Полисахарид neisseria meningitidis с модифицированной группой b, конъюгированный антиген, вакцина против менингита группы b и способ индукции ответа антител к менингиту группы b

 

Использование: биотехнология, микробиология, вакцина, полисахарид, менингит. Сущность изобретения: полисахарид Neisseria meningitidis группы В (ГВМП), модифицированный путем замещения N-ацетильных групп остатка сиаловой кислоты на С₄ - С₈-ацильные группы, демонстрирует повышенный иммунный ответ. Кроме того, сведена к минимуму индукция антител, которые перекрестно взаимодействуют с немодифицированным группы В менингококковым капсульным полисахаридом и другими тканевыми клетками, имеющими простой эпитоп. Конъюгация модифицированного полисахарида с физиологически приемлемым белком, таким как стобнячный анатоксин, индуцирует производство специфических защитных антител с незначительными уровнями ГВМП - перекрестно реагирующих антител, тем самым осуществляя защиту против инфекций, вызываемых менингококком группы В. 4 с. и 14 з.п. ф-лы, 5 табл. 1 пр.

Изобретение относится к химически модифицировнным полисахаридам группы B Neisseria meningitidis. Изобретение также обеспечивает вакцины, в которых соответствующим образом модифицированные полисахариды связаны с белковым носителем.

Менингит, вызываемый N.meningitidis группы B и E.coli KI, остается основной проблемой мирового здравоохранения. Менингит группы B встречается как в эндемической, так и в эпидемической ситуациях и составляет приблизительно половину всех зарегистрированных случаев менингококкового менингита, в то время как KI-положительные E.coli являются основной причиной менингита у новорожденных. В настоящее время не существует вакцины, коммерчески приемлемой против болезни, вызываемой менингококком группы B и E.coli KI. Она в значительной степени обусловлена тем фактом, то менингококковый полисахарид группы B /ГВМП/ является лишь слабо иммуногенным у людей. Недавно сообщалось о кандидатах-вакцинах на основе комплексов ГВМП с наружными белками мембраны, но пока не существует явным данных об их эффективности для человека.

Недавно разработана новая концепция вакцины на основе синтетического химического модифицированного N-пропионилированный группы B полисахарид-белок конъюгата /N-Пр-ГВМП-белок/. Вакцина вызывает у мышей высокие титры IgG антител, которые являются не только защитными, но также перекрестно взаимодействуют с немодифицированным ГВМП /т. е. N-ацетил-ГВМП/. Эта концепция описана и заявлена в пат. США N 4727136, выданном 23, 1988 Harold J.Jennings et al.

Это означает, что вакцина, которая увеличивает перекрестно-реагирующие антитела (пат. США N 4727136), может быть успешной за счет разрушения иммунной толерантности. Эта гипотеза легитимизирована путем идентификации обычного эпитопа, состоящего из цепи α -2-8-связанных остатков сиаловой кислоты /с минимальным требованием десяти остатков/ как в нативном N-Ац-ГВМП, так и в ткани человека и животного (Jennings, Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger, 1989, Vol. 10, 151-154). Эти полисиаловые цепи функционируют как эволюционные антитела и в значительной степени связаны с зародышевым состоянием при соединении эмбриональной нервной клетки (Finne et al. Biochem. B, iophys. Res. Commun. 1983, 112, 482). В течение постнатального созревания этот антиген плохо контролируем (Friedlander et al, Cell Biol. 1985, 101, 412), но этот антиген проявляется у развивавшихся людей во время регенерации больных мышц. (Cashman et al, Ann. Neuron. 1987, 21, 481) в опухолевых клетках /Roth et al, Proc. Natl, Acad. Sci, 1988, 85, 299/ и в природных клетках-киллерах /ПК/ и CD3⁺ T клетках /Husmann et al, Eur. J/ Immenol. 1989,19 1961/. Хотя последовательности разрушения толерантности для этих зародышевых антигенов все еще не установлены, обычно допускают, что из-за этого перекрестного взаимодействия N-Пр-ГВМП-белок конъюгат должен быть внимательно рассмотрен лицензирующими агенствами, что приводит к значительному удорожанию и задержкам из-за необходимости комплексного проведения эксперимента для того, чтобы доказать безопасность вакцины до ее одобрения для коммерческого маркетинга.

Целью изобретения является разработка вакцины, имеющей иммуногенные свойства, которые повышены по сравнению с иммуногенными свойствами N-Пр-ГВМП-белок. Также целью изобретения является разработка вакцины, которая демонстрирует существенно уменьшенное перекрестное взаимодействие по отношению к антигену сращивания нервных клеток человека и животного /зародышевый N-САМ/.

