Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении вакцин, применяемых для возникновения иммунного ответа у животного. Предложен иммуногенный конъюгат полисахарида Haemophilus influenzae типа в (Hib) с практически переуложенным зрелым белком наружной мембраны класса 2 или 3 Neisseria meningitidis или его слитой формой, содержащей аминокислоты 1-20 или 1-22 капсидного белка 
гена Т7 (rPorB). Hib подвергают окислению или селективному гидролизу для получения альдегидных групп. Затем посредством восстановительного аминирования конъюгируют данный полисахарид с rPorB. Полученный конъюгат используют для получения фармкомпозиции и индукции иммунного ответа у животного в отношении Н. influenzae. 6 с. и 7 з.п. ф-лы, 8 ил.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области вакцин, применяемых для возникновения иммунного ответа у животного. В частности, изобретение касается конъюгатов полисахарида Н. influenzae - белка наружной мембраны N. meningitidis, фармацевтических композиций и их использования.
Уровень техники
Микроорганизм Haemophilus influenzae представляет собой маленькие плеоморфные грамотрицательные коккобациллы. Изоляты классифицируют на шесть капсулярных типов (a-f), различающихся по природе антигенов, и неинкапсулированные нетипируемые штаммы. Haemophilus influenzae может вызывать менингит, средний отит (воспаление среднего уха), синусит, эпиглоттит (воспаление надгортанника), септический артрит, лихорадочную скрытую бактериемию, целлюлит, пневмонию и эмпиему, иногда данный организм вызывает менингит новорожденных и септицемию. Другие инфекции Н. Influenzae включают гнойный перикардит, эндокардит, конъюнктивит, остеомиелит, перитонит, эпидидимальный орхит, глоссит, увулит (воспаление язычка мягкого неба) и септический тромбофлебит. В большинстве случаев инвазивные заболевания до внедрения конъюгированной вакцины на основе Н. influenzae типа b (Hib) вызывались типом b. Неинкапсулированные организмы могут вызывать инвазивное заболевание у новорожденных. Неинкапсулированные штаммы вызывают инфекцию верхних дыхательных путей, включая средний отит, синусит и бронхит, и могут вызывать пневмонию.
Источником (микро)организма являются верхние дыхательные пути человека. Способом передачи предположительно является передача от субъекта субъекту при прямом контакте или путем ингаляции капель выделений дыхательных путей, содержащих организм. Часто происходит бессимптомная колонизация неинкапсулированными штаммами, организмы выделяют из горла у 60-90% детей. Однако колонизация организмами типа b встречается редко, находясь в интервале от 2 до 5% детей в эпоху, предшествующую появлению вакцин, и, очевидно, стала еще менее частой в связи с широким распространением вакцинации конъюгатом Hib. Точный период передачи инфекции неизвестен, но его длительность может быть равной периоду нахождения организма в верхних дыхательных путях.
До внедрения эффективных вакцин Hib был наиболее частой причиной бактериального менингита у детей в США и многих других странах. Менингит и другие инвазивные инфекции были наиболее распространены среди детей в возрасте от 3 месяцев до 3 лет, и приблизительно половина случаев приходилась на детей младше 12 месяцев. Зависимость частоты инвазивного заболевания типа b от возраста варьировала в странах в различных популяциях; доля заболеваемости детей в возрасте младше 12 месяцев оказывалась наибольшей в популяциях с самой высокой общей заболеваемостью, что приводило к более низкому проценту заболеваемости среди людей среднего возраста. В противоположность менингиту и большинству других инвазивных Hib-заболеваний эпиглоттит редко возникает у детей в возрасте младше 12 месяцев, пик его возникновения в эпоху, предшествующую появлению вакцин, приходился на возраст от 2 до 4 лет. Эпиглоттит также может возникать у более старших невакцинированных детей и взрослых.
Инвазивные заболевания были более частыми у мальчиков, афроамериканцев, эскимосов Аляски, индейцев племен апачи и навахо, детей, посещающих центры по уходу за ребенком, детей, живущих в условиях перенаселения, и детей, которых не кормили грудью. Иммунизированные дети, в частности дети в возрасте младше 4 лет, которые находятся в длительном тесном контакте (таком, как домашние условия) с ребенком с инвазивным Hib-заболеванием, имеют повышенный риск получения серьезной инфекции от данного организма. Другие факторы предрасположенности к инвазивному заболеванию включают серповидно-клеточную анемию, асплению, ВИЧ-инфекцию, ряд синдромов, связанных с иммунодефицитом, и злокачественные новообразования. Дети в возрасте младше 1 года с документированной инвазивной инфекцией имеют приблизительно 1% риска рецидива, если их впоследствии не вакцинировали.
С 1988, когда были введены конъюгированные вакцины против Hib, частота инвазивных заболеваний Hib снизилась на 95% у младенцев и детей младшего возраста, и частота инвазивных инфекций, вызываемых другими инкапсулированными типами, в настоящее время близка частоте инфекций, вызываемых типом b. Результатом такого успеха было то, что Служба здоровья населения США поставила цель ликвидации в стране заболевания Hib у детей в возрасте младше 5 лет. В настоящее время инвазивное заболевание Hib возникает главным образом у еще невакцинированных детей и младенцев, которые являются слишком маленькими для проведения законченной первичной серии вакцинаций.
В США получены разрешения на четыре конъюгированные вакцины против Hib. Данные вакцины состоят из капсулярного полисахарида Hib (т.е. полирибозилриботолфосфата [PRP] или олигомеров PRP), ковалентно связанного с белком-носителем непосредственно или через промежуточную спейсерную молекулу. Защитные антитела направлены против PRP. Конъюгированные вакцины различаются по составу и иммуногенности, что обусловливает различия в рекомендациях по их применению. Например, PRP-D рекомендуется только для детей в возрасте 12 месяцев и старше, тогда как три другие вакцины HbOC, PRP-T и PRP-OMP рекомендуются для младенцев, начиная с двухмесячного возраста.
Адъюванты представляют собой субстанции, которые усиливают иммунный ответ на антигены, и вследствие этого их используют во многих вакцинах и испытываемых вакцинах. Иммуностимуляторный эффект адъювантов не является антиген-специфическим, поскольку они усиливают иммунные ответы на многие антигены различных типов. Единственными адъювантами, в настоящее время одобренными FDA (Food and Drug Administration, Департамент по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств) для применения человеку, являются соли алюминия, но многие адъюванты, используемые при вакцинациях животных и в более новых испытываемых вакцинах, имеют микробную природу (White R.G. Адъювантный эффект микробных продуктов в отношении иммунного ответа (The adjuvant effect of microbial products on the immune response), 1976, Ann. Rev. Microbiol., 30:579-595), например адъювант Фрейнда, Corynebacterium parvum, мурамилдипептид, токсоид столбняка и т.п. Механизмы иммунопотенцирующей способности микробных субстанций неизвестны.
