Способ определения биогенных порфиринов

 

Сущность способа заключается в том, что содержащиеся в образце порфирины предварительно переводят в форму их палладиевых комплексов и затем количественную оценку уровней порфиринов проводят по высокотемпературной фосфоресценции их палладиевых комплексов в водных растворах . 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 21/64

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

° }

О

00

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4869606/25 (22) 28,09.90 (46) 15.06.92. Бюл. М 22 (71) Институт биохимии им. А. Н. Баха и

Совместный советско-вьетнамский научноисследовательский тропический центр при

Институте эволюционной морфологии и экологии животных им. А.Н. Северцова (72) Д, Б. Папковский, А. И. Савицкий, С. П.

Поздняков, В. С. Румак и Г, В. Пономарев (53) 543.42 (088.8) (56) Патент США

М 4810655, кл. G 01 N 21/76, 1986, Diagnosis and therapy of porphyrias and

lead intoxication / Ed. М, Doss, Springer—

Чег!ад, 1978, р. 203-207, Изобретение относится к способам определения порфиринов и может быть использовано в медицине, биотехнологии, биохимических исследованиях, Определение уровней порфиринов в биологических образцах (моча, сыворотка крови и т,п.) важно при диагностике некоторых нарушений обмена веществ (порфиринурии, порфирии), ряда патологических заболеваний животных и человека, химических интоксикаций, а также в ряде биотехнологических производств (микробиологический синтез биогенных порфиринов и некоторых витаминов с родственной структурой).

Известны способы определения порфиринов с использованием спектрофотометрии, спектроскопии магнитного кругового дихроизма, дифференциальной спектрофотометрии.

Недостатками этих способов являются невысокая чувствительность, ограниченная чувствительностью фотометрической детекции порфиринов(около 1 мкг/мл), влиянием оптических свойств исследуемого образца на результаты определения, и невысокая се„„SU „„1741028 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОГЕННЫХ ПОРФИРИНОВ (57) Сущность способа заключается в том, что содержащиеся в образце порфирины предварительно переводят в форму их палладиевых комплексов и затем количественную оценку уровней порфиринов проводят по высокотемпературной фосфоресценции их палладиевых комплексов в водных растворах. 1 з.п. ф-лы, 1 табл, лективность определения порфиринов (влияние примесей пигментов). Это приводит к необходимости дополнительных стадий (разбавление образца, экстракция, концентрирование, фракционное разделение и т.п.), что усложняет анализ, делает его многостадийным и требует большого расхода исходного материала, затрудняет автоматизацию.

Наиболее близок к предлагаемому способ определения уровней порфиринов путем прямого флуориметрического определения порфиринов в тканях или тканевых жидкостях.

Однако чувствительность метода ограничена высокими фоновыми сигналами, обусловленными светорассеянием тканей и тканевых жидкостей (благодаря высокому содержанию белков и других макромолекул), а также собственной флуоресценцией биологических жидкостей. Примеси флуоресцирующих пигментов мешают определению порфиринов, Обычно чувствительность дан1741028

15

30

40

50

55 ного метода не превышает 1 нг!мл порфиринов.

Цель изобретения — повышение чувствительности, точности анализа, его упрощение и повышение специфичности определения порфиринов.

Поставленная цель достигается тем, что анализируемые водные растворы биогенных порфиринов обрабатывают в определенных условиях водными растворами и растворимой соли двухвалентного палладия таким образом, чтобы количественно перевести содержащиеся в них порфирины в их палладиевые комплексы, после чего содержание порфиринов определяют по высокотемпературной фосфоресценции палладиевых комплексов порфиринов. Измерение фосфоресценции Pd-порфиринов проводят в обескислороженных водных растворах при комнатной температуре.

PcI-порфирины обладают уникальной способностью интенсивно фосфоресцировать в водных растворах при комнатной температуре и могут быть селективно определены в сложных биологических системах с высокой чувствительностью методом импульсной флуориметрии с миллисекундным временным разрешением. Режим регистрации люминесценции с временным разрешением практически полностью исключает влияние оптических свойств образца и люминесцирующих примесей на результаты определения Pd-порфиринов, Получаемые при химической обработке палладиевые комплексы порфиринов являются индивидуальными соединениями (константа диссоциации Pd(II) из порфиринового макроцикла очень высокая (> 10-34 М), которые обладают высокой химической стабильностью, Следовательно, процесс включения палладия в порфирины является практически необратимым и неподвержен влиянию последующих стадий манипуляции с образцом.

Спектральные свойства палладиевых комплексов различных биогенных порфиринов (ди-, тетра-, октакарбоксил ьн ых) практически идентичны. Следовательно, при определении различных порфиринов или их смесей условия регистрации идентичны, Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение палладиевых комплексов порфиринов, К 1 мл раствора копропорфирина 1 (концентрация 10 нМоль/л) в 0,05М ацетатном буфере, рН 5,0, добавляли 0 01 мл раствора хлорида палладия (! 1) (0,01 М) в 0,01 М HCI u инкубировали на водяной бане при 80 С 3 мин. После охлаждения раствора реакцию останавливали добавлением 0,1 мл водного раствора сульфита натрия (100 мг/мл), при этом рН системе устанавливался в районе

7,0. Записывали спектры люминесценции растворов на спектрофлуориметре LS-50 (Perkin Elmer) в диапазоне длин волн 550750 нм при возбуждении на длине волны 395 нм. Исчезновение полос флуоресценции порфиринов (в области 620 нм) и появление полос фосфоресценции Pd-порфиринов (в области 670 нм) в спектрах люминесценции свидетельствует о том, что порфирин пол ностью переходит в форму палладиевого комплекса.