Одним из аспектов изобретения является разработка модифицированного B полисахарида Neisseria meningitidis, в котором N-ацетильные /C₂/ группы остатка сиаловой кислоты замещены C₄-C₈-ацильной группой.

Другой аспект заключается в разработке антигенного конъюгата, включающего N-C₄-C₈-ацильный полисахарид, связанный с иммунологическим приемлемым белком, и этот конъюгат имеет повышенную иммуногенность со значительно уменьшенным индуцированием перекрестно реагирующих антител.

Еще одним аспектом является разработка вакцины, включающей N-C₄-C₈-ацил полисахарид-белок конъюгат в ассоциации с приемлемым носителем или разбавителем. Вакцины данного изобретения также включают терапевтически эффективное количество адъюванта, приемлемого для использования человека, например фосфат алюминия или гидроксид алюминия.

Следующим аспектом является разработка способа иммунизации млекопитающих против N. meningitis и E.coli KI инфекций, и этот способ включает введение парентерально млекопитающему объекту с такими инфекциями, включая человека, иммунологически достаточного количества вакцины изобретения. Вакцину обычно вводят в количестве от около 1 до 50 мкг на 1 кг веса тела, например от 5 до 25 мкг на 1 кг веса тела.

Еще одним аспектом изобретения является разработка гамма-глобулиновой фракции, способной защитить от менингита, вызываемого группой B N.meningitis и E.coli KI. Фракцию получают путем иммунизации млекопитающего вакциной изобретения. Фракцию затем вводят индивидууму, чтобы получить защиту против или обработать продвигающуюся инфекцию, вызванную вышеуказанными организмами. Исходя из этого, следует отдать должное, что иммуногенные вакциновые конъюгаты данного изобретения следует рассматривать в качестве источника терапевтической иммунной сыворотки в свете их благоприятной иммуногенности с минимальным индуцированием антител, перекрестно взаимодействующих с антигеном зародышевой N-САМ сращивания нервных клеток человека и животного.

Конъюгаты изобретения могут быть также полезны для выращивания моноклональных антител и, возможно, антидиотипных антител.

В наших недавних экспериментах установлено, что большинство из бактерицидных и защитных антител, индуцированных при помощи N-Пр-ГВМП-белок конъюгата, описанного в вышеупомянутом пат. США 4727136 Tenninigs et al. не связаны с зародышевыми N-САМ перекрестно реагирующими антителами.

В действительности большая часть защитной активности заключена в специфической популяции антител N-Пр-ГВМП, которая перекрестно не взаимодействует с зародышевым N-САМ. В свете этого считают, что N-Пр-ГВМП имитирует уникальный бактерицидный эпитоп на поверхности менингококка группы B.

Изобретение основывается на открытии того, что возможно синтезировать химически модифицированные ГВМП-ы, которые имитируют бактерицидный эпитоп, и которые в своей связанной форме не только демонстрируют повышенную иммуногенность, но также избегают значительного индуцирования антител, которые перекрестно взаимодействуют с зародышевым N-САМ.

В результате данного изобретения ряд различных химически модифицированных ГВМП был синтезирован и индивидуально связан с белком, с последующей инъекцией конъюгатов мышам, и изучены их воздействия по сравнению с воздействием, полученным путем N-Пр-ГВМП белкового конъюгата. Неожиданно установлено, что N-C₄-C₈-ацил ГВМП-белок конъюгаты, например, н-бутанол, изо-бутанол, н-пентаноил, изо-пентаноил, нео-пентаноил, гексаноил, гептаноил, и октаноил, и особенно N-бутаноил /N-Бу/ ГВМП-белок конъюгат, в основном имитирует бактерицидный эпитоп со значительно уменьшенным индуцированием перекрестно, реагирующих антител.

Менингококковый полисахарид группы B выделяют из N.meningitidis с помощью способов, известных в данной области техники. В одном из таких способов, менингококк группы B /штамм 981B/ выращивают при 37^oC в ферментере, используя 50 г дегидратированного Todd Hewitt Broth /Difco Laboratories, Detroit, Michigan/ на литр дистиллированной воды. До роста в ферментере лиофилизованный штамм выращивают сначала в керамическом сосуде при 37^oC на пластинах на 5% /об./об/ кровяном агаре овцы (Difco-Laboratories, Detroit, Michigan). Бактерии затем переносят в 1,0 л Todd Hewitt Broth /как вышеупомянуто/ в сосуд EtIenmeyer, который подвергают вибрации при 37^oC в течение 7 ч при 190 об. /мин. Этот инокулят затем переносят в ферментер. После роста в ферментере /16 ч/ бактерии убивают добавлением формалина до конечной концентрации 0,75% Бактерии удаляют непрерывным центрифугированием, и менингококковый полисахарид группы B выделяют из супернатанта и очищают, в основном, как описано Bundli et al, J.Biol. Chem, 249, 4797-4801 /1974/ за исключением того, что белок экстрагируют при перемешивании раствора неочищенного полисахарида с холодным (4^oC) 90% фенолом вместо горячего (50-60^oC). Последний способ обеспечивает получение высокомолекулярной формы ГВМП.

