Способ выделения пыльников сои

 

Использование: культивирование клеток и тканей, клеточная биология и инженерия . Сущно сть изобретения: бутоны стерилизуют, гомогенизируют в жидкой среде и отделяют пыльники от соматической ткани путем предварительной фильтрации через сито и последующей флотации. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)э А 01 Н 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ. СССР .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4779473 /13 (22) 09.01,90 (46) 15.07.92. Бюл. N 26 (71) Всероссийский научно-исследовательский ийститут сои (72) В.П.Соловьев (53) 57.086.83(088.8) (56) Polsoni L., Кои L.S,. Beversolort W.Î.

Largescale microspore culture technique for

mutation. — Selection studies fn Brassica

napus. Can. J. Bot., 1988, v. 66, N. 8, р. 16811685, Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии.

Цель изобретения — ускорение процесса выделения и повышение качества пыльников за счет улучшения их очистки.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Растения сои в фазе цветение — начало бобообразования — с корнем помещают в сосуды с жидкой питательной средой Кнопа и выдерживают в холодильнике при 0 — 10 С в течение 3 — 30 дней. При 10-20 С пыльники, достигнув фазы 1-2 ядерных микроспор, останавливаются в своем развитии, эа счет чего в дальнейшем повышается процент формирования каллуса из пыльника, Время температурной предобработки (3-30 дней) обеспечивает достижение фазы 1-2 ядерных микроспор большим количеством пыльников. Затем пинцетом отделяют бутоны и . стерилиэуют их в О, l g-ном растворе Н9С12 в течение 10 мин. После стерилизации всю работу ведут с соблюдением условий асептики. Простерилизованные бутоны дважды

„,5U „, 174695 I А1

2 (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПЫЛЬНИКОВ

СОИ (57) Использование: культивирование клеток и тканей, клеточная биология и инженерия. Сущность изобретения: бутоны стерилизуют, гомогениэируют в жидкой среде и отделяют пыльники от соматической ткани путем предварительной фильтрации через сито и последующей флотации, 1 табл. отмывают в 500 мл дистиллированной стерильной воды, затем помещают в емкость с . жидкостью. осмотическое давление которой близко или равно осмотическому давлению внутри микроспор (5 — 10 атм). например. среда йв с 9 — 12 сахарозы (чтобы не происходило разрушение пыльников) и измельчают с помощью мешалки PT-2 или миксера при 5000 об/мин в течение 10 — 15 мин. Затем отделяют измельченную ткань бутонов от пыльников флотацией, Отделенные пыльники помещают на сито с отверстиями менее 0,1 мм и отмывают от примесей диплоидных клеток бутонов свежей питательнойсредой N6 с 9-127 сахарозы. После этого пыльники используют для посадки в культуру или иных целей.

Пример 1. Выделение пыльников вручную.

- Выделение, посадку пыльников для индукции андрогенеза проводили при помощи препарировальных игл из предварительно. простерилизованных бутонов, (10,.мин в

0,1 ) -ном растворе дихлорида ртутй) в усло- виях асептики по окончании трехкратной

1746951

15

25

35

55 промывки в 500 мл стерильной дистиллированной воды. Полноту извлечения определяли как процентное отношение числа выделенных пыльников к числу бутонов, увеличенному в 10 раз (у сои в бутоне 10 пыльников). Жизнеспособность пыльников при выделении вручную не определяли, так как высокий уровень андрогенеза свиде. тельствует об очень хорошей сохранности клеток пыльников. Загрязненность определяли после проведения посадки на чашки

Петри как процентное отношение числа частиц посторонних тканей к их сумме с числом пыльников. В результате при ручном выделении андрогенез составил 37,0« 3 0 /0, полнота извлечения 89,9+1,8 /. загрязненность 0.9"-0,6%.

Пример 2. Измельчение бутонов и отмывка пыльников на сите, Для выделения пыльников бутоны сои измельчали в PT-2 при 5000 об/мин в течение 10-15 мин, причем измельчение проводили в изоосмотичес ком растворе (например, питательная среда Np). Г!осле измельчения бутонов полученную суспензию пропускали через последовательный ряд сит с отверстиями 0,5, 0.25 и 0.1 мм. При этом на сите 0.5 мм остаются более крупные фрагменты тканей. мешающие последующему разделению соматических тканей и пыльников на сите 0,25 мм. Пыльники, пройдя через верхние сита, задерживаются на сите 0,1 мм после двухкратного пропускания 200 мл свежей среды для удаления мелких фрагментов соматических тканей. После того как высадили выделенные пыльники нэ среду для эндрогенеэа. определяем их загрязненность. а спустя месяц — процент индук ии андрогенеза, Жизнеспособность определяют, окрашивая пыльники амарэнтом. при этом мертвые растительные клетки приобретают красный цвет. а живые клетки не окрашиваются. В результате измельчения и.отмывки пыльников на сите получено: андрогенеэ 3.5+.1,6, полнота извлечения