Предпочтительные условия получения палладиевых комплексов: 2-15-минутная инкубация в ацетатном буфере, рН 3,0-5,0, при 60-80 С в присутствии 20-500 мкМ Pd (2+).

Спектральные свойства копропорфирина и его Pd-комплекса приведены в таблице.

Пример 2. Измерение высокотемпературн0й фосфоресценции Pd-порфиринов.

Копропорфирин 1 переводили в форму

Рб-комплексов согласно примеру 1, используя различные исходные концентрации копропорфирина (0,1.-100 нм), и измеряли интенсивности фосфоресценции растворов в режиме с субмиллисекундным временным стробированием.

Оптимальные условия измерения следующие: возбуждение при 395 нм (спектральная полуширина фильтра около 50 нм), регистрация при 665 нм (полуширина около

50 нм). Частота вспышек лампы 1 кГц (полуширина вспышки — не более 10 мкс), время задержки после вспышки 100 мкс; ворота счета 800 мкс; время накопления сигнала 1 с, B условиях измерения фосфоресценции

Pd-копропорфирина в огличие от условий измерения флуоресценции копропорфирина практически отсутствует фоновый сигнал светорассеяния и свечения образца, Поэтому может быть достигнута значительно более высокая чувствительность детекции

Pd-копропорфирина (порядка 0,1 пмоль/л), Эта величина соответствует чувствительности определения порфиринов, поскольку степень их превращения в палладиевые комплексы практически 100 .

Пример 3. Способ проводят аналогично примеру 1, но вместо хлорида палладия используют ацетат палладия в той же концентрации, Результаты аналогичны, Пример 4. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубируют 10 мин при

60 С. Результаты аналогичны

Пример 5. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубируют с солью

1741028

55 палладия-2 ч при 370С, Результаты аналогичны.

Пример 6. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубацию проводят в

0,025 М ацетатном буфере, рН 3,0. Интенсивность фосфоресценции снижается примерно в 1,5 раза вследствие неполного перехода порфирина в форму Pd-комплекса.

Пример 7. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубацию проводят в

0,05 M ацетатном буфере, рН 6 5. Интенсивность сигнала снижается в 2 раза вследствие неполного перехода порфирина в

Рб-комплекс.

Пример 8. Способ осуществляют аналогично примерам 1-2, но вместо копропорфирина!используют копропорфирин III.

Фосфоресцентные свойства соединений приведены в таблице. Результаты аналогичны.

Пример 11. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо копропорфирина 1 используют уропорфирин Ill. Фосфоресцентные свойства .соединений приведены в таблице. Результаты аналогичны.

Пример 12. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо копропорфирина 1 используют протопорфирин IX.

Фосфоресцентные свойства соединений приведены в таблице. Результаты аналогичны.

Пример 13. Определение порфиринов в биологических образцах.

В пробирках делают серию разведений стандартного (1 мкм) раствора копропорфирина 1 в О,ОЬ М ацетатном буфере, рН 5,0:

1/1; 1/3; 1/9; 1/27;... Добавляют во все пробирки по 0,01 мл раствора PdCI (0,01 M) в

0,01 M HCI и инкубируют гри 80 С 2 мин на водяной бане. Растворы охлаждают до комнатной температуры и добавляют во все пробирки по 0,1 мл вгдного раствора

К 1 мл 0,05 M ацетатного буфера, рН 5,0, содержащего 0,1 мМ соли палладия, добавляют по 0,05 мл исследуемых образцов мочи пациентов (разведение 1:20-1:100 необходимо для снятия влияния компонентов образца на процесс получения

Рб-комплексов). Инкубируют 5 мин при

80 С, Затем охлаждают раствор, добавляют

0,1 мл водного раствора сульфата натрия (100 мг/мл). По 0,2 мл растворов переносят в лунки микропланшета и измеряют интенсивности фосфоресценции образцов на импульсном флуоресцентном ридере

Arcus-1231 (Wallak, Финляндия). Условия измерения аналогичны описанным в примере 2, По результатам измерения оценивают уровни порфиринов в моче, используя в качестве контроля мочу здоровых пациентов или калибровку по копропорфирину 1 (см, пример 2). Завышенные уровни порфиринов говорят о нарушениях порфиринового обмена.

Производительность способа — около

100 образцов в 1 ч.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает значительное увеличение чувствительности по сравнению с прототипом (примерно на 2 порядка), позволяет повысить производительность анализа в несколько раз, поскольку время одного измерения мало (секунды), так как нет необходимости записывать спектры, Способ не подвержен влиянию оптических свойств образца и примесей (фоновый сигнал практически отсутствует), легко может быть автоматизирован.

Формула изобретения.

1. Способ определения биогенных порфиринов, включающий обработку содержащего порфирины образца, измерение его люминесценции и количественную оценку содержания порфиринов по интенсивности люминесценции, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности определения, упрощения и ускорения анализа, образец обрабатывают в буфере с рН 3-6,5 избытком растворимой соли палладия (Pd(l 1) -) при температуре 37-100 С до полного превращения порфиринов в их палладиевые комплексы, после чего добавляют сульфит в конечной концентрации 5-15 мг/ мл, а количественную оценку осуществляют по фосфоресценции полученных растворов при рН 6,5-8,0 при комнатной температуре.

2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что обработку проводят 2-15 мин при

60-80 С в 0,05 M ацетатном буфере с рН 5,0 при концентрации Pd(ll) 50-500 мкМ, 1741028

Составитель О,Бадтиева

Редактор Л.Веселовская Техред M.Mîðãåíòàë Корректор О.Кравцова

Заказ 2081 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101