E. coli /018:KI:H7/ (NRCC 4283) выращивают при 37^oC в ферментере в дистиллированной воде, содержащей дегидратированный Brain Heart Infusion /BH1; 37 г/л/ /Difco Laboratories, Detroit, Michigan/. До роста в ферментере лиофилизованный штамм выращивают на 50 мл BHI раствора (тот же вышеупомянутый) в колбе Erlenmeyer, который подвергают вибрации при 200 об./мин при 37^oC в течение 7 ч. Это содержимое затем переносят в 1,5 л BHI /вышеупомянутый/ и выращивают при тех же самых условиях, как описано выше, в течение 7 ч. Инокулят затем переносят в ферментер.

Методики, используемые для выделения и очистки капсулярного полисахарида E.coli KI, были идентичными методикам, описанным выше для выделения менингококкового полисахарида группы B.

Следует отметить, что могут быть использованы не только вышеупомянтые методики по выделению и очистке, но и другие опубликованные методики являются приемлемыми, например методики, описанные Watson et al. J. Immunol. 81, 331 (1958) и в вышеупомянутом пат. США 4727136.

Нативный полисахарид N-деацетилируют, чтобы получить реакционноспособную аминную группу в сиаловых кислотных остатках молекулы. N-ацетилирование осуществляют любым известным способом, например в основной водной среде при повышенных температурах, например от около 90 до 110^oC, и при pH от около 13 до 14. Основная водная среда обычно представляет собой водный раствор гидроксида щелочного металла, например гидроксида натрия при около 2М концентрации. Или же, гидразин в водном растворе может быть использован. Степень N-деацетилирования можно варьировать от около 30 до 100% в зависимости от условий. Предпочтительнее достижение от около 90 до 100% N-деацитилирования. N-деацетилированный продукт можно выделять, например, путем охлаждения, нейтрализации, очистки, если требуется, и лиофилизации.

До процедуры N-деацетилирования нативный полисахарид имеет среднюю мол. м. в области от около 500000 до 800000 дальтон. В результате N-деацетилирования получают фрагменты полисахарида, имеющие среднюю мол. м. в пределах от около 10000 до 50000 дальтон.

N-деацетилированные полисахаридные фрагменты затем N-ацилируют, чтобы получить соответствующий N-ацилированный продукт. N-ацилирование может быть осуществлено путем растворения N-деацетилированного полисахарида в водной среде, имеющей pH от около 7,5 до 9, с последующим добавлением соответствующего ацилангидрида, произвольно со спиртом для увеличения растворимости, и охлаждением до ниже 10^oC до тех пор, пока реакция не завершится. Реакционную среду можно очистить при желании, например, путем диализа, и затем N-ацилированный продукт выделяют обычно лиофилизацией. Реакция в основном завершается в течение около от 10 до 20 ч. Степень N-ацилирования, измеряемая аналитическими методами, обычно ¹H-ЯМР, составляет по крайней мере 90% и, вероятно, близко 100% Реакция N-ацилирования не приводит к какому-либо уменьшению молекулярной массы фрагментов.

Предпочтительно, согласно изобретению выбрать для цели связывания N-ацилированное вещество, имеющее среднюю молекулярную массу, соответствующую от около 30 до 200 сиаловых кислотных остатков. Это обычно достигается посредством гель-фильтрации N-ацилированного ГВМП, используя Ultragel /торговая марка/ АсА 44 /бусинки диаметром 60-140 мкм/ колонку, используя ФБС в качестве элюента, или же можно использовать приемлемого размера мембрану.

N-ацилированное вещество средней мол. м. от 10000 до 40000 дальтон, например от 10000 до 15000 дальтон, используют в данном изобретении. Его получают путем сбора фракций элюата колонки, содержащей N-ацилированное ГВМП вещество, имеющее диапазон средней молекулярной массы. N-ацилированное вещество с более высокой средней молекулярной массой, например в диапазоне от 30000 до 40000 дальтон, как доказано тоже является пригодным для данного изобретения.