Главные белки наружной мембраны патогенной Neisseria (Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis) исследованы на адъювантный потенциал [P.O. Livingston. Подходы к усилению ответа антител IgG на вакцины на основе ганглиозидов меланомы (Approaches to augmenting the IgG antibody response to melanoma ganglioside vaccines), 1993, Ann. N.Y.Acad. Sci., 690:204-213; P.O. Livingston, M.J. Calves, F. Helling, W.D. Zollinger, M.S. Blake и G.H. Lowell. GD3/протеосомные вакцины индуцируют стабильные антитела IgM против ганглиозида GD3 (GD3/proteosome vaccines induce consistent IgM antibodies against ganglioside GD3), 1993, Vaccine, 11:1199-1204; G.H. Lowell, W.R. Ballow, L.F. Smith, R.A. Wirtz, W.D. Zollinger и W.T. Hockmeyer. Протеосомно-липопептидные вакцины - повышение иммуногенности малярийных CS-пептидов (Proteosome - lipopeptide vaccines: enchancement of immunogenecity for malaria CS peptides), 1988, Science, 240:800-802; G.H. Lowell, L.F. Smith, R.C. Seid и W.D. Zollinger. Пептиды, связанные с протеосомами посредством гидрофобных ножек, приобретают высокую иммуногенность в отсутствие адъюванта (Peptides bound to proteosomes via hydrophobic feet become highly immunigenic without adjuvant), 1988, J. Exp. Med., 167:658-663; L.M. Wetzler, M.S. Blake, K. Barry и Е.С. Gotschlich. Оценка вакцин на основе порина гонококков - сравнение Роr-протеосом, липосом и пузырьков, выделенных из мутантов с делецией rmp (Gonococcal porin vaccine evaluation: comparison of Por proteosomes, liposomes, and blebs isolated from rmp deletion mutants), 1992, J. Infect. Dis., 166:551-555] и для выяснения механизма, обусловливающего их иммунопотенцирующую способность. Белками, представляющим интерес, являются белок IA (PIA) и белок IB (PIB) гонококка и белки классов 1, 2 или 3 менингококка (С1, С2 и С3 соответственно) [М. Blake и Е. Gotschilich. Функциональные и иммунологические свойства поверхностных белков патогенных нейссерий (Functional and immunological properties of pathogenic neisserial surface proteins), 1986. В монографии М. Inouye Бактериальные наружные мембраны как модельные системы (Bacterial Outer membranes as Model Systems), John Wiley, New York, стр.377-400]. Все они работают как порины [Е.С. Lynch, M.S. Blake, E.C. Gotschlich и A. Mauro. Исследования поринов, самопроизвольно перенесенных из целых клеток и восстановленных из очищенных белков Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis (Studies of porins: Spontaneously transferred from whole cells and reconstituted from purified proteins of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis), 1984, Biophys., 45:104-107; A. Mauro, M.S. Blake и Р. Labarca. Механизм возникновения под действием напряжения проводимости липидных двухслойных структур, индуцируемый порином из наружных мембран Neisseria gonorrhoeae (Voltage gating of conductance in lipid bilayers induced by porin from outer membranes of Neisseria gonorrhoeae), 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:1071-1075; J.D.E. Young, M.S. Blake, A. Mauro и Z.A. Cohn. Свойства главного белка наружной мембраны Neisseria gonorrhoeae, инкорпорированного в модельные липидные мембраны (Properties of the major outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae incorporated into model lipid membranes), 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3831-3835], имеют существенную гомологию последовательностей аминокислот относительно друг друга [S. Butcher, M. Sarvas и К. Runeberg-Nyman. Белок порина класса 3 Neisseria meningitidis - Клонирование и структура гена (Class-3 porin protein of Neisseria meningitidis: Cloning and Structure of the gene), 1991, Gene 105:125-128; N. Carbonetti и Р. Sparling. Молекулярное клонирование и характеристики структурного гена белка I главного белка наружной мембраны Neisseria gonorrhoeae (Molecular cloning and characterization of the structural gene of protein I, the major outer membrane protein of Neisseria gonorrhoeae), 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:9084-9088; E.C. Gotschlich, M.E. Seiff, M.S. Blake и J.M. Koomey. Белок порина Neisseria gonorrhoeae - клонирование и структура гена (Porin protein of Neisseria gonorrhoeae: cloning and gene structure), 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8135-8138; M.J. Ward, P.R. Lambden и J.E. Heckels. Анализ последовательности и взаимосвязи белков менингококков серотипа класса 3 и других поринов из патогенных и непатогенных видов Neisseria (Sequence analysis and relationships between meningococcal class 3 serotype proteins and other porins from pathogenic and non-pathogenic Neisseria), 1992, FEMS Microbiol. Lett., 73:283-289] и, как полагают, являются частью суперсемейства порина грамотрицательных бактерий [D. Jeanteur, J.H. Lakely и Е. Pattus. Суперсемейство бактериальных поринов - определение последовательности и предсказание структуры (The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction), 1991, Molec. Microbiol., 5:2153-2164].
Было показано, что порины нейссерий при нековалентном комплексообразовании с малярийными пептидами усиливают ответ антител на данные пептиды по сравнению с использованием в качестве иммуногенов одних пептидов или пептидов, ковалентно связанных с другими белками [G.H. Lowell, W.R. Ballow, L.F. Smith, R.A. Wirtz, W.D. Zollinger и W.T. Hockmeyer. Протеосомно-липопептидные вакцины - повышение иммуногенности малярийных CS-пептидов (Proteosome -lipopeptide vaccines: enchancement of immunogenecity for malaria CS peptides), 1988, Science, 240:800-802; G.H. Lowell, L.F. Smith, R.C. Seid и W.D. Zollinger. Пептиды, связанные с протеосомами посредством гидрофобных ножек, приобретают высокую иммуногенность в отсутствие адъюванта (Peptides bound to proteosomes via hydrophobic feet become highly immunigenic without adjuvant), 1988, J. Exp. Med., 167:658-663]. Кроме того, было показано, что пептиды, выделенные из стрептококка группы A [G.H. Lowell. Протеосомы, гидрофобные якори, иском-частицы и липосомы для улучшенной презентации пептидов и белковых вакцин (Proteosomes, hydrophobic anchors, iscoms, and liposomes for improved presentation of peptides and protein vaccines), 1990, стр.141-160 в монографии G.C.Woodrow и М.М. Levine Вакцины нового поколения (New Generation Vaccines), Marcel Dekker, Inc., New York], гемагглютинина вируса гриппа [G.H. Lowell. Протеосомы, гидрофобные якори, иском-частицы и липосомы для улучшенной презентации пептидов и белковых вакцин (Proteosomes, hydrophobic anchors, iscoms, and liposomes for improved presentation of peptides and protein vaccines), 1990, стр.141-160 в монографии G.C.Woodrow и М.М. Levine Вакцины нового поколения (New Generation Vaccines), Marcel Dekker, Inc., New York] или Trypanosome bruceii [G.H. Lowell, L.F. Smith, R.C. Seid и W.D. Zollinger. Пептиды, связанные с протеосомами посредством гидрофобных ножек, приобретают высокую иммуногенность в отсутствие адъюванта (Peptides bound to proteosomes via hydrophobic feet become highly immunigenic without adjuvant), 1988, J. Exp. Med., 167:658-663], являются более иммуногенными у мышей, когда они введены в комплексы, содержащие порины Neisseria, по сравнению с иммунизацией мышей одними пептидами. Пузырьки наружной мембраны (OMV) менингококков, состоящие в основном из белка класса 2, были использованы в качестве носителя для усиления иммунного ответа в отношении полисахаридной капсулы Н. influenzae в недавно разрешенной вакцине против Н. influenzae типа b, разработанной Merck [J.J. Donnelly, R.R. Deck и М.А. Liu. Иммуногенность конъюгированных вакцин на основе комплекса полисахарид Haemophilus influenzae - белок наружной мембраны Neisseria meningitidis (Immunogenicity of Haemophilus influenzae polysaccharide - Neisseria meningitidis outer membrane protein complex conjugate vaccine), 1990, J. Immunol., 145:3071-3079]. Более того, Livingston исследовал применение очищенных поринов нейссерий в качестве адъювантов в вакцинах против меланомы. Клетки меланомы экспрессируют на своей поверхности человеческие ганглиозиды GM2 или GD3 на значительно более высоких уровнях по сравнению с нормальными меланоцитами. Для усиления иммунного ответа в отношении GM2 или GD3 и возможной индукции устойчивости к развитию опухоли у пациентов с меланомой, GM2 или GD3 были нековалентно связаны с очищенными поринами Neisseria, и добровольцев со злокачественной меланомой иммунизировали данными вакцинными конструкциями. Реакции антител против GM2 или против GD3 значительно повышались у пациентов, иммунизированных комплексами порин/GМ2 или порин/GDS, по сравнению с пациентами, иммунизированными одними данными ганглиозидами или данными ганглиозидами, комплексированными с BCG [P.O. Livingston. Подходы к усилению ответа антител IgG на вакцины на основе ганглиозидов меланомы (Approaches to augmenting the IgG antibody response to melanoma ganglioside vaccines), 1993, Ann. N.Y. Acad. Sci., 690:204-213; P.O. Livingston, M.J. Calves, F. Helling, W.D. Zollinger, M.S. Blake и G.H. Lowell. GD3/протеосомные вакцины индуцируют стабильные антитела IgM против ганглиозида GD3 (GD3/proteosome vaccines induce consistent IgM antibodies against ganglioside GD3), 1993, Vaccine, 11:1199-1204]. Кроме того, опухолевая нагрузка у пациентов, иммунизированных порином/СМ2, существенно снижалась (личное сообщение, Р. Livingston).
