Способ определения антистрептокиназы

 

Использование: изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественного определения антистрептокиназы в сыворотке крови и медикобиологических препаратах Цель изобретения - повышение точности способа. Сущность способ предусматривает забор крови, выделение сыворотки и инкубирование со стрептокиназой, иммобилизованной на плазминогене, и в твердофазном иммуноферментом анализе устанавливают активность антис фептокиназы по сравнению с контролем По сравнению с прототипом увеличивается точность способа в 5 - 10 раз

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л G 01 N 33/535

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Д.

ЬЗ 4 ,(3

,)

Остальное

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4807389/14 (22) 29.03,90 (46) 23.06.92. Бюл.N 23 (71) Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля биологических медицинских препаратов им.

Л.А.Тарасевича (72) Г.Ф.Шеманова. T.M,Ïîñòíèêîâà, М. М, Немирович-Данченко. Л.К. Берестовая и В.В,Чупов (53) 615,375 (088,8) (56) Инструкции по применению стрептокиназы для диагностических целей сухой, M..

1987.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественного определения антистрептокиназы в сыворотке крови и медикобиологических и репаратах.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Берут кровь, выделяют ее фракции и инкубируют со стрептокиназой, В качестве фракции используют сыворотку. которую инкубируют со стрептокиназой. иммобилизированной на плазминогене, Активность антистрептокиназы устанавливают в сравнении со стандартом с помо цью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), При осуществлении способа ИФА проводят на планшете, который предварительно модифицируют плазминогеном. после чего последовательно наносят стрептокиназу, анализируемую пробу и специфический

» 5U „„1742726 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИСТРЕПТОКИНАЗЫ (57) Использование: изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественного определения антистрептокиназы в сыворотке крови и медикобиологических препаратах. Цель изобретения— повышение точности способа. Сущность: способ предусматривает забор крови, выделение сыворотки и инкубирование со стрептокинаэой, иммобилизованной на плазминогене, и в твердофаэном иммуноферментом анализе устанавливают активность антистрептокиназы по сравнению с контролем; По сравнению с прототипом увеличивается точность способа в 5 — 10 раз. иммунореагент, по степени связывания которого с антистрептокиназой судят о ее содержании.

Пример. В лунки полистироловых планшетов для ИФА вносят по 200 MKfi гГлаэминогена в концентрации 5 мкг/мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ) следующего состав;. мас.%:

Хлористый натрий 0.8

Фосфорнокислый однозамещенный калий 0.02

Фосфорнокислый двузамещенный 12-водный натрий 0.29

Хлористый калий 0.02

Дистиллированная вода рН 7,3, Сенсибилизирэванные планшеты инкубируют при 6 С в и чение 20 ч. после чег

3-кратно отмывают от непрореагировавшего плазминогена этим же буфером.

1742726

Составитель Г. Крюкова

Техред М.Моргентал Корректор Т. Палий

Редактор В. Петраш

Заказ 2281 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Далее планшеты обрабатывают раствором стрептокиназы. Для этого в лунки планшетов вносят по 200 мкл раствора диагностической стрептокиназы в ФСБ при концентрации стрептокиназы 5 ME/мл и инкубируют при 37 С в течение 1,5 ч, Затем планшеты 3-кратно отмывают от непрореагировавшей стрептокиназы ФСБ, дополнительно содержащим 0,5 ф твина-80 (ФСБ-Т), Связывание стрептокиназы с антистрептокиназой осуществляют с использованием разведенных ФСБ-Т 1;1000 контролируемых сывороток крови от трех пациентов (опыт), а также стандартных донорских сывороток с эталонами содержания антистрептокиназы 100, 300, 500 и 960 АЕ, B каждую лунку вносят по 200 мкл указанных проб, При этом для каждого определения используют по 3 лунки с усреднением результатов .

Планшеты инкубируют при 37 С в течение 1 ч, после чго 3-кратно отмывают с помощью ФСБ-T. Далее в лунки вносят по

200 мкл специфического иммунореагента— антител диагностических против иммуноглобулина G человека, меченных пероксидазой хрена, инкубируют при 37 С в течение

1 ч, 5-кратно отмывают БСФ-Т и вносят в лунки при 200 мкл субстрата — раствора 5аминосалициловой кислоты (5-АС), содержащего перекись водорода, Для приготовления субстрата 20 мг 5АС растворяют в 20 мл дистиллированной воды, подогретой до 65 С, и добавляют

2,3 мл 30%-Hîãî HzOz, разведенного из расчета 0,1 мл в 60 мл дистиллированной воды.

Планшеты выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего фотометрируют при длине волны 450 нм, При фотометрировании иэ показаний фотометра вычитают фон (оптическую плотность E4so) реакционной смеси, не содержащей антистрептокиназы, В результате для стандартных образцов.с указанной активностью получают Е4щ, равные 0,17 +. 0,03, 5 0,30 «-0,04, 0,44 +.0,03 и 0,68 0,07соответственно, по которым строят градуировочную кривую.

Для контролируемых проб Едко оказались равными 0,192 + 0,016, 0,344 + 0,009 и

10 0,388 ч- 0,10. Из градуировочного графика установлено, что этим оптическим плотностям соответствуют следующие значения антистрептокиназной активности (АЕ);

136 + 11, 364 + 10 и 440 + 11, При опреде15 лении антистрептокиназной активности тех же проб известным способом получены значения 150 + 50, 400 + 100 и 200 + 100 АЕ соответственно.

Таким образом, по результатам трех па20 раллельных измерений ошибки средних значений в предлагаемом способе составили 10 — 11 АЕ, тогда как в известном они равны 50 — 100 АЕ, т,е. результаты измерений в предлагаемом способе в 5 --10 раз

25 точнее.

Формула изобретения

Способ определения антистрептокиназы, включающий забор крови, выделение фракции и инкубирование со стрептокина30 зой с последующим определением антистрептокиназы по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве фракции крови используют сыворотку, при .35 этом инкубируют ее со стрептокиназой, иммобилизированной на планшете, покрытом плазминогеном с последующим определением концентрации антистрептокиназы методом твердофазного иммуноферментного

40 анализа.