Вакцины изобретения получают связыванием N-ацилированного полисахарида с иммунологически приемлемым носителем-белком. Предпочтительно, чтобы белковый носитель сам по себе являлся иммуногеном. Примерами приемлемых белковых носителей являются столбнячный анатоксин, дифтерийный токсоид, перекрестнореагирующее вещества /CRM_s/, предпочтительно CRM₁₉₇, получаемые из Sclavo Ltd. Siena, Italy, и бактериальные белковые носители, например, менингококковые белки наружной мембраны.

Любой способ связывания может быть использован, для того чтобы связать фрагменты модифицированного полисахарида с белковым носителем. Предпочтительным способом является способ, описанный в пат. США 4356170, т.е. путем введения концевых альдегидных групп /посредством окисления цис-вицинальных гидроксильных групп/ в N-ацилированный полисахарид и связывания альдегидных групп амино группами белка путем восстановительного аминирования. Полисархаид и белок при этом связываются посредством -CH₂-NH-белок связи.

Следует понимать, однако, что связанные вакцины изобретения не ограничиваются вакцинами, полученными посредством восстановительного аминирования. Так, вакцины могут быть получены связыванием N-ацилированного полисахарида с белковым носителем, используя адипиновый дигидразидный спейсер, как описано Schneerson. R, et al, Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilus influenzae type b Polysaccharide-Protein Conjugates, T.Exp.Med.

1952, 361-476/1980/, и в пат. США 4644059 Lance K.Gordon. Кроме того, можно использовать бинарную спейсерную методику, разработанную Merck, как описано Marburg, S, et al. "Biomolecular Chemistry of Marcomolecules: Synthesis of Bacterial Polysaccharide Conjugates with Neisseria meningitidis Membrane Protein, T.Am.Chem.Soc. 108, 5282-5287 /1986/ или, возможно, методологию восстановления концов, упомянутую Anderson в пат. США 4673574.

Полученные N-ацилированные полисахарид-белок конъюгаты не обладают сильной трехмерной структурой и являются растворимыми в водных растворах. Это делает конъюгаты изобретения хорошими претендентами для использования в качестве вакцин.

Полученные N-ацилированные полисахарид-белок конъюгаты изобретения были испытаны in vitro тестах на мышах и в большинстве случаях, как было показано, обладает повышенными иммуногенными свойствами по сравнению с N-пропионилированный полисахарид. Кроме того, наблюдается значительное уменьшение образования перекрестнореагирующих антител. В свете этого считают, что вакцины данного изобретения будут полезными против менингита, вызываемого N. meningitidis группы B или E.coli K1 организмами. Особый интерес представляют вакцины для защиты младенцев человека, которые наиболее чувствительны к бактериальному менингиту.

Вакцины данного изобретения обычно формируют путем диспергирования конъюгата в любом приемлемом фармацевтически пригодном носителе, такие как физиологические соляные или другие инъекцируемые жидкости. Вакцину вводят парентерально, например подкожно, внутрибрюшинно или внутримышечно. В вакцинах могут присутствовать общепринятые добавки, например стабилизаторы, такие как лактоза или сорбитол и адъюванты, такие как фосфат алюминия, гидроксид алюминия, или сульфат алюминия.

Приемлемая доза вакцины для младенца человека, в большинстве случаев, находится в диапазоне от около 5 до 25 мкг или от около 1 до 10 мкг на 1 кг веса тела.

Изобретение иллюстрируется следующими неограничивающими его примерами. N-ацетил, N-пропионил, N-бутаноил, N-изобутаноил, N-пентаноил и N-гексаноил-ГВМП-белок конъюгаты были получены с целью оценки, и результаты обслуживаются в примерах.

Вещества и способы получения конъюгатов.

a/ Вещества.

Пропионовый, бутановый, изобутановый, пентановый и гексановый ангидриды наряду с коломиновой кислотой получены от Sigma Chemicals Co. St.Louis, Mo. Так как коломиновая кислота структурно идентична менингококковому полисахариду группы B /ГВМП/, ее называют впредь как ГВМП. Столбнячный анатоксин /СА/ получают от Armand Frappier, Laval, Quebec, и его мономерную форму, используемую по всех конъюгатах, получают путем пропускания вышеупомянутого приготовления через BiO-Gel /торговая марка/ A 0,5 /200-400 меш/ колонку /1,6х90 см/ /BiO-Rad, Richmond, CA/, уравновешенную и элюируемую 0,01 М фосфатным буферным физиологическим соляным раствором /ФВС/ (pH 7,4).

b) N-деацетилирование ГВМЦ.

