Способ получения полисахаридно-белковой вакцины против neisseria меningiтidis серогруппы в

 

Использование профилактика менинго кокковой инфекции, медицинская биотехнология . Сущность изобретения вакцинный штамм культивируют в жидкой синтетиче ской питательной среде экспоненциальным отливно-доливчым методом К выросшей культуре добавляют цетавлон до конечной концентрации 0,05-0 15% Выдерживают до образования осадка Преципитат отдел я ют центрифугированием и проводят экстра кцию цетавлонового комплекса хлористым кальцием Экстракты многократно обрабатывают этанолом На заключительном этапе экстрагированный комплекс обрабатывают ацетоном, стерилизуют и лиофильно высу шивают. Полученная вакцина может быть использована для вакцинации людей без применения адъюванта 7 табл сл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (ss>s А 61 К 39/095

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

0,130

0.716

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4837952/13 (22) 17.05.90 (46) 30.07.92. Бюл. ¹ 28 (71) Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова и

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.

Г.Н. Габричевского (72) И.А. Баснакьян, Т.А, Артемьева, Н.Н.

Алексахина, В.И. Карабак, В.M. Боровкова, .В;И. Кувакина, А.П. Аллилуев, О,В, Котельникова и И.И. Валериус (56) Заявка ЕП № 0109688, кл. А 61 К 39/095, 1984. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДНО-БЕЛКОВОЙ ВАКЦИ Н Ы ПРОТИВ

NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ В

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения вакцин для профилактики менингококковой инфекции, Известен способ получения вакцин про. тив N. реп!п9ФФз серогруппы В, включающий культивирование штамма в жидкой питательной среде, содержащей природное сырье (гидролизат казеина), в условиях аэрации, отделения культуральной жидкости от бактериальной массы, добавление цетавл она к супернаТанту, экстракцию полисахариднобелкового комплекса хлористым кальцием, обработку этиловым спиртом с последующим отделением полученного комплекса центри. фугированием, лиофилизацией, гельфильтрацией в присутствии в препарате тиомерсала с последующим добавлением к фракции выходящей в свободном объеме дезоксихолата натрия, стерилизацией через мембраны, Ж 1750689 А1 (57) Использование; профилактика менингококковой инфекции, медицинская биотехнология. Сущность изобретения: вакцинный штамм культивируют в жидкой синтетической питательной среде зкспоненциальным отливно-доливчым методом. К выросшей культуре добавляют цетавлон до конечной концентрации 0,05 — 0.157, . Выдерживают до образования осадка, Преципитат отделяют центрифугированием и проводят экстракцию цетавлонового комплекса хлористым кальцием, Экстракты многократно обрабатывают этанолом. На заключительном этапе экстрагированный комплекс обрабатывают ацетоном, стерилизуют и лиофильно высушивают. Полученная вакцина может быть использована для вакцинации авдей без применения адъюванта. 7 табл. осаждением фильтрата этиловым спиртом, приготовлением целевогО продукта — растворения полисахаридно-белкового. комплекса в натрий-фосфатном буфере, в

5%-ном растворе лактозы и Ala(SOn)g.

Состав питательной среды. г/л:

Фосфорнокислый двузамещенный калий 0,230

1-глутаминовая кислота... 0,0013

Цистеин гидрохлорид

Углекислый-кислый натрий 0.842

Гидро кси метил-метил глицин

Сернокислое железо

7-водное 0,0028

Хлористый аммоний 0,500

1750689

0,ОЗОН,О1О

Сернокислый калий 0,048

Раствор хлористого кальция 0,0074% 1 Mfl

Гидролизат казеина 0,020

Хлористый магний

6-водный 0,107

-Глюкоза 7,500

Культйвировайие менингококка простое - неуйравляемое. Цетавлон добавляется до концентрации 1%. Полисахариднобелковый комплекс обрабатывают дважды

3-мя объемами этанола. Полисахариднобелковый комплекс подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом CL 28 и собирают фракцию, входящую в свободном объеме.

Недостатки известйого способа: неуправляемое культивирование не позволяет получать стандартный целевой продукт; необходимость включения в питательную сре"ду природного сырья — гидролизата казеина, загрязняющего препарат немейингококковыми макромолекулярными соединениями; использование двух разных детергентов (цетавлон и дезоксихолат натрия), а также консерванта тиомерсала, от остатков которого нужно избавляться, как от вредной примеси; использование слож: ного и плохо воспроизводимого процесса гел ьфил ьтра ции; низкая активность получаемого препарата и как следствие этого необходимость его введения совместно с адъювантом (гидроокисью алюминия) для

-индукции синтеза антикапсульйых антител, Таким образом, недостатками известного способа является сложность и низкая активность вакцины.

