3480 - продуцент интерферона а-|1 человека. 2 с.п. ф-лы. 1 ил.

jôô

СОГОЗ СОВЕТ КИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕО(УВЛИ К

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КО(ЛИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕ НИЯЗ И OTKPI:I ГИЯМ

ПРИ Гкнт СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4065414/13 (22) 30.04.86 (46) 07.01.92. Бюл. М 1 (1) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов и Институт биоорганической химии им. Шемякина (72) Ю.И.Козлов, B,А.Народицкая, М.P.Еремашвили, А.Я.Стронгин, В.Э.Стеркин, М.А. Скворцова, А.Ю.Ч истосердов, Ю.Д. Цыганков. Л.В.Евдонина. В.Л. Юрин. Г.С.Монатырская, Е.Д.Свердлов, Г.M.Äîëãàíîâ и С.А.Царев (53) 575.224.2;577.2 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1464471, 30.09.86. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК pVN 22, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ ИНТЕРФЕРОНА а-)1 ЧЕЛОВЕКА. И ШТАММ

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии. микробиологической и медицинской промышленности и представляет собой сконструированную in

vitro плазмиду, обеспечивающую биосинтез лейкоцитарного интерферона человека, и штамм Pseudomonas sp. — продуцент лейкоцитарного интерферона. содержащий эту плазмиду.

Цель изобретения — повышение выхода интерферона и -11.

На чертеже показана схема конструирования плазмиды pVN 22.

Пример 1. Конструирование плазмиды pVN 22.

0,2 мкг ДНК плазмиды pAYC37(Plasmid.

14, 118-125, 1985) и 1 мкг ДНК известной плазмиды pVN 609 расщепляют рестриктазами EcoRI u Hindlll в следующих условиях:

„, 5U „» 1703690 A l

is»s С 12 N 15/21, А 61 К 37/66, С 12 tJ 1/2!

БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SP. Г г ОД)ЦЕНТ ИНТЕРФЕРОНА и-t1 ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, микробиологической и медицинской промышленности и представляет собой сконструированную In ч1тго плазмиду. обеспечивающую биосинтез лейкоцитарного интерферона человека. и штамм Pseudomonas sp. — продуцент лейкоцитарного интерферона, содержащий эту плазмиду. Целью изобретения является повышение выхода интерферона и-Т1 человека. Рекомбинантная плаэмидная ДНК pVN

22. кодирующая синтез интерферона r. -I1 человека, состоит из EcoR(- и Hindlff-фрагментов плазмиды рАУС37. Штамм

Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) BKMB-3480— продуцент интерферона и-l1 человека.

2 с.п. ф-лы, 1 ил.

6 мМ трис-CI, рН 7.6, 6 MM MgClz, 6 мМ

2-меркаптоэтанола и 50 мМ NaCI; EcoRI—

2 ед. активности, Hindlll — 2 ед. активности; обьем реакционной смеси 30 мкл. Реакцию проводят 40 мин при 37 С и останавливают прогреванием в течение 15 мин при 65 С.

Затем проводят смешивание полученных фрагментов с помощью ДНК-лигаэы 4ага

Т4. Лигирование проводят при 12-14 С в течение 120 мин, после чего такую смесь трансформацией вводят в Е.co(i С600.

Трансформацию проводят следующим образом. Ночную культуру Е.coli С600 в

500 раз разводят жидкой средой LB (7) и растят на качалке с аэрацией при 37 C до достижения культурой клеток оптической плотности 0,4-0,6 ед. при 550 нм. Затем суспензию клеток охлаждают в ледяной бане, собирают центрифугированием, суспен1703690 дируют в ледяном растворе 0,1 M СаС!г, после чего суспензию на 30 мин помещают в ледяную баню. Затем клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в

1/20 первоначально обьема клеточной суспензии. К 100 мкл приготовленных таким образом клеток добавляют 30 мкл раствора

ДНК после лигирования и после тщательного перемешивания полученную смесь составляют на 30 мин в ледяной бане, затем проводят прогревание смеси, помещая пробу в водяной термостат с температурой 42 С на 4-5 мин, после чего пробу снова помещают на 20 мин в ледяную баню.