Механизмы, с помощью которых порины Neisseria действуют как адъюванты, неизвестны. Группа из Merck [J.J. Donnelly, R.R. Deck и М.А. Liu. Иммуногенность конъюгированных вакцин на основе комплекса полисахарид Haemophilus influenzae - белок наружной мембраны Neisseria meningitidis (Immunogenicity of Haemophilus influenzae polysaccharide - Neisseria meningitidis outer membrane protein complex conjugate vaccine), 1990, J. Immunol., 145:3071-3079; М.А. Liu, A. Friedman, A.I. Oliff и соавт. Носитель для вакцин, выделенный из Neisseria meningitidis, с митогенной активностью в отношении лимфоцитов (A vaccine carrier derived from Neisseria meningitidis with mitogenic activity for lymphocytes), 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4633-4637; J.B. Ulmer, C.J. Burke, C. Shi, A. Friedman, J.J. Donnelly и М.A. Liu. Образование пор и митогенность клеток крови, обусловленные белком класса 2 Neisseria meningitidis (Pore formation and mitogenicity in blood cells by the class 2 protein of Neisseria meningitidis), 1992, J. Biol. Chem., 267:19266-19271], которая разработала конъюгированную вакцину полисахаридная капсула Neisseria - OMV менингококков, считала, что это могло бы происходить вследствие прямой стимуляции Т-клеток белком класса 2. Вначале они показали, что белок класса 2 мог непосредственно стимулировать Т-лимфоциты и вследствие этого переименовали белок класса 2 в усиливающий иммунитет белок менингококков (MIEP) [М.А. Liu, A. Friedman, A.I. Oliff и соавт. Носитель для вакцин, выделенный из Neisseria meningitidis, с митогенной активностью в отношении лимфоцитов (A vaccine carrier derived from Neisseria meningitidis with mitogenic activity for lymphocytes), 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4633-4637]. Однако позднее было показано, что только денатурированный белок класса 2 в высоких концентрациях (>50 мкг) мог стимулировать Т-клетки, тогда как нативный белок не давал такого эффекта [J.B. Ulmer, C.J. Burke, С. Shi, A. Friedman, J.J. Donnelly и М.А. Liu. Образование пор и митогенность клеток крови, обусловленные белком класса 2 Neisseria meningitidis (Pore formation and mitogenicity in blood cells by the class 2 protein of Neisseria meningitidis), 1992, J. Biol. Chem., 267:19226-19271]. Более того, поскольку большинство поринов Neisseria находятся в нативной конфигурации при использовании в качестве кандидатной (испытываемой) вакцины или адъюванта, вероятность того, что неспецифическая стимуляция Т-клеток денатурированными поринами влияет на их иммунопотенцирующую способность, является низкой.
В последние несколько лет были выяснены детали, касающиеся взаимодействия между Т- и В-лимфоцитами, необходимого для распознавания антигена, стимуляции лимфоцитов и образования антител. В современной модели стимуляции Т-лимфоцитов показано, что необходимы две группы сигналов между антиген-презентирующей клеткой (АРС) и Т-лимфоцитом [K.S. Hathcock, G. Laszlo, H.B. Dickter, J. Bradshaw, P.S. Linsley и R.J. Hodes. Идентификация лиганда, альтернативного CTLA-4, костимулирующего активацию Т-клеток (Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for Т cell activation), 1993, Science, 262:905-907; С.A. Janeway, Jr. и К. Bottomly. Сигналы и признаки ответов лимфоцитов (Signals and signs for lymphocyte responses), 1994, Cell, 76:275-285; R.H. Schwartz. Костимуляция Т-лимфоцитов - роль CD28, CTLA-4 и В7/ВВ1 в образовании интерлейкина-1 и иммунотерапии (Costimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy), 1992, Cell, 71:1065-1068]. Первый сигнал (сигнал 1) возникает от взаимодействия главного комплекса гистосовместимости (МНС) на антиген-презентирующих клетках (например, на В-лимфоцитах, дендритных клетках, макрофагах и т.п.) и Т-клеточного рецептора на Т-лимфоцитах. Углубление на комплексе МНС обычно занято олигопептидом, происходящим из процессированных антигенов (Т-клеточный эпитоп). Специфичность реакции обеспечивается сигналом 1. Второй или костимуляторный сигнал (сигнал 2) возникает при связывании двух групп противорецепторов во время взаимодействия В- и Т-лимфоцитов (фиг.1). Затем активированные Т-лимфоциты выделяют цитокины, которые, в свою очередь, стимулируют эффекторные клетки, например, являясь причиной того, что В-лимфоциты становятся клетками, продуцирующими антитела. Было показано, что индукция костимуляции посредством взаимодействия данных противорецепторов является важной для появления иммунитета к развитию опухоли [М. Azuma, M. Cayabyab, D. Buck, J.H. Phillips и L.L Lanier. Взаимодействие CD28 с В7 костимулирует первичные аллогенные пролиферативные ответы и цитотоксичность, опосредуемые маленькими покоящимися Т-лимфоцитами (CD28 interaction with B7 costimulates primary allogenic proliferative responses and cytotoxicity mediated by small, resting Т lymphocytes), 1992, J. Exp. Med., 175:353-360; S. Baskar, S. Ostrand-Rosenberg, N. Nabavi, L.M. Nadler, G.J. Freeman и L.H. Glimcher. Конститутивная экспрессия В7 восстанавливает иммуногенность опухолевых клеток, экспрессирующих усеченные молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II (Constitutive expression of B7 restores immunogenicity of tumor cells expressing truncated major histocompatibility complex class II molecules), 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5687-5690; L. Chen, S. Ashe, W.A. Brady и соавт. Костимуляция противоопухолевого иммунитета с помощью противорецептора B7 к молекулам CD28 и CTLA-4 Т-лимфоцитов (Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the Т lymphocyte molecules CD28 и CTLA-4), 1992, Cell 71:1093-1102; S. Falkow. Что представляет собой патоген? (What is a pathogen?), 1997, ASM News, 63:359-365; R.H. Schwartz. Костимуляция Т-лимфоцитов - роль CD28, CTLA-4 и В7/ВВ1 в образовании интерлейкина-1 и иммунотерапии (Costimulation of Т lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy), 1992, Cell, 71:1065-1068; S.E. Townsend и J.P. Allison. Отторжение опухоли после прямой костимуляции Т-клеток CD8+ В7-трансфицированными клетками меланомы (Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ Т cells by B7-transfected melanoma cells), 1993, Science, 259:368-370], профилактики толерантности [C.D. Gimmi, G.J. Freeman, J.G. Gribben, G. Gray и L.M. Nadler. Клональная анергия Т-клеток человека индуцируется презентацией антигена в отсутствие костимуляции В7 (Human T-cell anergy is induced by antigen presentation in the absence of B7 costimuation), 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6586-6590; D.L Mueller, M.K. Jenkins и R.H. Schwartz. Противопоставление клональной экспансии функциональной клональной инактивации - путь костимуляторного сигнала определяет последствия занятости рецептора Т-клеточного антигена (Clonal expansion versus functional clonal inactivation: a costimulatory signaling pathway determines the outcome of Т cell antigen receptor occupancy), 1989, Annu. Rev. Immunol., 7:445-480; P. Tan, C. Anasetti, J.A. Hansen и соавт. Индукция аллоантиген-специфической гипочувствительности у человеческих Т-лимфоцитов посредством блокирования взаимодействия CD28 с его естественным лигандом B7/BB1 (Induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness in human Т lymphocytes by blocking interaction of CD28 with its natural ligand B7/BB1), 1993, J. Exp. Med., 177:165-173] и проявления цитотоксической активности лимфоцитов [M. Azuma, M. Cayabyab, D. Buck, J.H. Phillips и L.L. Lanier. Взаимодействие CD28 с В7 костимулирует первичные аллогенные пролиферативные ответы и цитотоксичность, опосредуемые маленькими покоящимися Т-лимфоцитами (CD28 interaction with B7 costimulates primary allogenic proliferative responses and cytotoxicity mediated by small, resting Т lymphocytes), 1992, J. Exp. Med., 175:353-360].