ГВМЦ (Na⁺ соль) (1,0 г) растворяют в 5 мл 2 М NaOH и после добавления NaBH₄ /150 мг/ раствор нагревают при 110^oC в течение 6 ч в контейнере (6 мл), закрытом крышкой Teflon/торговая марка/. Эта методика в основном описана в J.Immunol. 134, 2651 (1985) и пат. США 4727136, Harold. J.Tennings et al. Охлажденный разбавленный раствор затем исчерпывающе диализуют против дистиллированной воды при 4^oC и лиофилизуют. Тот факт, что N-диацетилированный ГВМП получают, определяют по отсутствию метилацетамидо сигнала /синглет при дельта 2,07/ в ¹H-ЯМР спектре N-деацетилированного ГВМП.

c) N-ацилирование ГВМП.

N-деацетилированный ГВМП /1,0 г/ растворяют в 50 мл 5% водного NaHCO₃. К пяти отдельным аликвотным пробам /10 мл вышеуказанного раствора/ добавляют либо пропионовый, бутановый, изобутановый, пентановый или гексановый ангидриды.

Эти реагенты добавляют в 3х 0,5 мл аликвотах в течение 3 ч при комнатной температуре, в то время как раствор поддерживают при pH 8,0 с помощью 0,5 N NaOH. Метанол (0,05 мл) добавляют одновременно с каждым добавлением ангидрида в порядке увеличения их растворимости. Наконец, растворы перемешивают в течение 16 ч при 4^oC, исчерпывающе диализуют против дистиллированной воды при 4^oC и лиофизилуют. N-пропионолировнный, N-бутаноилированный, N-изобутаноилированный, N-пентаноилированный и N-гексаноилированный ГВМП получают с выходами свыше 90% В каждом случае, полное N-ацилирование подтверждают исчезновением в соответствующем ¹H-ЯРМ спектре N-деацетилированного ГВМП.

d) Сортировка по размерам фрагментов различных N-ацилированных ГВМП.

Для получения N ацилированного ГВМП вещества с требуемой средней молекулярной массой используют гель-фильтрацию, применяя Ultragel /торговая марка АсА 44 /бусинка диаметром 60 140 мкм /колонку/ IBF Biotechnics, Savahe, MD/ с ФБС в качестве элюента. Фракции, элюирующие из колонки или K_D 0,5 до K_D 0,7, измеряемые с помощью FLPC /смотри ниже/, собирают, диализуют и лиофилизуют. Эта область K_D значений соответствует N-ацилированному ГВМП с приблизительно 30 50 сиаловыми кислотными остатками /10000 15000 дальтон, обычно 12000 дальтон средняя молекулярная масса/. Фракции в диапазоне от K_D 0,2 до 0,4, соответствующие фрагментам, имеющим среднюю молекулярную массу в диапазоне от 30000 до 40000 дальтон, также были собраны и связаны. Так, N-ацилированное вещество, элюирующее в K_D диапазоне от 0,2 до 0,7, представляет особый интерес.

Конъюгаты полисахарида.

Концевые альдегидные группы вводят в N-ацилированный ГВМП путем окисления периодатом (см. пат. США 4356170/.

Вышеупомянутые N-ацилированные ГВМП фрагменты окисляют в 0,1 М водном NalO₄ /натрий метапериодат/ /10 мл/ в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте. Избыток периодата затем разрушают добавлением 1 мл этиленгликоля и раствор затем исчерпывающе диализуют при 4^oC и лиофилизуют. Использование NaBH₄ в процедуре N-деацетилирования (за исключением ГВМП) приводит к трансформированию концевых восстанавливающих сиаловых кислотных остатков каждого из N-ацилированного ГВМП, открывая цепные полиольные остатки. Этот тип остатка является чувствительным к периодату (см. J.Immunol, 127 1011/1981/и пат. США 4356170 Harolol. J. Jenninds et al/, тем самым приводя к введению альдегидных групп в N-ацилированные ГВМП фрагменты в оба конца. Окисленные фрагменты /100 мг/ растворяют в 0,1 М NaHCO₃ /pH 8,1/ буфер /2 мл/ и CA /20 мг/ добавляют к раствору. Наконец, после добавления натрийцианборгидрида /NaCNBH₃/ /40 мг/ раствор осторожно перемешивают при комнатной температуре. За ходом связывания следят с помощью FPLC, используя гель-фильтрационную колонку, содержащую Superose /торговая марка/ 12 HR10/30 / Pharmacia/ при скорости при 1 мл/мин в ФБС буфере фрагменты контролируют при 214 нм. Фрагменты имели K_D 0,6, CA имеет K_D 0,39 и конъюгаты имели K_D 0,23. Связывание заканчивают, когда весь CA бывает израсходованным, как определяют по потери пика в FPLC хроматограмме, соответствующей компоненту при K_D 0,39. В большинстве случаев связывание завершается в 2 дня, но его продолжают в течение суммарного времени реакции 4 дня. Потенциально непрореагировавшие альдегидные группы в конечном итоге восстанавливают натрий боргидридом /20 мг/ до гельфильтрации.