Цель изобретения — упрощение способа и повышение активности вакцины.

Цель достигается тем, что культивиро. вание проводят экспоненциальным отлив— но-даливным методом в жидкой синтетической- питательной среде, содержащей L-глутамат натрия, хлористый калий, хлористый натрий, сернокислый магний 7 водный, фосфорнокислый двузамещенный натрий 12-водный, цитрат натрия трехзамещенный, глюкозу — при следующем содержании компонентов,.г/л:

1=глутамат ййтрия . . 1,300 й0,100

1=цистеин гидрохлорид

Хлористый . калий 0,090+ 0,010

Хлористый натрий 6,000=1,000

1,250+.0,010

0,03 0,010

0,09М,010

6,00+1,000

Сернокислый магний

7-водный 0,060+ 0,010

Хлористый аммоний

5 Фосфорнокислый двузамещенный натрий 12-водный . 2,500+0.200

Цитрат натрия трехзамещенный 0,500 й0,100

1Î Глюкоза . 1,600й0,200 Дистиллирован-. ная аода . До 1,00л

Цетавлон добавляют к выросшей культуре до конечной концентрации 0,05-0,15%, 15 выдерживают до .образования осадка, аналогйчно приведенному выше способу проводят экстракцию хлорйстым кальцием, обработку спиртом осуществляют, добавляя

его в объеме 0,20-0,30 мл в течение 2-4 ч, 20 далее йолученнйй надосадок повторно обрабатывают 0,75-0,85 объема спирта в течение 16-20 ч.

Пример 1. Приготовление синтетической питательной среды.

25 Сухая синтетическая питательная среда и редставляет мелкодисперсный порошок белого цвета. Для приготовления 1 л питательной среды взвешивают (11,75+0,10) r сухой питательной среды следующего соЗО става, г/л, 1=глутамат натрия 1,ЗОБО,100 -цистеин гидрохлорид

3- > Хлорид калия . .

Хлорид натрия

Сернокислый магний

7-водный 0,06+0,010

Хлорид аммония . 1,25М,010

Фосфорнокислый двузамещенный нат-, рий 12-водный ..2,50+0,200

Цитрат натрия трехзамещенный 0,50 +О,100

45 и растворяют в 1,0 л дистиллированной воды, подогревают до полного растворения всех . компонентов, устанавливают рН 7,2-7,3 с помощью 30,0 1,0% НС1, фильтруютчерез батистовый фильтр и разливают мерно в емкости.

Питательйую среду стерилизуат при 112 Ы ОС в течение 30+5 мин. После стерилизации добавляют стерильный раствор 40+1% глюкозы из расчета 4,0М.1 мл на 1,0 л питательной среды. В бутыли в стерильных условиях вставляютсифоны, позволяющие стерильно перекачивать питательную среду в ферментер.

Приготовление посевной культуры, В стерильных условиях вскрывают ампулу с лиофильно высушенной культурой

1750689 менингококка штаммов l4 125 или М 150. 2525% от полного насыщения. Слитую из

Пастеровской пипеткой вносят в амйулу ферментера культуру собирают в стеклян(0,5М,1) мл стерильного (0,85 0,01)% рас- ные сосуды. твора хлорида натрия и полученную взвесь Получение цетавлонового осадка, последовательно рассеивают на 3 чашки с 5 К микробной культуре добавляют све20% сывороточным агаром Хоттингера. По- жеприготовленный 10+1 %-ный раствор цесевы инкубируют при 37+0,5 С в течение тавлона до конечной концентрации

