Способ отбора теплокровных животных, чувствительных к неблагоприятному воздействию

 

Использование: биология, медицина. Сущность изобретения: из организма выделяют клетки эритроцитов,, носителей мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы, для разной концентрации ацетилхолина осуществляют реакцию гидролиза, ингибируя ее ингибитором постоянной концентрации. Рассчитывают константу ингибирования, по которой судят о чувствительности теплокровного животного и биологической системы к неблагоприятному воздействию, ил.1. табл. 2.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ социАлистических

РЕСПУбЛИК (51)5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4645651/14 (22) 02.02.89 (46) 15.06.92. Бюл. N 22 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт электрификации сельского хозяйства и МГУ им. M.В. Ломоносова (72) Н, Р. Бородюк. Г.А. Шарков. P.À. Валитов . и А.П. Маник (53) 612.015 (088.8) (56) Жигачева И,В, Активация внешнего пути окисления. M. Автореф. канд,дис. М,: НАДИ, 1976.

Изобретение относится к медицине к сельскому хозяйству и может быть использовано для отбора теплокровных животных. чувствительных к неблагоприятным факторам внешней среды.

Известен способ определения чувствительности живых организмов (растений) к неблагоприятным факторам внешней среды, основанный на факте накопления в организме обработанного растения веществ неизвестной природы, причем,в тем болЯшем количестве, чем более чувствительно растение к данному фактору. Согласно данному техническому решению растения подвергают воздействию неблагоприятным фактором физической либо химической природы, после чего выделяют из обработанного растения фракцию липидов, которую вводят в реакционную смесь. содержащую данную фракцию, фермент, гемолизин, субстрат для него в виде суспензии эритроци1ов. После

„„. Ж„„1741071 Al (54) СПОСОБ ОТБОРА ТЕПЛОКРОВНЫХ

ЖИВОТНЫХ, ЧУВСТВИТЕЛ6НЫХ К НЕБЛАГОПРИЯТНОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ (57) Использование: биология, медицина.

Сущность изобретения: из организма выделяют клетки эритроцитов,. носителей мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы, для разной концентрации ацетилхолина осуществляют реакцию гидролиза, ингибируя ее ингибитором постоянной концентрации.

Рассчитывают константу ингибирования, по которой судят о чувствительности теплокровного животного и биологической системы к неблагоприятному воздействию, ил.1. табл. 2. инкубации реакционной смеси устанавливают скорость реакции гемолиза.

Чем более чувствительно растение к неблагоприятному фактору, тем больше ингибируется реакция гемолиза. Однако данный способ не решает задачи отбора теплокровных животных в группу чувствительных к исследуемому фактору воздействия.

Наиболее близким к предлагаемому является способ отбора животных, чувствительных к низким температурным воздействиям. При этом животных (крыс) подвергают дробнол адаптации к холоду. выделяют митохондрин печени, исследуют скорость окисления субстратов (НАД и ФАД— зависимых) в присутствии ингибиторов ферментативных реакций, регистрируют уровень сопряжения дыхания и фосфорилирования и по степени разобщения .проводят отбор животных в rpynny чувствительных к хододовому воздействию (адап-, 1741071 тированных и неадаптированных животных).

Однако поданному методу отбор проводят не индивидуально, а группой, при этом одно или несколько животных данной группы,декапитируют перед получением препар: та митохондрий.

Целью изобретения является упрощение способа за счет сохранения поголовья экспериментальных животнь1х.

Способ осуществляется следующим образом.

После воздействия исследуемым фактором проводят отбор крови, Выделяют эритроциты и готовят две пары реакционных смесей.

1а. Суспензия эритроцитов; выделенных из организма животного, подвергнутого воздействию неблагоприятного фактора, субстрат для содержащейся в эритроцитах ацетилхолинэстеразы .— ацетилхолиниодид, ингибитор реакции ферментативного гидролиза ацетилхолина (фенантролин).

1б, То же беэ ингибитора.

2а. Суспензия эритроцитов. выделенных из организма животного; не подвергнутого воздействию неблагоприятного фактора, субстрат для содержащейся в зритроцитах ацетилхолинэстеразы — ацетилхолиниодид, ингибитор реакции ферментативного гидролиза ацетилхолина (фенантролин);

26. То же без ингибитора.

Верхний предел концентрации субстрата определяется значением, при котором наблюдается ингибирование активности ацетилхолинзстеразы. Предварительно для ряда концентраций субстрата измеряют скорость гидролизной реакции. По полученным значениям строят зависимость обратной скорости .реакции от обратной концентрации (координаты Лануйвера-Берка) и определяют максимальную скорость реакции гидролиза. Ингибитор добавляют в реакционную смесь в постоянной концентрации. Результатом действия ингибитора считают изменение максимальной скорости реакции.

По значениям максимальных скоростей реакции гидролиза до воздействия ингибитора Wp и при воздействии W(ингибитора и по величине постоянной концентрации вычисляют константу ингибирования К; из выражения

Io

К =

Wo/Wl — 1 где Io — начальная концентрация ингибитора, 10

40 ферментом, отражающим чувствительность

45 организма теплокровных животных к повреждающим факторам. изучили влияние

Wo — максимальная скорость реакции в контроле;

Wi — максимальная скорость реакции при ингибировании.

Константа ингибирования характеризует устойчивость организма к воздействию.

Чем больше константа ингибирования, тем выше устойчивость организма к действию повреждающих факторов, тем ниже его чувствительность к ним.