Противорецепторами Т-лимфоцитов являются CD28 и CTLA-4. Оба они представляют собой члены суперсемейства иммуноглобулинов [T.D. Connell, D. Shaffer и J.G. Cannon. Характеристики репертуара гипервариабельных участков семейства генов белка II (ора) Neisseria gonorrhoeae (Characterization of the repertoire of hypervariable regions in the protein II (opa) gene family of Neisseria gonorrhoeae), 1990, Molec. Microbiol., 4:439-449]. CD28 присутствует на покоящихся и активированных Т-клетках [М. Azuma, М. Cayabyab, D. Buck, J.H. Phillips и L.L. Lanier. Взаимодействие CD28 с B7 костимулирует первичные аллогенные пролиферативные ответы и цитотоксичность, опосредуемые маленькими покоящимися Т-лимфоцитами (CD28 interaction with B7 costimulates primary allogenic proliferative responses and cytotoxicity mediated by small, resting Т lymphocytes), 1992, J. Exp. Med., 175:353-360; L. Chen, S. Ashe, W.A. Brady и соавт. Костимуляция противоопухолевого иммунитета с помощью противорецептора B7 к молекулам CD28 и CTLA-4 Т-лимфоцитов (Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the Т lymphocyte molecules CD28 и CTLA-4), 1992, Cell 71:1093-1102; M.K. Jenkins и J.G. Johnson. Молекулы, участвующие в костимуляции Т-клеток (Molecules involved in T-cell costimulation), 1993, Curr. Opin. Immunol., 5:361-367; C.H. June, J.A. Bluestone, L.M. Nadler и С.В. Thompson. Семейства рецепторов В7 и CD28 (The B7 and CD28 receptor families), 1994, Immunol. Today, 15:321-331; P.S. Linsley, W. Brady, L. Grosmaire, A. Aruffo, N.K. Damle и J.A. Ledbetter. Связывание антигена активации В-клеток B7 с CD28 костимулирует пролиферацию Т-клеток и накопление мРНК интерлейкина-2 (Binding of the В cell activation antigen B7 to CD28 costimulates Т cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation), 1991, J., Exp. Med., 173:721-730; P.S. Linsley, E.A. Clark и J.A. Ledbetter. Т-клеточный антиген CD28 опосредует адгезию к В-клеткам путем взаимодействия с антигеном активации В7/ВВ-1 (T-cell antigen CD28 mediates adhesion with B cells by interacting with activation antigen B7/BB-1), 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5031-5035; S.D. Norton, L. Zuckerman, K.B. Urdahl, R. Shefner, J. Miller и M.K. Jenkins. Лигaнд CD28, B7, повышает образование ИЛ-2 путем генерации костимуляторного сигнала для Т-клеток (The CD28 ligand, B7, enhances IL-2 production by providing a costimulatory signal to Т cells), 1992, J. Immunol., 149:1556-1561], тогда как СТLА-4 экспрессируется только на активированных Т-клетках [G.J. Freeman, D.B. Lombard, C.D. Gimmi и соавт. мРНК CTLA-4 и CD28 коэкспрессируются в большинстве Т-клеток после активации. Экспрессия мРНК CTLA-4 и CD28 не коррелирует со способом продукции лимфокинов (CTLA-4 and CD28 mRNA are coexpressed in most Т cells after activation. Expression of CTLA-4 and CD28 mRNA does not correlate with the pattern of lymphokine production), 1992, J. Immunol., 149:3795-3801; К. Harper, С. Balzano, E. Rouvier, M.G. Mattei, M.F. Luciani и Р. Golstein. CTLA-4- и CD28-активированные молекулы лимфоцитов, очень близкие у мыши и человека по последовательности, экспрессии информации, структуре генов и положению на хромосомах (CTLA-4 and CD28 activated lymphocyte molecules are closely related in both mouse and human as to sequence, message expression, gene structure, and chromosomal location), 1991, J. Immunol., 147:1037-1044; Т. Lindsten, K.P. Lee, E.S. Harris и соавт. Характеристики структуры и экспрессии CTLA-4 на человеческих Т-клетках (Characterization of CTLA-4 structure and expression on human Т cells), 1993, J. Immunol., 151:3489-3499; P.S. Linsley, W. Brady, M. Urnes, L.S. Grosmaire, N.K. Damle и J.A. Ledbetter. CTLA-4 - второй рецептор антигена активации В-клеток В7 (CTLA-4 is a second receptor for the В cell activation antigen B7), 1991, J., Exp. Med., 174:561-569; R.H. Schwartz. Костимуляция Т-лимфоцитов - роль CD28, CTLA-4 и В7/ВВ1 в образовании интерлейкина-1 и иммунотерапии (Costimulation of Т lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy), 1992, Cell, 71:1065-1068]. Уровень CD28 на активированных Т-клетках в 20 раз выше, чем CTLA, но аффинность CD28 в отношении его В-клеточного противорецептора значительно ниже [Т. Lindsten, K.P. Lee, E.S. Harris и соавт. Характеристики структуры и экспрессии CTLA-4 на человеческих Т-клетках (Characterization of CTLA-4 structure and expression on human Т cells), 1993, J. Immunol., 151:3489-3499; P.S. Linsley, W. Brady, M. Urnes, L.S. Grosmaire, N.K. Damle и J.A. Ledbetter. CTLA-4 - второй рецептор антигена активации В-клеток B7 (CTLA-4 is a second receptor for the В cell activation antigen B7), 1991, J., Exp. Med., 174:561-569]. Противорецепторами В-лимфоцитов являются B7 [G.J. Freeman, A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman и L.M. Nadler. B7 - новый член суперсемейства Ig с уникальной экспрессией на активированных В-клетках и В-клетках новообразований (В7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic В cells), 1989, J. Immunol., 143:2714-2722; C.D. Gimmi, G.J. Freeman, J.G. Gribben и соавт. Поверхностный антиген В7 В-клеток обеспечивает костимуляторный сигнал, который индуцирует пролиферацию Т-клеток и секрецию ими интерлейкина-2 (B-cell surface antigen B7 provides a costimulatory signal that induces Т cells to proliferate and secrete interleukin 2), 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:6575-6579; P.S. Linsley, W. Brady, L. Grosmaire, A. Aruffo, N.K. Damle и J.A. Ledbetter. Связывание антигена активации В-клеток B7 с CD28 костимулирует пролиферацию Т-клеток и накопление мРНК интерлейкина-2 (Binding of the В cell activation antigen B7 to CD28 costimulates Т cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation), 1991, J., Exp. Med., 173:721-730; Z. Razi-Wolf, G.J. Freeman, F. Galvin, B. Benacerraf, L. Nadler и Н. Reiser. Экспрессия и функция мышиного антигена B7, главной костимуляторной молекулы, экспрессируемой клетками перитонеального эксудата (Expression and function of the murine B7 antigen, the major costimulatory molecule expressed by peritoneal exudate cells), 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4210-4214; H. Reiser, G.J. Freeman, Z. Razi-Wolf, C.D. Gimmi, B. Benacerraf и L.M. Nadler. Мышиный антиген В7 обеспечивает эффективный костимуляторный сигнал для