18-20 ч в эксикаторе со свечой. Выросшие 0,10+6,05%. Культуру перемешивают враколонии должны быть в S-форме, прозрач- щением бутыли и оставляют при 20 — 25 С на ные с голубоватым оттенком, с ровными 10 2+0,1ч,3aэто время полисахаридно-белкокраями и гладкой блестящей поверхностью, вый комплекс с цетавлоном выпадает в осане более 2 мм в диаметре. В мазке, окра- док, и одновременно происходит . шенном по Граму в модификации Калины стерилизация культуры под воздействием культура должна представлять собой мел- цетавлона. кие грамотрицательные диплококки; Вы- 15 Получение полуфабриката вакцины. росшая микробная взвесь должна давать: Цетавлоновый осадок отделяют центриположительную реакцию агглютинации на фугйрованием при 4м С при 3000 и 500 стекле с коммерческой сывороткой об/мин втечение30+5мин,промываютдиN.menlngltldls серогруппы В. Культуру, ти- . стиллиоованной водой, при повторном ценпичную по всем показателям, рассеивают 20 трифугировайии, Осадок взвешивают и на 15 чашек или 3 матраца с 20 -ным сыво- сохраняют при -203=2 С. роточным агаром Хоттингера, инкубируют . В дальнейшем осадок Хорошо растира. при 37+0,5 С в течение 18 — 20 ч, смывают ют, переносят в химический-стакан и пристерильным 0,85 0,01%-ным раствором бавляют 1 моль/л раствор CaClz в хлорида натрия и помещают в стерильную 25 соотношении 1:10. Экстракцию проводят в колбу с сифоном и используют в качестве течение 30 -5 мин прй постоянном перемепосевной культуры. " . :.::"....." ...: . шивании на магнигной мешалке. Экстракт

Культивирование в ферментере.:.;. отдел я ют центрифуги рова н ием и ри

Посевную культуру, находящуюся в кол- 6200 100 в течейие 30+5 мин и сливают в . бе с сифоном, присоедийяют к шлангу эаСе- 30 чистый химйческий стакан. Повторяют прова и с помощью резиновой груши через: цесс экстракции, добавляя новую порцию шланг со стерильным фильтром в ней созда- раствора CaClz, Полученные экстракты обьют избыточное давление, позволяющее пе- единяют и добавляют 96+1% этанол до корелить содержимое колбы в ферментер нечной концентраций 25 5%, перемешиВыращиваниекультуры всинтетической пи- .35 вают и оставляют на 18 — 20 ч при 6 С.

: тательной среде проводят при постепенном Выпавший осадок отделяют"на центрифуге увеличении частоты вращения мешалки от " при 6200+100 в течение 30+5 мин и отбра70"-10 об/мин в начале процесса до . сывают. Кнадосадочнойжидкостидобавля(200+10) об/мин в конце экспоненциальной ют 96 1% этанол до конечной фазы роста(к 7-8 ч роста). K 7-8 ч роста, т.e.- 40 концентрации 80 -15%. Смесь перемешива к койцу .экспоненциальной фазы; оптиче- ют и оставляют на 3 -0,1 ч. Выпавший оса- . ская плотность (ОД) достигает значений док отделяют центрифугированием при

1,5+0,2 ед. bio показателяи ФЭК-56М или 2600+100 в течение 30 5 мин. Этот осадок, 46й2 единйц мутйости по стандаРту аптиче. представляющий собой полуфабрикат вакской плотности ГИСК. В этот момент из Фер- 45 цины, отмывают три раза 96й1% этанолом, ментера сливают половину объема культуры . 2 раза ацетоном и высушивают в вакуум-экси доливают свежей питательной среды до икаторе над прокаленнйм CaClz, прежнего обьема. После долива питвтель-:: . Получение вакцины. ной средой ОД становится равной 0,72+0,1 . Готовят 0,2 0,05%-íûé раствор полед. или 23й2 единицы мутности по стандар- 50. уфабриката в 1= -0,1% апирогенном раствотуоптической плотности ГИСК. Через 2 0,5 ре лактозы. для удаления нераствоч оптическая плотность культуры достигает ... рившихся частиц раствор центрифугируют уровня, существовавшего до первого слива при 12000 -1000 об/мин в течение 30="5 культуры. Вновь осуществляют слив поло- мин. Надосадочную жидкость собирают и вины обьема культуры и долив свежей пита- 55 подвергают стерилизующей фильтрации на тельнойсредойдо прежнегообьема,Такйе фильтрах "М1Вроге" с размером пор сливы-доливы производят через каждые 0,45 -0,01 мкм, полученный стерильный 2,0:й9,5 ч, уровень растворенного в средне раствор вакцины разливают по 1,0+0,1 мл в кислорода поддерживают на значениях . стерильные ампулы и лиофильно высушива1750689 ют.Всеэтиработыпроводятссоблодением 54 дня обеспечивала интенсивную индукправил асептики, цию антикапсульных антител, При этом 4Характерйстика вакцины. кратное нарастание титра антител отмечено