Затем суспензию в десять раз разводят средой LB и на 2,0-2,5 ч помещают в термостат 37 С. Такая длительная инкубация необходима для проявления устойчивости к стрептомицину. После подращивания 10—

50 мкл клеточной культуры высевают íà агаризованную LB-среду, содержащую в качестве селективных маркеров стрептомицин (100 мкг/мл) и ампициллин (100 мкг/мл). кторная плазмида рАУС37 не способ, восстановлении дать трансформантс э такой среде, так как не обладает устойчивостью к стрептомицину. Промотор, с которого происходит экспрессия стрептомицинустойчивости, у рАУС37 отсутствует.

При клонировании промотор-содержащего фрагмента с интерфероном а-(1 из pVN 609 в рАУС37 происходит восстановление устойчивости к стрептомицину, что позволяет легко отбирать клоны, содержащие искомые плаэмиды. Из таких клонов щелочным методом выделяют плазмидную ДНК и анализируют структуру плазмид с помощью рестриктаз Hindlll и EcoR(в указанных условиях. Анализ получаемых фрагментов проводят с помощью электрофореза в 1;ь-ном агарозном геле в стандартном трис-боратном буфере с последующим прокрашиванием геля бромистым этидием, что позволяет увидеть фрагменты ДНК в длинноволновом ультрафиолете. Идентифицирована плазмида pVN 22.

Пример 2. Получение штамма

Pseudomonas sp. 31 (pVN 22), продуцирующего интерферон а-(1.

Для введения плаэмиды pVN 22 в

Pseudomonas sp. 31 применяют две последовательные конъюгации. Сначала в штамм

Е.coll С600 (pVN 22) конъюгацией вводят плазмиду R751, которая обеспечивает устойчивость к триметаприму.

Высев конъюгатов производят на минимальную агаризованную солевую среду

Адамса, содержащую следующие компоненты: глюкоза 4 мг/мл; тизмингидрохло5

55 рид 5 мкг/мл; треонин 50 мкг/мл; лейцин

50 мкг/мл; ампициллин 75 мкг/мл; стрептомицин 75 мкгlмл; триметаприм 75 мкгlмл.

В этих условиях вырастают только коньюгаты Е.coll С600 (R 751, pVN 22). Затем проводят конъюгацию между Е.coll C600(R

751, pVN 22) и Pseudomonas sp. 31 с дефектным геном thr А. Конъюгаты вырастают на минимальной агариэованной солевой среде следующего состава: глюкоза 4 мг/мл; тиамингидрохлорид 5 мкгlмл; треонин

50 мкг/Mn; ампициллин 75 мкг/мл, стрептомицин 200 мкг/мл, триметаприм 75 мкг/мл.

Температура роста конъюгантов 30 С.

Штамм-донор С600 (R 751, pVN 22), помимо треонина, нуждается еще и в лейцине, поэтому на такой среде не вырастает. В результате получен штамм Pseudomonas sp. 31 (pVN 22), содержащий плазмиду, которая обеспечивает синтез интерферона Q-!1.

Штамм Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки прямые палочковидные длиной 3 — 5 мк, грамотрицательные, несг1ороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах.

На мясопептонном агаре через 24 ч роста при 25-30О образуют крупные колонии с неровным краем (диаметр 3-4 мм), поверхность шероховатая, цвет светло-зеленый.

При росте на бульоне Хоттингера или М 9 с добавками казаминокислот образуется равномерная муть. Через 24 ч роста на бульоне

Хоттингера с аэрацией культура приобретает светло-зеленый цвет и слегка опалесцирует, Физиолого-биохимические признаки.

Клетки Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) растут при 10 — 35О с оптимумом 30 С при рН 6,7—

7,5. Источники углерода: глюкоза, арабиноэа. Источники азота: соли аммония, мочевина, могут быть также аминокислоты, пептон, триптон и т.п, Устойчивость к антибиотикам, Клетки

Pseudomonas sp, 31 (pVN 22) обладают устойчивостью к 400-500 мкгlмл стрептомицина и 150-200 мкг/мл ампициллина.