активации мышиных Т-лимфоцитов посредством комплекса Т-клеточный рецептор/CD3 (Murine B7 antigen provides an efficient costimulatory signal for activation of murine Т lymphocytes via the T-cell receptor/CD3 complex), 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:271-275] и совсем недавно открытый В7-2 [М. Azuma, D. Ito, H. Yagita и соавт. Антиген В70 - второй лиганд для CTLA-4 и CD28 (В70 antigen is a second ligand for CTLA-4 and CD28), 1993, Nature, 366:76-79; G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Открытие функционального альтернативного противорецептора CTLA-4 у В7-дефицитных мышей (Uncovering of functional alternative CTLA-4 counter-receptor in B7-deficient mice), 1993, Science, 262:907-909; G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Мышиный В7-2 -альтернативный противорецептор CTLA4, который костимулирует пролиферацию Т-клеток и продукцию интерлейкина-2 (Murine B7-2, an alternative CTLA-4 counter-receptor that costimulates Т cell proliferation and interleukin-2 production), 1993, J. Esp. Med., 178:2185-2192; G.J. Freeman, J.G. Gribben, V.A. Boussiotis и соавт. Клонирование B7-2 - противорецептора CTLA-4, костимулирующего пролиферацию Т-клеток человека (см. комментарии) (Cloning of B7-2: a CTLA-4 counter-receptor that costimulates human Т cell proliferation), 1993, Science, 262:909-911; K.S. Hathcock, G. Laszlo, H.B. Dickter, J. Bradshaw, P.S. Linsley и R.J. Hodes. Идентификация лиганда, альтернативного CTLA-4, костимулирующего активацию Т-клеток (Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for T cell activation), 1993, Science, 262:905-907]. B7 и B7-2 являются представителями суперсемейства иммуноглобулинов [G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Мышиный B7-2 - альтернативный противорецептор CTLA4, который костимулирует пролиферацию Т-клеток и продукцию интерлейкина-2 (Murine B7-2, an alternative CTLA-4 counter-receptor that costimulates Т cell proliferation and interleukin-2 production), 1993, J. Esp. Med., 178:2185-2192; G.J. Freeman, A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman и L.M. Nadler. B7 - новый член суперсемейства Ig с уникальной экспрессией на активированных В-клетках и В-клетках новообразований (В7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic В cells), 1989, J. Immunol., 143:2714-2722; G.J. Freeman, G.S. Gray, C.D. Gimmi и соавт. Структура, экспрессия и Т-клеточная костимуляторная активность мышиного гомолога человеческого антигена В7 активации В-лимфоцитов (Structure, expression, and Т cell costimulatory activity of the murine homologue of the human b lymphocyte activation antigen B7), 1991, J. Esp. Med., 174:625-631] и присутствуют только на активированных В-лимфоцитах [G.J. Freeman, A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman и L.M. Nadler. B7 - новый член суперсемейства Ig с уникальной экспрессией на активированных В-клетках и В-клетках новообразований (B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic В cells), 1989, J. Immunol., 143:2714-2722]. Ряд косвенных данных свидетельствует о взаимосвязи нового лиганда, В7-2, с костимуляцией Т-лимфоцитов: 1) связывание CTLA-4 с активированными В-клетками только частично ингибируется моноклональным антителом (mAb) против B7 [K.S. Hathcock, G. Laszlo, H.B. Dickter, J. Bradshaw, P.S. Linsley и R.J. Hodes. Идентификация лиганда, альтернативного CTLA-4, костимулирующего активацию Т-клеток (Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for Т cell activation), 1993, Science, 262:905-907]; 2) лимфоциты, выделенные у мышей, дефектных по экспрессии B7, могут тем не менее костимулировать Т-клетки [G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Открытие функционального альтернативного противорецептора CTLA-4 у В7-дефицитных мышей (Uncovering of functional alternative CTLA-4 counter-receptor in B7-deficient mice), 1993, Science, 262:907-909; G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Мышиный В7-2 - альтернативный противорецептор CTLA4, который костимулирует пролиферацию Т-клеток и продукцию интерлейкина-2 (Murine B7-2, an alternative CTLA-4 counter-receptor that costimulates Т cell proliferation and interleukin-2 production), 1993, J. Esp. Med., 178:2185-2192]; 3) трансфектанты, экспрессирующие только B7-2, могут костимулировать Т-клетки [G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Мышиный B7-2 - альтернативный противорецептор CTLA4, который костимулирует пролиферацию Т-клеток и продукцию интерлейкина-2 (Murine B7-2, an alternative CTLA-4 counter-receptor that costimulates Т cell proliferation and interleukin-2 production), 1993, J. Esp. Med., 178:2185-2192; G.J. Freeman, J.G. Gribben, V.A. Boussiotis и соавт. Клонирование B7-2 - противорецептора CTLA-4, костимулирующего пролиферацию Т-клеток человека (см. комментарии) (Cloning of B7-2: a CTLA-4 counter-receptor that costimulates human Т cell proliferation), 1993, Science, 262:909-911] и 4) mAb, специфическое в отношении B7-2, может ингибировать костимуляцию Т-лимфоцитов В-клетками [K.S. Hathcock, G. Laszlo, H.B. Dickter, J. Bradshaw, P.S. Linsley и R.J. Hodes. Идентификация лиганда, альтернативного CTLA-4, костимулирующего активацию Т-клеток (Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for Т cell activation), 1993, Science, 262:905-907] или трансфектантами B7-2 [G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Modes и соавт. Мышиный B7-2 - альтернативный противорецептор CTLA4, который костимулирует пролиферацию Т-клеток и продукцию интерлейкина-2 (Murine B7-2, an alternative CTLA-4 counter-receptor that costimulates Т cell proliferation and interleukin-2 production), 1993, J. Esp. Med., 178:2185-2192]. Значение изначально описанного антигена В7 как костимуляторного противорецептора является спорным, поскольку экспрессия В7-2 происходит раньше, чем экспрессия В7, и на поверхности активированных В-лимфоцитов присутствует больше антигенов В7-2, чем В7 [K.S. Hathcock, G. Laszlo, H.B. Dickter, J. Bradshaw, P.S. Unsley и R.J. Modes. Идентификация лиганда, альтернативного CTLA-4, костимулируюнщего активацию Т-клеток (Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for Т cell activation), 1993, Science, 262:905-907]. Схематическое представление костимуляции Т-лимфоцитов и костимуляторных противорецепторов проиллюстрировано на фиг.1.