Вакцина представляет собой природ- у 62,8+7,5% лиц, получивших 2 инъекции ный комплекс группоспецифического пол- 5 вакцины. Естественное противоэпидимичиисахарида (В-полисахарида) и белков вание обеспечивало аналогичный эффект наружной мембраны менингококков серо- лишь у существенно меньшего количества группы В. Препарат имеет вид рыхлого по- 20,8+8,5% лиц в контрольной группе (p< рошка белого цвета. Выпускается в сухом <0,05). виде в ампулах по 3 — 6 иммунизирующихдоз 10 . Пример 2. Обоснование выбора фазы в пересчете на группоспецифический В- роста культуры менингококка. полисахарид. Вакцина должна полностью Получение культуры в экспоненциальрастворяться при добавленйи(0,85 0,01)% ной фазе роста позволяет сохранять антигеного стерильного раствора хлорида натрия ны в высокомолекулярном состоянии, Зто втечение1+0,5 мин. Раствордолжен пред- 15 показано в следующих опытах, представставлять бесцветную жидкость, опалесци- ленных в табл. 3. рующую, но без видимых включений и Опыт1. Культивированиеменингококка осадка. Остаточная влажность готового про- штамма ЬЬ 125 серогруппы В осуществляли дукта не более 2,5%. Одна иммунизирую- в ферментере экспоненциальным отливнощая доза содержит 85-105 мкг белка и 20 доливным способом, указанным выше в

50-55 мкг сиаловых кислот, Отношение в примере 1, различие состоит в том, что исготовой вакцйне белок/полисахэрид(1:0,6)- пользовали модифицированную полусинте(1:0,7). Вакцинадолжнабытьстерильной,не тическую питательную среду Коэн-Виллер. токсйчной при испытании ее в тестах на Из выращенных культур выделяли группосмышахиморскихсвинках,апирогенной при 25. пецйфический полисахарид по методу внутривенном введении кроликам, Вакцина Gotschflch С.Е,(5) в модификации Кувакиной должна быть иммуногенной для мышей и B,И,. Молекулярную массу полисахаридов вызывать нарастание в сыворотках иммуни- определяли методом гельфильтрации на Се зированных мышей титров специфических фарозе 4В. При анализе профиля элюции

В- антител, выявляемых в РПГА, . 30 этого препарата оказалось, что выход полВ табл. 1 приведены основные характе- исахарида до Kd=-0,25 составил 61%. ристики менингококковой В-вакцины. Опыт 2. Штамм; питательная среда, меКак видно из табл. 1, получейная по тод выделения антйгена и др, полностью. предлагаемому способу вакцина индуциру- соответствуют опыту 1. Отличие состоит в ет образование антикапсульных. антител в 35 том, что процесс культивирования менингосыворотках мышей при однократной имму- кокка вели до начала стационарной фазы низации в отсутствии адьюванта, что не до- роста, Все это повлияло на выход высокомостигалось при использовании способа- лекулярногополисахарида(до Kd=0-25).Он прототипа.. .: . составил — 46%.

Полученная по предлагаемому способу 40 Опыт 3, Он аналогичен опыту 1, отличие вакцина проверена на людях. Под наблюде- в том, что выращивание менингококка осу нием находилось 82 человека в возрасте ществляли до поздней стационарной фазы

19-22 г., из которых 56 были вакцинированы роста. Выход В-полисахарида до Kd=0,25 соподкожно однократно и 43 двукратно. Лица, ставил — 25%. входившие в контрольную группу, получали 45 Таким образом видно, что по мере роста инъекции физиологического- раствора. культуры количество высокомолекулярного

Кровь йз локтевой вены брали до иммуниза- компонента в препаратах В-полисахарида ции, через 10-24 и 54 дня после первой снижалось, что обосновывает целесообразиньекции и спустя 30 дней после 2-ой инъ- ность псчучения культуры в экспоненциаль екции препаратов, т.е. на 85-ый день после 50 ной фазе роста; поскольку высокомолекупервой инъекции. Сыворотки отсасывали и лярный полисахарид более иммуногенен. исследовалй в. реакции. пассивной гемагг- Пример 3. Обоснование использовалютинации (РПГА), используя в качестве ди- ния синтетической питательной среды. агностикума эритроциты человека с группой Выращивание менингококка осуществкрови -(О), сенсибилизированные высоко- 55 ляли в двух средах: синтетической и полочищенным капсульным"полисахарйдом ме- усинтетической — Коэн-Виллер способом, нингококков группы В,: . указанным в примере 1. Способ выделения

Как видно из табл; 2, двукратная инъек- полисахаридно-белкового комплекса также ция разработанной вакцины с интервалом в аналогичен способу, указанному в примере .