Стабильность плазмиды в штамме. При поддержании клеток Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) в течение 6 мес на агариэованной среде, содержащей ампициллин и стрептомицин в соответствующих концентрациях, не наблюдаются потери или перестройки плаэмиды.

Пример 3. Культивирование

Pseudomonas sp. 31 (pVN 22).

Штамм Pseudomonas sp. 31(pVN 22) выращивают при 28 С ь течение 14 ч на скошенной агаризованной стандартной среде

1703690

Хоттингера, содержащей антибиотики: ампициллин 75 мкг/мл, стрептомицин

150 мкг/мл. Триметаприм в среду не добавляется, так как наличие плазмиды R751 на продукцию интерферона не влияет. Выросшую на косяках биомассу используют для приготовления посевного материала.

Для этого клетки переносят в колбы Эрленмейера обьемом 750 мл со 100 мл указанной среды. но беэ агара и выращивают на качалке при перемешивании (240 об/мин) в течение нескольких часов при 28 С О Dsso посевной культуры должна быть равна приблизительно 1,0 — 2,5. Ферментацию проводят в ферментере, оснащенном системами для регулирования температуры, рН, скорости перемешивания и аэрации, датчиком для измерения парциального давления растворенного кислорода, Посевную культуру вносят в количестве

5 в ферментер с указанной средой. Растят клетки до оптической плотности в стандартных условиях 2-4 при рН 6,7 — 6,9 и температуре 28+0,5 Ñ. Проводят интенсивную аэрацию и перемешивание. Режим. аэрации и перемешивания подбирают так, что рост культуры не лимитируется концентрацией растворенного кислорода, для чего значение парциального давления кислорода поДдерживают на уровне 5 — 10 от насыLL,åíèÿ. Для стабилизации рН используют аммиачную воду. Рост биомассы контролируют по изменению оптической плотности культуральной среды. После окончания ферментации активность интерферона составляет 2,5 х 10 МЕ/л, Таким образом, создана плаэмида, обеспечивающая синтез нового вида человеческого лейкоцитарного интерферона а-f1 и способная реплицироваться во многих грамотрицательных бактериях. С помощью полученной плазмиды создан ш1амм — продуцент интерферона и-11 с активностью до 2,5 х 109 МЕ/л культуральной

5 жидкости.

Использование интерферона сс-l1 в качестве добавки к смеси других, уже известных лейкоцитарных интерферонов, также получаемых микробиологическим синте10 зом, позволяет приблизить лечебный эффект такого комбинированного препарата интерферонов к действию природных лейкоцитарных интерферонов плазмы крови. В дальнейшем возможно и самостоятельное

15 применение интерферона а-l1.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плаэмидная ДНК

pVN 22, кодирующая синтез интерферона

20 и-(1 человека, имеет размер 10,85 т.п.о. и состоит из следующих элементов:

EcoRI-Hindflt-фрагмента плаэмиды р

AYC 37 размером 9,45 т.п.о.; Hindlll-EcoRtфрагмента размером 1,4 т.п.о., внутри кото25 рого расположены; участок ДНК и рВР322 диаметром 0.03 т.п,о.; регуляторная область гена 0 фага р х 174 размером 0,22 т.п.о.; ген интерферона а -l1 размером

0,50т,п.о.; участок геномной ДНК человека

30 размером 0.65 т.п.о.; генетические марке-. ры: ген Ар", обеспечивающий устойчивость к ампициллину; ген St< . обеспечивающий устойчивость к стрептомицину; уникальные участки узнавания следующих ре35 стриктаэ; Hindlll — 0; EcoRI — 1,4 т.п.о., BamHf — 10,82 т.п.о.

2. Штамм Pseudomonas sp. ВКПМ В3480 — продуцент интерферона а-)1 человека, 40

1703590 и в Ш 8am HI

EcoRI

Составитель T. Забойкина

Техред М.Моргентал Корректор Т Малец

Редактор И. Шулла

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 40 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5