В качестве ингибитора ферментативной реакции используют диметилдихлорвинил фосфат, фенантролин, хлорофос;

Пример 1, Клетки эритроцитов были приготовлены из 3 мл свежей цитратной крови путем трехразового центрифугирования ее и промывания клеток эритроцитов

0.9%-ным раствором хлористого натрия. В суспензии использовали изотонический раствор хлористого натрия NaCI, в котором растворялся 2,5 мл трисбуфера (рН 8,0, т =

38 С), концентрация клеток эритроцитов

10 — 10 клеток/мл, субстрат — ацетилхоли8 9 ниодид. Общий объем реакционной смеси составлял 5 мл.

Изучили зависимость скорости реакции от концентрации ацетилхолина, которая отражает гидролитическое разрушение субстрата, осуществляемое ацетилхолинэстеразой эритроцитарных клеток при ингибировании каталитической активности. фермента пестицидом фенантролином различной концентрации.

Результаты расчета константы ингибирования ацетилхолинэстеразного фермента клеток эритроцитов трех опытов сведены в табл.1

Из приведенных данных видно, что способ позволяет разделить обследуемых по их чувствительности к повреждающим факторам.

Пример 2. Для подтверждения вывода о том, что ацетилхолинэстераза является трех химических ингибиторов: диметилхлорвинилфосфата (ДДВ Ф) дипиридила, фенантролина — на ацетилхолинэстеразную активность клеток эритроцитов крыс. Для оценки использовали параметр!ьо, определяющий концентрацию препарата, инактивирующего фермент на 507, Этот параметр определяют графически по зависимости относительной активности (соотношения скоростей реакции в присутствии и без препарата Wi/WD) от концентрации препарата. Эта зависимость представлена на чертеже, где кривая 1 соответствует ДДВФ, 1741071

Температурные условия содержания, OC

45 «+ 1 (опыт)

18 — 22 (контроль) 0,80 — 1,26

1,41 — 1,55

Приведенные данные показывают воэможность оценить предложенным способом наличие отрицательной реакции опытной группы крыс на постоянное воздействие неблагоприятного фактора внешней среды (повышенной температуры). Так, в опытной группе значения Ki колебались в пределах 0,80-1,25 мМ. а в контрольной группе эти значения были достоверно выше и колебались в пределах 1,41 — 1,55 MM.

Результаты оценки чувствительности крыс опытной группы к неблагоприятному фактору,- повышенной температуре следующие:. К ° мМ Число животных иэ опытной группы

42

21

10

0,80-0,90

0,91-1,00

1,01-1,10

1,1 t-1,20

1,21-1,30

Приведенные данные показывают, что животных опытной группы можно было разделить на 5 подгрупп по их чувствикривая 2 — дипиридилу, кривая 3 - фенантролину.

Полученные данные свидетельствуют о том, что крысы наиболее чувствительны к фенантролину, менее чувствительны кдипиридилу и практически нечувствительны к ацепоксу.

При сравнительном изучении влияния этих токсикантов на организм крыс были получены такие же результаты (см. табл.2).

Пример 3. Опытную группу крыс содержали в термостатированном помещении при температуре 45 - 1 С в течение 1 мес, контрольную — при температуре 1822 С. Затем у обеих групп крыс. отбирали кровь и определяли константу ингибирования ацетилхолинэстеразы клеток эритроци. тов..Влияние температурных условий содержания крыс на значения константы ингибирования Ki ацетилхолинэстераэы клеток эритроцитов следующее: тельности к неблагоприятному фактору (повышенной температуре) и отобрать подгруппу наиболее чувствительных животных, т.к, 42 иэ них имели наименьшую величину

5 К (0,80 — 0,90 мМ).

Пример 4, Опытную группу крыс содержали в термостатированном помещении при температуре -3 + 1 С в течение 1 мес, контрольную — при температуре 1810 22ОС. Результаты измерения К следующие:

Кь мМ

Температурные условия содержаоС

-3 = - 1 (опыт) 18 — 22 (контроль) 0.90-1,19

1,40-1,52

Приведенные данные показывают, что

20 значения К у животных опытной и контрольной групп различны. Распределение животных опытной группы на подгруппы следующее:

К,мМ

Число животных

Из ОПЫТНОЙ. труппы

64

0,90 — 1,00

1,01 — 1.10

1,11 — 1,20

Приведенные данные показывают, что из 100 опытных животных 22 животных ока35 зались наиболее чувствительными к неблагоприятному фактору (пониженной температуре). о чем свидетельствует самая низкая величина К (0,90 — 1,00 мМ).

Формула изобретения

40 Способ отбора теплокровных животных, чувствительных к неблагоприятному воздействию, путем воздействия исследуемым фактором на животное с последующим выделением биологического материала, ин45 кубацией его в присутствии субстрата и ингибитора, регистрацией активности фермента, сравнением полученного показателя с контролем и отбором животных по результатам сравнения, о т л и ч а ю щ и й50 с я тем, что, с целью упрощения способа эа счет сохранения поголовья животных, в качестве биологического материала используют эритроциты, которые инкубируют в присутствии ацетилхолина и фенантролина, 55 при этом регистрируют активность ацетилхолинэстеразы, 1741071

Таблица 1

Таблица 2

1Ю. 10

4,0

Составитель H.Áîðoäþê

Техред М,Моргентал Корректор А,Ратман

Редак ор М.Циткина

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2083 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5