Существует представленное различными исследователями предварительное доказательство того, что микробные продукты могут стимулировать В-лимфоциты. Liu и соавт. показали, что липолисахарид (LРS), митогенный вирус гриппа и антиген, который имитирует вирусную инфекцию (полиинозиновая-полицитидиловая кислота), стимулируют В-лимфоциты, которые, в свою очередь, костимулируют Т-лимфоциты [С.A. Janeway, Jr. и К. Bottomly. Сигналы и признаки ответов лимфоцитов (Signals and signs for lymphocyte responses), 1994, Cell, 76:275-285]. Vordermeier продемонстрировал, что очищенные порины Salmonella typhi (не содержащие LPS) являются сильными стимуляторами В-клеток, но оказывают минимальное воздействие на Т-лимфоциты [Н. Vordermeier и W.G. Bessler. Поликлональная активация мышиных В-лимфоцитов in vitro поринами Salmonella typhimurium (Polyclonal activation of murine В lymphocytes in vitro by Salmonella typhimurium porins), 1987, Immunobiol., 175:245-251; H. Vordermeier, H. Drexler и W.G. Bessler. Поликлональная активация человеческих лимфоцитов периферической крови бактериальными поринами и определенными фрагментами поринов (Polyclonal activation of human peripheral blood lymphocytes by bacterial porins and defined porin fragments), 1987. Immunol. Lett., 15:121-126]. Кроме того, препараты наружной мембраны менингококков, в основном состоящие из поринов менингококков, действуют как В-клеточные митогены и не стимулируют Т-лимфоциты [J. Melancon, R.A. Murgita и I.W. DeVoe. Активация мышиных В-лимфоцитов с помощью Neisseria meningitidis и выделенных поверхностных антигенов менингококков (Activation of murine В lymphocytes by Neisseria meningitidis and isolated meningococcal surface antigens), 1983, Infect. Immun., 42:471-479; B.G. Sparkes. Иммуномодулирующая активность антигенов менингококков (Immunomodulating activity of meningococcal antigens), 1983, Can. J. Micribiol., 29:1611-1618; B.G. Sparkes. Двойной эффект антигенов менингококков на зависимый от Т-клеток иммунный ответ (Dual effect of meningococcal antigens on Т cell dependent immune response), 1983, Can. J. Micribiol., 29:1619-1625]. Данное доказательство предполагает, что порины нейссерий и, возможно, порины других грамотрицательных бактерий могли бы быть способными стимулировать В-лимфоциты и повышать экспрессию В7-2. Повышенная экспрессия В7-2 может опосредовать костимуляцию Т-лимфоцитов, что могло бы являться механизмом, которым порины усиливают иммунный ответ на другие антигены, такие как представленный в данном контексте полисахарид PRP.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение направлено на конъюгат полисахарида Н. influenzae типа b (Hib) с практически очищенным переуложенным зрелым белком наружной мембраны класса 2 или 3 Neisseria meningitidis или его слитой формой, содержащей аминокислоты 1-20 или 1-22 капсидного белка
10 гена Т7 (rРоrВ).
Данное изобретение предлагает также способ получения конъюгата полисахарид Hib - rРоrВ, предусматривающего
(a) получение полисахарида Hib;
(b) окисление или селективный гидролиз указанного полисахарида с целью создания альдегидных групп;
(c) получение rРоrВ и
(d) конъюгирование полисахарида, содержащего альдегидные группы, с rРоrВ путем восстановительного аминирования (гидроаминирования).
Данное изобретение относится также к конъюгатам, полученным согласно способам, соответствующим изобретению. Необязательно конъюгаты, соответствующие данному изобретению, могут быть в комбинации с DTaP (вакцина против дифтерии, столбняка, бесклеточного коклюша).
Данное изобретение касается также фармацевтических композиций, содержащих конъюгаты, соответствующие изобретению, необязательно содержащие DTaP и фармацевтически приемлемый носитель.
Данное изобретение предлагает способ индукции иммунного ответа у животных в отношении Н. influenzae, предусматривающий введение конъюгатов, соответствующих изобретению, животному в количестве, эффективном для индукции указанного иммунного ответа.
Изобретение частично касается неожиданного открытия, что конъюгаты Hib-rPorB, соответствующие изобретению, индуцируют значительно более сильные иммунные ответы у животных по сравнению с использованием в качестве антигенного белка токсоида столбняка и рекомбинантным образом полученного белка наружной мембраны Р2 Н. influenzae. Значительно более сильные иммуногенные ответы также были получены сравнительно с конъюгатом Hib-CRM, который серийно выпускается компанией Lederle Laboratories, Division of American Cyanamid Company, Pearl River, NY. CRM
197 представляет собой полученный направленной мутацией нетоксичный вариант дифтерийного токсина, который выделен из культур Corynebacterium diphtheriae С7(
197) [см. статью Seid R.C.Jr. и соавт. Glycoconj. J., (1989) 6:489-498].
Более того, конъюгат, соответствующий данному изобретению, особенно применим в композициях, содержащих также DTaP, поскольку иммунологические взаимодействия между компонентами, а также эпитопная супрессия наблюдаются при использовании принятых белков-носителей, таких как токсоид столбняка. Конъюгаты, соответствующие данному изобретению, преодолевают данное серьезное ограничение в комбинированных вакцинных композициях.
Перечень фигур чертежей и иных материалов
На фиг.1 представлено графическое изображение костимуляции Т-лимфоцита.
На фиг.2 представлен график, показывающий ферментационный профиль В1НВ1030.
На фиг.3 представлен окрашенный гель SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) очищенного rРоrВ, использованного для конъюгирования.
На фиг.4 представлен график в виде столбиков, показывающий специфический в отношении полисахарида Hib ответ IgG у крыс на конъюгаты Hib с различными белками-носителями.
На фиг.5-1 - 5-8 представлены таблицы, показывающие сывороточные антитела у крыс Sprague-Dawley, иммунизированных Hib-TT, Hib-rPorB и Hib-rP2, определенные с помощью ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа).
На фиг.6-1 и 6-2 представлены данные, показывающие PRP-специфический ответ IgG у крыс на конъюгированные вакцины против Hib с различными белками-носителями, полученные с помощью ELISA. Были тестированы два различных препарата Hib-rPorB (-1 и -2). На фиг.6-1 в графической форме представляют табличные данные, показанные на фиг.6-2.
На фиг.7 представлен график, показывающий полисахарид-специфический IgG, вызываемый конъюгированными вакцинами против Hib у мышей CD-1.
На фиг.8 представлен график, показывающий полисахарид-специфический IgG, вызываемый конъюгированными вакцинами против Hib у крыс.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Данное изобретение касается вакцины для индукции иммунного ответа у животного, содержащей белок порина наружной мембраны менингококков группы В, связанный с полисахаридом Hib, вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или наполнителем, причем вакцина может быть введена в количестве, эффективном для того, чтобы вызвать иммунный ответ у животного к Н. influenzae. В предпочтительном варианте осуществления животное представлено млекопитающим, выбранным из группы, состоящей из человека, крупного рогатого скота, свиней и овец, а также курами. В другом предпочтительном варианте осуществления млекопитающее представлено человеком.
Под термином "rРоrВ" подразумевают зрелый переуложенный белок наружной мембраны класса 2 или класса 3 N. meningitidis и его слитые формы, содержащие аминокислоты 1-20 или 1-22 капсидного белка
10 гена Т7. Способы экспрессии на высоком уровне зрелого rРоrВ класса 2 и класса 3 и его слитых форм, переукладки и очистки представлены в [H.L. Qi, J.Y. Tai и M.S. Blake. Экспрессия больших количеств белков порина нейссерии в Escherichia coli и переукладка белков в нативные тримеры (Expression of large amounts of Neisserial porin proteins in Escherichia coli and refolding of the proteins into native trimers), 1994, Infect. Immun., 62:2432-2439] и Патенте США No 5439808, описания которых включены в контекст данной заявки в виде ссылки. Рекомбинантный порин может экспрессироваться на высоких уровнях в Е. coli согласно Патенту США No 5439808 или в дрожжах согласно заявке 08/792302. В предпочтительном варианте осуществления rРоrВ класса 3 экспрессируется в хозяине BL21(DE3)
ompA, который трансформирован геном, кодирующим rРоrВ, является практически очищенным и переукладывается согласно Патенту США No 5439808.
Капсулярный полисахарид Н. infeuenzaee может быть выделен в соответствии со способами, хорошо известными специалистам. См. работы Schneerson и соавт., J.Exp. Med., 152:361-376 (1980); Marburg и соавт., J. Am. Chem. Soc. 108:5282 (1986); Jennings и соавт., J. Immunol., 127:1011-1018 (1981) и Beuvery и соавт., Infect. Immunol., 40:39-45 (1983). В предпочтительном варианте осуществления культивируют организм, подвергают культуральный супернатант микрофильтрации и пропускают фильтрат через фильтр, отделяющий молекулы молекулярной массы 300000. Затем растворенное вещество концентрируют, например, с помощью фильтра, отделяющего молекулы молекулярной массы 100000. Данный материал молекулярной массы 100000-300000 затем окисляют мягким окислителем, таким как метапериодат, фильтруют через фильтр для отделения молекул молекулярной массы 30000, а затем концентрируют с помощью фильтра для молекулярной массы 5000 для получения полисахарида, имеющего альдегидные группы, которые могут быть непосредственно использованы для конъюгирования. Предпочтительный полисахарид имеет молекулярную массу приблизительно 5000-50000. Более предпочтительный полисахарид имеет молекулярную массу приблизительно 10000-50000, однако могут быть использованы другие интервалы молекулярных масс, если это желательно.