Полисахарид-CA конъюгаты отделяют от полисахаридных фрагментов с помощью гель-фильтрации, используя BiO Gel A колонку с ФБС в качестве элюента. Элюант, содержащий конъюгат, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. N-ацилированный ГВМП-CA конъюгаты содержат 12 30% обычно 12 20% сиаловой кислоты, как определено по резорционовому способу, описанному Svennerholm, L. Quantitative Estimation of Sialic Acids, IIA, Colorimetric Resorcinol Hydrochloric Acid Method, Biochem. Biophys. Acta 24, 604 /1957/. Это указывает, что конъюгаты имеют молярное отношение полисахарида к CA 2-3:1 соответственно.

Иммунизация и иммуноанализ.

a) Методики иммунизации.

Двадцать самок белых CFI мышей /в возрасте 8 10 недель/ иммунизируют внутрибрюшинно /3 раза с интервалами в 3 недели/ каждым индивидуальным N-ацилированным ГВМП-CA конъюгантом в Freuds полном адъюванте /FПА/ Difco, Detroit, MI/. Каждая иммунизация содержит конъюгат /10 12 мкг/, что соответствует 2 мкг сиаловой кислоты. Через 11 дней после третьей инъекции мышей обескровливают. Следующие тесты делают на иммунных сыворотках.

b) Радиоактивный анализ связывания антигена.

Этот анализ проводят путем модификации Farr методики, используя наружно /3H/-меченый ГВМП/ Jennings H. J. et al, Determinant Specificities of the groups Band C polysaccharides of Neisseria meningitidis, J. Immunol, 134, 2651 /1985/, или /³H-меченый N-Пр-ГВМП /Jennings H.J. et al, Unique Jntermolecular Bactericidal Epitope involving the Homo-Sialo Polysaccharide Capsule on the Cell Surface ofgroup B Neisseria meningitidis and Escherichia coli KI, J. Immunol, 142: 3585 3591 /1989/. Реакционную смесь для радиоактивного антигенсвязывающего анализа получают смешением в полипропиленовых микротрубках Eppendorf для испытания 20 мкл объединенной иммунной сыворотки, от групп из 20 мышей, иммунизированных каждым индивидуальным N-ацилированным ГВМП-CA конъюгатом, разбавленным до 100 мкл ФБС, с /³H/-меченым ГВМП и /³H/-меченым N-Пр-ГВМП в 50 мкл ФБС. После инкубации при 4^oC в течение 16 ч. 150 мкл насыщенного /при 4^oC/ сульфата аммония /pH 7,0/ добавляют в трубки и эти трубки перемешивают и оставляют стоять при 4^oC в течение 30 мин. Трубки центрифугируют при 15000 об./мин в течение 10 мин и две аликвоты по 130 мкл отбирают из трубок. Аликвоты смешивают с 2 мл воды и ксилолом, содержащим сцинтиллирующее вещество /ACS водный сцинтиллятор/ и смеси просчитывают в сцинтилляционном счетчике для измерения жидкости. Результаты представлены в табл.1.

Табл. 1 убедительно демонстрирует, что -АЦ-ГВМП /который несет тот же самый эпитоп как зародышевый N-САМ/ связывается меньше с иммунной сывороткой, индуцируемой N-Бу-ГВМП, N-изоБу-ГВМП, N-Пен-ГВМП, и N-Гекс-ГВМП, чем с иммунной сывороткой, индуцируемой N-/Пр-ГВМП. Из этого, как можно заключить из табл. 1, N-Бу-, N-изоБу, N-Пен- и N-Гекс-полисахарид-конъюгаты в меньшей степени перекрестно-реагирующие антитела, чем N-Пр-конъюгат.

c) Количественные преципитиновые анализы.