1750689

1. Сравнительный анализ выхода комплекса показал преимущества использования синтетической питательной среды.

B табл. 4 приведены данные, свидетельствующие о преимуществах использования синтетической среды при получении полуфабриката вакцины.

Пример 4. Определение оптимальной концентрации цетавлона.

Штамм, питательная среда, выращива.ние менингококка, сбор культуры аналогичны примеру 1; Для определения . оптимальной концентрации цетавлона; добавляемого в культуру, использовали следующие растворы цетавлона — 0,01%-ный, 0,05%-ный, 0.,10%-ный, 0,15%-ный, 0,50%ный.

В табл. 5 приведены данные по обработке культуры разным количеством цетавлона; свидетельствующие о том, что 0,10й0,05% является минимальной концентрацией цетавлона, обеспечивающей гибель менингококков и формирование осадка в течение 2

Ч.

Пример 5, Определение оптимальных условий обработки этанолом для выделения полисахаридно-белкового комплекса.

Штамм, питательная среда, способ культивирования менингококка, получение цетавлонового осадка, выделение из него экстракта аналогичны примеру 1. Для определения оптимальных условий обработки этанолом полученных экстрактов использовали различные концентрации при однократной и двукратной обработке.

B табл. 6 приведены результаты определения условий обработкй этанолом, из которых следует (опыт 4), что предварительная обработка экстракта (20 -5)% этан олом с последующим удалением осадка значительно повышает растворимость препарата, и -при этом не происходит потеря сиаловой кислоты (капсульного полисахарида).

Таким образом, предлагаемый способ обладает .новизной, заключающейся в использовании для получения биомассы управляемого отливно-доливного экспоненциального способа культивирования менингококка в синтетической питательной среде, Существенные отличия заключаются в использовании для обработки цетавлоном цельной культуры, минимальных концейтраций цетавлона (0,10.+0,05%) и предвари- тельном удалении из соловых полисахаридно-белковых экстрактов фракций, осаждаемых 25% этан алом.

Положительный эффект состоит в значительном упрощении способа получения противоменингококковой вакцины (табл. 7), 45 которая в отличие от прототипа индуцирует синтез антикапсульных антител у животных в отсутствии адьюванта. Предложенный способ позволил получить препарат, у кото5 рого, в отличие от ранее предлагавшихся препаратов, достоверно зарегистрирована способность к индукции антикапсульных антйтел у человека без применения ионов металла.

10 Формула изобретения

Способ получения полисахаридно-бел.ковой вакцины против Neisserla

rnenlngitidls серогруппы В, включающий

- культивирование штамма в условиях аэра15 ции в жидкой синтетической питательной среде, содержащей L-цистеин гидрохлорид, глюкозу, хлористый аммоний и дистиллированную воду, сбор культуры, добавление цетавлона, отделение осадка, экстракцию

20 полисахаридно-белкового комплекса хлористым кальцием, многократную обработку экстракта 96 -ным этиловым спиртом с последующим отделейиеа полученного комплекса центрифугйрованием, стерилизацией

25 и лиофилизацией целевого продукта, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повйшения активности вакцины, культивироваййе проводят экспоненциальным отливно-доливным методом в жидкой

30 питательной среде, дополнительно содержащей 1.-глутамат натрия, хлористый калий, хлористый натрий, сернокислый магний се.миводный, фосфорнокислый двузамещенный натрйй двенадцативодный и цитрат

35 натрия трехзамещеййый при следующем содержании компойентов, г/л:

1=глутамат натрия 1,2 — 1,4

)=цистеин гидрохлорид 0,02-0,04

40 Хлористый калий 0,09-0,1

Хлористый натрий 5 — 7

Сернокислый магний семиводный - 0,05 — 0,07

Хлористый аммоний 1,24-1,26

Фосфорнокислый . двузамещенный натрий двенадцативодный 2,3 — 2.7

Цитрат натрия трех50 . замещенный 0,4 — 0,6

Глюкоза 1,4 — 1,8

Дистиллированная вода До 1л цетавлон добавляют до конечной концент55 рации 0,05 — 0,15 об.%, обработку экстракта спиртом осуществляют последовательно при объемном соотношении экстракта и спирта 1:0,2 — 1:0,3 соответственно, а затем — при объемном соотношении 1:0,75 — 1:0,85 соответственно в течение 16-20 ч, 1750689