Специалисту будет понятно, что конъюгированные вакцины типа капсулярный полисахарид - белок-носитель могут быть получены рядом различных способов. Типы ковалентных связей, которые соединяют полисахарид с белком-носителем, и средства для их получения хорошо известны специалистам. Детали, относящиеся к химическим средствам, которыми могут быть связаны две структуры, можно найти в Патентах США Nо 5623057, 5371197, 5192540, 4902506 и 4356170, содержание которых включено в данном контексте по всей полноте. В качестве обзора см. издание Вклад в развитие микробиологии и иммунологии (Contributions to Microbiology and Immunology), том 10, Конъюгированные вакцины (Conjugate Vaccines), редакторы тома J.M.Cruse и R.E.Lewis, Jr., 1989 и (29). Одним из таких способов является восстановительное аминирование, описанное в статье Schwartz и Gray (Arch. Biochim. Biophys. 181:542-549 (1977)). Данный процесс включает получение полисахарида в форме, которая имеет концевые восстановительные группы, и реакцию капсулярного полисахарида и rРоrВ в присутствии ионов цианоборгидрида или иного восстановителя. Восстановительные группы могут быть образованы путем селективного гидролиза или специфического окислительного разложения или их комбинацией.
Вакцина, соответствующая данному изобретению, содержит конъюгат Hib-rPorB в эффективном количестве, которое зависит от способа введения. Хотя подкожный или внутримышечный способы введения являются предпочтительными, белок порина менингококков группы В, слитый белок или вакцина, соответствующие данному изобретению, могут быть также введены внутрибрюшинным, внутривенным или интраназальными способами. Специалист оценит, что количества, которые следует вводить согласно какому-либо определенному протоколу лечения, могут быть легко определены без излишнего экспериментирования. Ожидают, что подходящие количества находятся в интервале от 5 до 50 мкг/животное, более предпочтительно приблизительно 10 мкг/животное.
Вакцина, соответствующая данному изобретению, может быть использована в таких формах, как капсулы, жидкие растворы, суспензии или эликсиры для перорального применения или стерильные жидкие формы, такие как растворы или суспензии. Предпочтительно использование какого-либо инертного носителя, такого как солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор или любой носитель такого рода, в котором конъюгированная вакцина обладает подходящей растворимостью. Вакцины могут быть в форме препаратов, содержащих разовую дозу, или во флаконах, содержащих множество доз, которые могут применяться в программах массовой вакцинации. Относительно способов приготовления и применения вакцин ссылаемся на справочник "Фармацевтические науки" Ремингтона (Remington's Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co., Easton, PA, под ред. Osol, (1980) и монографию "Новые направления и разработки в области вакцин" ("New trends and developments in Vaccines") под. ред. Voller и соавт., University Park Press, Baltimore, MD (1978).
Вакцины, соответствующие данному изобретению, могут, кроме того, содержать адъюванты, которые усиливают продукцию антител, специфических в отношении Н. influenzaee. Данные адъюванты включают, но не ограничиваются различными масляными препаратами, такими как полный адъювант Фрейнда (CFA), стеарилтирозин (ST, см. Патент США No 4258029), дипептид, известный как MDP, сапонин, гидроксид алюминия и лимфатический цитокин.
Адъювант Фрейнда представляет собой эмульсию минерального масла и воды, которая смешана с иммуногенной субстанцией. Хотя адъювант Фрейнда является активным, его обычно не вводят человеку. Вместо этого для введения человеку может быть использован адъювант на основе квасцов (гидроксида алюминия) или ST. Конъюгированная вакцина может быть адсорбирована на гидроксиде алюминия, из которого она медленно высвобождается после инъекции. Конъюгированная вакцина может быть также инкапсулирована в липосомах согласно Патенту США No 4235877, выданному Fullerton.
В другом предпочтительном варианте осуществления конъюгат, соответствующий изобретению, комбинируют с другими иммуногенами, которые используют для вакцинации животных. Таким образом, конъюгат, соответствующий изобретению, можно комбинировать с DTaP или DTaP IPV для введения животному. DTaP представляет собой комбинированную вакцину против дифтерии, столбняка, бесклеточного коклюша, которую приобретают у Amvax, Inc., Beltsville, Maryland. В предпочтительном варианте осуществления бесклеточный коклюш представлен окисленной формой, такой, которая имеется у Amvax, Inc.
В другом предпочтительном варианте осуществления данное изобретение касается способа индукции иммунного ответа у животного, который предусматривает введение животному вакцины, соответствующей изобретению, в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа. Необязательно вакцина, соответствующая изобретению, может вводиться совместно с эффективными количествами других иммуногенов, как отмечено выше, для создания множества иммунных ответов у животного.
Следующие примеры служат для иллюстрации, но не для ограничения способа и композиций, соответствующих данному изобретению. Другие подходящие модификации и адаптации ряда условий и параметров, в норме встречающиеся в данной области, которые очевидны для специалистов, входят в сущность и объем данного изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Экспрессия, выделение, переукладка и очистка rРоrВ
Штаммы бактерий, условия роста и реагенты. Геномную ДНК выделяют из штамма N. meningitidis группы В 44/76 (серотип 15), применяя стандартные процедуры, и используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции с целью амплификации гена белка класса 3, как описывают в каких-либо других источниках [H.L. Qi, J.Y. Tai и M.S. Blake. Экспрессия больших количеств белков порина нейссерии в Escherichia coli и переукладка белков в нативные тримеры (Expression of large amounts of Neisserial porin proteins in Escherichia coli and refolding of the proteins into native trimers), 1994, Infect. Immun., 62:2432-2439]. Амплифицированный продукт клонируют в сайты NdeI и XhoI плазмиды pET17b (Novagen, Inc.), которую используют для трансформации компетентной Е. coli DH5a. Плазмидную ДНК из отобранных клонов DH5а выделяют и используют для трансформации Е. coli BL21 [DЕ3]-
оmрА. Трансформанты отбирают на фоне карбенициллина и индуцируют экспрессию добавлением IPTG до конечной концентрации 0,4 мМ.
Сверхэкспрессия rРоrВ в Е. соli и процедуры очистки путем переукладки.