Эти эксперименты проводят по способу Kabatand Mayer, E[perimental Bmmunochemistry Charles C. Thomas, Springaield p. 22 /1961/. Аликвоты /100 мкл/ анти- -ацил ГИМП-СА сывороток /разбавленные в 5 раз ФБС/ взаимодействуют в трубках с увеличивающимися концентрациями N-ацетил/коломиновая кислота/, -пропионил, -бутаноил, -пентаноил и гексаноил ГВМП в суммарном объеме 200 мкл /подведенном с помощью ФБС/. В этих экспериментах используют более высокомолекулярные фракции этих производных и их получают из элюата Ultragel AcA 44 колонки /K_D 0,4 как измерено с помощью FRLC/, ранее использованной для контроля размеров фрагментов -ацилированного ГВМП. Трубки инкубируют при 4^oC в течение 4 дней, ежедневно перемешивая, центрифугируют, и количество белка антител определяют по способу Lowry et ai. Измерение белка с помощью Folin фенольного реагента, J. Biok Chem, 1933, 265 /1951/. Результаты представлены в табл. 2.

Что касается перекрестного реагирования, первая колонка табл. 2 указывает, что очень мало перекрестно-реагирующих антител образуется с помощью N-Бу и n-Гекс конъюгатов по сравнению с N-Пр конъюгатом. Также видно, что N-Пен конъюгат производит меньше перекрестнореагирующих антител, чем N-Пр конъюгат.

В отношении иммуногенности в терминах гомологического ответа из табл.2 можно видеть, что N-Бу /2,60/, N-Пен- /6,35/, и N-Гекс- /4,40/ ГВМП конъюгаты являются более иммуногенными, чем N-Пр-ГВМП аналог /0,40/.

d) Иммуноферментный твердофазный анализ /EL ISA/.

Лунки EIA микрофильтрационных пластинок /Flow Labs, Missisauda, Ontario, Canada /заполняют 10 мкг/ мл раствором либо ГВМП-, -ПрГВМП-, либо - ГВМП-СБА конъюгатов в ФБС /100 мкл/на лунку/. Пластины оставляют стоять в течение 18 ч при 4^oC и после нанесения их промывают 1% сывороткой бычьего альбумина в ФБС в течение 10 мин при комнатной температуре /стадия блокинга/. Лунки затем наполняют 100 мкл 10-кратно разбавленными в ФБС сыворотками анти-мышь- -ацил ГВМП-СА конъюгатов и пластины инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания SBN пластины инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре с 50 мкл соответствующего разбавления козьих антимышиных иммуноглобулиновых конъюгатов, меченных пероксидазой /Kirkegard and Perry Laboratories/, затем содержимое лунок аспирируют и пластины промывают пять раз SBT. Наконец, добавляют 50 мкл тетраметилен синий-пероксидаза субстрата /ТМС/ /Kirkegart fnd Perry Laboratories/ в каждую лунку и через 10 мин определяют абсорбцию при 450 нм с помощью Multiscan спектрофотометра /Flow Laboratories, Mississauga, Ont/. Результаты представлены в табл.3.

Что касается перекрестного реагирования, из табл. 3 можно видеть, что N-Бу-ГВМП-СА конъюгат повышает в меньшей степени перекрестно-реагирующие антитела N-АЦ-ГВМП /1000/, чем это делает N-Пр-ГВМП-СА конъюгат /7800/. Причина заключается в том, что ГВМП связывается в меньшей степени с антителом, индуцированным N-Пр-ГВМП-СА конъюгатом, чем с антителом, индуцированным N-Бу-ГВМП-СА конъюгантом.

Аналогичные комментарии используют в отношении N-изоБут-ГВМП-СА конъюгата.

Что касается иммуногенности, N-Бу конъюгат является более иммуногенным, чем N-Пр аналог, как показано с помощью гомологических титров связывания 52000 /N-Бу/ и 40000 /N-Пр/.

e/ Радиоактивный анализ ингибирования связывания.

Увеличивающую концентрацию N-ацил ГВМП ингибитора с большим молекулярным размером в ФБС /90 мкл/ добавляют к 20 мкл сыворотки мышиного анти- -Пр-ГВМП-СА конъюгата, количество, достаточное для связывания 50% /³H/-меченого -Пр-ГВМП в отсутствие ингибитора. Трубки инкубируют в течение 1 ч при 37^oC и добавляют 50 мкм /³H/ меченого -Пр-ГВМП в ФБС. После осторожного перемешивания трубки инкубируют при 4^oC в течение 16 ч и выполняют анализы точно как описано ранее для радиоактивного анализа связывания антигена. ингибирования рассчитывают, используя следующую формулу: процент ингибирования100 x /имп/ мин с ингибитором минус имп/мин без ингибитора/ /имп/мин без антитела минус имп/мин без ингибитора/.

Результаты представлены в табл. 4.