Таблица 1

ХарактерйсттиькТа препарата белково-полисахаридной

"менингококковой В-вакцины

-* Минимальнаья активная концтент»рация достаточна«я 4IIA сенсибилизации эригроцитов в реакции пассивной гемагглк)тинации. таблм це 2 динамика тмтрое антител ° . Рпгд к капсульнону полисахариду N.аептлВЫоье группе 0 у людей

«ьЙъ«»»««у»т» .. Сроки исследоаалил Обследоааниал группа по отноеенню к аак цннации

jI й»»»»»»»»»»» ь аспределение людей по титрам

1180 11160 1;320 1:640 Фз1280 и

awe

» ° «»

Всего с 4-кратним нарас» танкан по отноиенню K исподним

»

Абст Ф йе

Опитмал ... 56 24 . 20 9 3 О «««1 ч»Ъ 4»»

Статистически значимое уееличанме no cpàâíån»n e контролем прм рай,001

Комтрольнал

Через 10 дней " .Опитмьй

Комтрольнал

Череэ 24 дмл Опитнал" :.

Контрольнал .Через 54 днл . Опитйал (до 2 инъекции) Комтрольмал

Чераа 85 днай Опмтнал (черве 39 дней после 2 инъекции) 26 11 7 .- 8 О 0

54 . " 33 .," 14 3 ."3: 1 " 4 . 7,4 03,4

25 " 20 4 Т О О О," 0

56, 22 18 14 1 . 1 4 7,1+3;3

25-; - 16 5 4 0:: :0 0: О

53, .:, 2 13., 32 . 6 "0 18 34,006,6 26 : 3 B ll 3 "" 1 6 : 23,1+8,4 43 . 1 . . 1." 17 18 .6 . 270 62,8.+7,5

24 3 5"- 9, . 5: 2 5 20,8 8,5

1750689

Таблиц» 3

Влияние фазы роста культуры N. meningltldls серогруппы 8 на выход высокомолекулярного полисахарида

Таблица 4

Сравнительный выход природного комплекса специфического полисахарида и белков наружной мембраны N. meriingitidis . серогруппы 8 штамма N. 125 при вйращивании в ферментере до конца экспоненциальной фазы роста в различных жидких питательных средах.

Табл ица "5

Определение оптимальнОй концентрации цетавлона

1750689

15

Таблица 6

Определение оптимальных условий обработки зтанолом

Та 6 ли ц,а 7

Сравнение спосоча получения полисахаридно-белкового комплекса менингококка серогруппы В

Стадия Стадия

Способ 1

Мотеле С, 1984

Способ 2 предлагаемый

И 125 (тип 20)

Синтетическая

С И 7619 (2а) 7622 (тип 6)

Содержит природное сырье

Штамм

Питательная среда

Процесс культи-. вирования

Управляемый экспоненциальный отливно-"доливной

Неуправляемый

Неопределенная

Экспоненциальная

Фаза роста

Культуральный супернатант

1л-ный цетавлон; 0,5 ч

3 объема, ч; 0 С, 0,75 объема

5 Осаждение цетавлоном

6 Обработка эта. иолом

Подготовка к:. гельфильтрации

Нет

Гельфнльтрация через Сефароэу

СЬ 2В

Есть

Подготовка к стерилизации

Нет

При готовленне препарата в стерильных условиях

Нет

Синтез антикапсульных антител в отсутствии . адъюванта;.

Есть

Составитель В.Романова

Техред М,Моргентал Корректор В.Гирняк

Редактор M.Òîâòèí

Заказ 2639 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Растворение в 0,11 М ацетате аммония, содержащем 0,013-ный мертиолат. Обработка ультразвуком - 10 мий. Центрифугирование при 2000-20 мин

Добавление дезоксихолата натрия 0,1л-ного (вес/объем) до рН 8"9

К раствору содержащему

1О мкг комплекса добавляют

0,01 М Фосфат натрия до рН7,4 и 0,000! М Alp(SOq)g

Нет

Цельная культура 0,13 цетавлона; 2 ч

0,25 объема, 3 ч

0 80 объема 18 ч

Нет