69.6+ 3.2/, загрязненность 84,4+ 1,2, жизнеспособность 88,4 2,7 /, затраты Времени на извлечении 1000 шт. пыльников

0,3-0.5 ч.

Пример 3. Измельчение бутонов, отмывка пыльников на сите. очистка флотацией, Выделение пыльников нэ сите производят как описано в примере 2„но исключают . длительную отмывку на сите 0,1 мм. Отмывку заменяют флотацией, которую проводят в следующей последовательности. С сита

0,1 мм смывают выделенные пыльники в сосуд для проведения флотации, Смыв пыльников производят свежей изоосмотической средой. После проведения аэрации жидкости ткани бутонов, окруженные.пузырьками воздуха, находятся в поверхностном слое жидкости. После прекращения аэрации происходит оседание отдельных пыльников, тогда как осмотические ткани продолжают оставаться в приповерхностном слое жидкости. В это время удаляют верхний слой жидкости вместе с соматическими тканями. Удаляя избыток среды, доводят концентрацию суспензии до

1000-10000 шт, нэ 1 мл. Затем пипеткой с достаточно широким отверстием на конце отбирают нужное количество и производят рэссев суспензии пыльников по поверхности агариэованной питательной среды Ng для индукции андрогенеза. После посева пыльников производят подсчет процента загрязненности, подсчитывая число пыльников и фрагменты соматической ткани как это описано выше. В результате процент эндрогенезэ 69.9 1,4, загрязненность

36,2- 1,4., жизнеспособность 78,2+ 1,5 затраты времени 0,2-0,4 ч на 1000 пыльников.

Пример 4. Условия по примеру 3. но флотация в дистиллированной воде.

При проведении выделения пыльников с использованием дистиллированной воды для флотации заметных различий не обнаружено. При этом несколько снизиласьзагрязненность и составила 30,3 2,9%, полнота извлечения 69 0 2 8 . жизнеспособность

80,04-3,0, андрогенез 4,5+1,6 . затраты времени 0.2 — 0,4 ч на 1000 пыльников.. Пример 5. Условия по примеру 3, но флотация в питательной среде Гамборга В ..

Достоверных различий между вариантами 3 и 5 нет. В этом случае загрязненность

36;0 2,9 /,, полнота извлечения 71,0+2,9о, андрогенез 3,2+ 1,3;/,, жизнеспособность

70,3+-3,4%, затраты времени 0.2 — 0 4 ч на

1000 пыльников.

Пример б. Условия по примеру 3, но флотация в питательной среде N6.

Выполняют по методике, изложенной в примере 3, с единственным различием — для флотации используют питательную среду

N При этом загрязненность пыльников

31,1- . 2,8%, полнота извлечения 72,7-

2,8, андрогенез 2.8+.1,2%. жизнеспособность 89,7ч-2,27, время выделения 0,2-0,4 ч на 1000.пыльн иков.

Пример 7. Условия по примеру 3, но флотация в физрастворе.

В отличие от предыдущих вариантов, флотацию проводят в физрастворе МаС1. (8,5 г/л), Существенных различий от вариантов

1746951

Сравнительная характеристика различных способов выделения и очистки пыльников сои

Составитель 8.Соловьев

Редактор М.Кобылянская Техред М.Моргентал Корректор М.Демчик

Заказ 2447 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, ЬГосква, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент",.г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

3-6 не наблюдалось, При этом загрязненность пыльников 46,0 2.7, полнота извлечения 67,7» 2.97,, андрогенез 3,3> 1,3, .жизнеспособность 72,2 3,3, затраты времени 0,2 — 0,4 ч на 1000 пыльников.

Формула изобретения

Способ выделения пыльников сои, включающий отбор и стерилизацию бутонов, гомогенизацию их .в жидкой среде и последующее отделение пыльников от соматической ткани, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса выделения и повышения качества пыльников путем

5 улучшения их очистки при сохранении жизнеспособности микроспор, отделение пыльников проводят путем предварительной фильтрации через сито и последующей флотации.