Бактерицидные анализы выполняют по способу, описанному Jennings et al, J. Exp. Med. 165, 1207-1211 /1987/.

Neisseria meningitidis штамм B /M 986/ используют в этих анализах. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 4 иллюстрирует, что N-Бу-ГВМП является таким же хорошим ингибитором, как N-Пр-ГВМП для связывания последнего с его собственными гомологическими антителами. Поэтому использование N-Бу-ГВМП вместе N-Пр-ГВМП не приводит к какой-либо существенной потере свойств, проявляемых N-Пр-ГВМП. Табл. 5 демонстрирует, что N-Бу-ГВМП связывается также хорошо как N-Пр-ГВМП с антителами, индуцируемыми N-Пр-ГВМП-СА конъюгатом. Антисыворотки, индуцируемые как N-Бу-ГВМП-СА, так и N-Пр-ГВМП-СА конъюгатами, дают сходные бактерицидные титры. Эти данные указывают на эквивалентность N-Бу-, N-изоБу- и Т-Пен-ГВМП к N-Пр- ГВМП к N-Пр-ГВМП в их способности имитировать бактерицидный эпитоп на поверхности менингококка группы B.

Формула изобретения

1. Полисахарид Neisseria meningitidis с модифицированной группой В, со средней мол. м. 10000 50000 D, в котором N-ацетилгруппы остатков сиаловой кислоты нативного полисахарида замещены С₄ С₈-ацильными группами.

2. Полисахарид по п.1, в котором С₄ С₈-ацильная группа является н-бутаноилом, изо-бутаноилом, н-пентаноилом, н-гексаноилом, н-гептаноилом или н-октаноилом.

3. Полисахарид по п.2, в котором ацильная группа является н-бутаноилом, изо-бутаноилом, н-пентаноилом или н-гексаноилом.

4. Полисахарид по п.3, в котором ацильной группой является н-бутаноил.

5. Полисахарид по п.1, в котором от около 27 до 100% N-ацетильных групп остатков сиаловой кислоты замещены С₄ С₈-ацильными группами.

6. Полисахарид по п.5, в котором ацильной группой является н-бутаноил.

7. Полисахарид по п.2, в котором от около 27 до 100% N-ацетильных групп остатков сиаловой кислоты замещены С₄ С₈-ацильными группами.

8. Конъюгированный антиген, содержащий полисахарид Neisseria meningitidis с модифицированной группой В, со средней мол.м. 10000 50000 D, в котором N-ацетилгруппы остатков сиалоновой кислоты нативного полисахарида замещены С₄ С₈-ацильными группами, связанный с иммунологически приемлемым белком.

9. Антиген по п.8, в котором С₄ С₈-ацильная группа является н-бутаноилом, изо-бутаноилом, пентаноилом, гексаноилом, гептаноилом или октаноилом.

10. Антиген по п.8, в котором ацильная группа является н-бутаноилом, изо-бутаноилом, пентаноилом или гексаноилом.

11. Антиген по п.8, в котором иммунологически приемлемым белком является столбнячный анатоксин, дифтерийный токсоид, перекрестно-рагирующие вещества (CRM) и белковый бактерионоситель.

12. Антиген по п.11, в котором перекрестно-реагирующим белком является CRM₁₉₇.

13. Антиген по п. 8, в котором полисахарид ковалентно связан через -СН₂-NH-белковую связь с белком.

14. Вакцина против менингита группы В, содержащая конъюгированный антиген, содержащий полисахарид Neisseria meningitidis с модифицированной группой В, со средней мол.м. 10000 50000 D, в котором N-ацетилгруппы остатков сиаловой кислоты нативного полисахарида замещены С₄ - С₈-ацильными группами, связанный с иммунологически приемлемым белком.

15. Вакцина по п.14, отличающаяся тем, что дополнительно содержит физиологически приемлемый адъювант.

16. Вакцина по п.14, отличающаяся тем, что в качестве адъюванта содержит гидроксид, фосфат или сульфат алюминия.

17. Способ индукции ответа антител к менингиту группы В путем парентерального введения млекопитающему вакцины, отличающийся тем, что вводят вакцину, содержащую конъюгированный антиген, содержащий полисахарид Neisseria meningitidis с модифицированной группой В, со средней мол.м. 10000 50000 D, в котором N-ацетилгруппы остатков сиаловой кислоты нативного полисахарида замещены С₄ С₈-ацильными группами, связанный с иммунологически приемлемым белком, в иммунологически эффективном количестве.

18. Способ по п.14, отличающийся тем, что вакцину вводят в дозе от 1 до 25 мкг/кг веса тела.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2