Мониторинг уровней белка rРоrВ, экспрессируемого в различные моменты времени после индукции, проводят путем обработки экстрактов клеток SDS-PAGE в 8-16% градиентных гелях, используя систему Novex (Novex, San Diego, CA) с последующим окрашиванием Кумасси бриллиантовым голубым и денситометрическим анализом с использованием системы цифрового изображения модели IS-1000 (Alpha Innotech Co., San Leandro, CA). Полученный при сверхэкспрессии rРоrВ выделяют путем ресуспендирования и лизирования бактериальных клеток с помощью воздушного клеточного дезинтегратора Stansted (Stansted Fluid Power Ltd.) в буфере TEN (50 мМ трис-HCl, 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота, ЭДТК), 100 мМ NaCl, pH 8,0) с последующим центрифугированием и выделением осадка, содержащего rРоrВ, агрегированного в форме телец включений (IBs). После промывания осадка 0,5% дезоксихолатом в буфере TEN, за которым следуют два промывания буфером TEN, белок солюбилизируют посредством ресуспендирования и обработки ультразвуком IBs в течение 5 мин в свежеприготовленном растворе 8 М мочевины с использованием ультразвукового дезинтегратора с водяной баней. Переукладка rРоrВ в его нативную конформацию достигается при использовании процедуры переукладки с помощью детергента. Равные объемы растворенных в мочевине IBs и 10% Z 3-14 (Calbiochem) смешивают и конечный экстракт порина наносят на колонку Sephacryl S-300 (5
100 см) (Pharmacia Biotech Inc.), уравновешенную буфером, содержащим 100 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 10 мМ EDTA, 20 мМ CaClg и 0,05% Z 3-14, рН 8,0. Фракции, содержащие rРоrВ, идентифицируют с помощью SDS-PAGE, объединяют и наносят на ионообменную колонку Hiload Q-Sepharose HP (2,6
20 см) (Pharmacia), уравновешенную 25 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 1,0 мМ EDTA и 0,05% Z 3-14, рН 8,0. Используют градиент 0,2-1,0 мМ NaCl и элюируют rРоrВ в виде одного пика. Концентрацию белка определяют измерением поглощения при 280 нм, используя быстро сканирующий спектрофотометр HP модель 8453 UV/Vis, оборудованный диодным детектором (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA), с применением коэффициента молярной экстинкции 41,960, который вычисляют на основе содержания ароматических аминокислот в РоrВ согласно способу Масh и соавт. [Н. Mach, C.R. Middaugh и R.V. Lewis. Статистическое определение средних значений коэффициентов экстинкции триптофана и тирозина в нативных белках (Statistical determination of the average values of the extinction coefficients of tryptophan and tyrosin in native proteins), 1992, Anal. Biochem. 200:74-80].
Пример 2. Образование, очистка и окисление полисахарида PRP
Ферментацию Н. influenzae типа В в объеме 14 л проводят, используя среду МАЕ II, как следует ниже. Штамм Eagan H. influenzae типа В получают во флаконе для посевной культуры объемом 4 мл из хранения под жидким азотом в холодильнике для сверхнизких температур и оттаивают при комнатной температуре в течение тридцати минут. Колбу объемом 250 мл на качалке с 50 мл среды ММЕ II (10 мг/л гемина) инокулируют 1 мл посевной культуры для получения посевной культуры I (SI). Колбу SI инкубируют в течение 10 час при 37
С и 150 об./мин на термостатируемой качалке (Innova 4330, New Brunswick Sci). Двенадцать мл культуры SI используют для инокуляции 600 мл ММЕ II (10 мг/л гемина) в колбе Фернбаха с целью получения культуры SII. Колбу с культурой SII инкубируют в течение 9 час при 37
С и 150 об./мин на термостатируемой качалке. Шестьсот мл [4%-ный (об./об.) инокулюм] культуры SII используют для инокуляции 13,4 л ММЕ II (10 г/л ксилозы, 10 мг/л гемина) в ферментере BIOFLO IV емкостью 20 л (New Brunswick Sc.). Пример ферментационного профиля представляют на фиг.2. Через 10 час ферментации начинают сбор с помощью микрофильтрации, используя картриджс полыми волокнами с размером пор 0,2 мкм и площадью поверхности 0,14 м
2, выполненный из полисульфона (Milipore). Растворенное вещество стерильно фильтруют в оплетенную бутыль объемом 20 л и помещают бутыль на 2-8
С до дальнейшей обработки. Затем фильтрат пропускают через фильтр, отделяющий субстанцию молекулярной массы 300000 (MWCO) (Millipore) и сохраняют пропущенное сквозь фильтр растворенное вещество (пермеат). Данное растворенное вещество затем наносят на фильтр (MWCO) 100000 (Millipore) и концентрируют до содержания вещества более чем 20 мг/мл. Сохраненное вещество окисляют при 25
С в течение 2 час с помощью метапериодата натрия. Окисленный PRP подвергают ультрафильтрации через фильтр 30000 MWCO (Millipore) и сохраняют растворенное вещество. Данное растворенное вещество затем наносят фильтр (MWCO) 5000 (Millipore), концентрируют до конечной концентрации вещества более чем 90 мг/мл, диализуют против воды DI и лиофилизируют.
Пример 3. Приготовление конъюгата PRP-PorB
Очищенный rPorb, используемый для конъюгирования, представляют на фиг.3. Ранее описанный окисленный полисахарид PRP добавляют к раствору rPorb (в концентрации 10 мг/мл в 0,25 М HEPES, 0,2 М NaCl и 0,05% Zwittergen 3,14 с рН 8,5) для получения раствора полисахарида концентрации 10 мг/мл. Раствор перемешивают в течение 1 мин после добавления цианоборгидрида натрия в конечной концентрации 6 мг/мл. Затем раствор помещают в водяную баню при 28-30
С в течение от 16 до 24 час. Реакцию конъюгирования останавливают добавлением 2 М раствора этаноламина при рН 8,5 и инкубируют при 28-30
С в течение дополнительных 16-24 час. Затем реакционную смесь наносят на препаративную колонку Superdex 200 prep Grade (Pharmacia), предварительно уравновешенную, и проводят элюирование PBS (забуференным фосфатом физиологическим раствором), содержащим 0,01% тимеросала. Фракции, элюируемые со свободным объемом данной колонки, отслеженные по поглощению в УФ-280 нм, собирают, объединяют и хранят при 4
С до проведения анализа. Проводят два химических анализа - для оценки содержания PRP (анализ с использованием орсина/хлорида трехвалентного железа/гидрохлорной кислоты [G. Reuter и R. Schauer. Определение сиаловых кислот (Determinatoin of sialic acids), стр. 168-199. В издании W.J. Lennarz и G.W. Hart. Методы в энзимологии (Methods in Enzymology), т. 230. Методики в биологии гликосоединений (Techniques in Glycobiology). Academic Press, New York]) и содержания rPorB (анализ белка с использованием Кумасси [М. Bradford. Быстрый и чувствительный способ количественного определения белка, присутствующего в микрограммовых количествах, с использованием принципов связывания белок-краситель (А Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding), 1976, Analyt. Biochem., 72:248-254]).
Пример 4. Оценка конъюгата PRP-rPorB на крысах
Самкам крыс Sprague-Dawley (в возрасте 4-6 недель) в группах по 10 животных подкожно инъецируют 10 мкг конъюгированного PRP в 0,5 мл PBS, содержащего 0,01% тимеросала, либо в неадсорбированном виде, либо адсорбированного на гидроксиде алюминия (Alhydrogel, Superfos, Denmark) (конечная элементная концентрация алюминия 1 мг/мл) в дни 0, 28 и 49. Кровь берут в дни 0, 28, 38, 49 и животных обескровливают в день 59.
Измерение сывороточных антител с помощью ELISA. Конъюгаты человеческого сывороточного альбумина (HSA) (Sigma, St. Louis, МО), используемые в ELISA, готовят восстановительным аминированием, как описано выше. Окисленный полисахарид PRP добавляют к HSA с последующим восстановлением с помощью NаВН
3СN, как описывают в статье [H.J. Jennings, A. Gamian, F. Michon и F.A. Ashton. Уникальный межмолекулярный бактерицидный эпитоп, включающий гомосиалополисахаридную капсулу на поверхности клетки Neisseria meningitidis группы В и Escherichia coli K1 (Unique intermolecular bactericidal epitope involving the homosialopolysaccharide capsule on the cell surface of group В Neisseria meningitidis and Escherichia coli K1), 1989, J.Immunol., 142:3585-3591]. Конъюгаты выделяют гель-фильтрацией и хранят в лиофилизированном виде при -70
С. Титры PRP-специфических антител определяют твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA). Полистироловые 96-луночные планшеты для микротитрования с плоским дном (NUNC Polysorb) (Nunc, Naperville, IL) покрывают конъюгатами PRP-HSA в PBS (0,01 М фосфата натрия, 0,15 М NaCl, ph 7,4) при концентрации 0,25 мкг/лунку (100 мкл/лунку) посредством инкубирования в течение 1 час при 37
С с последующим пятикратным промыванием PBS-Tween (0,05% [об./об.] Tween 20 в PBS). Все последующие инкубирования проводят при комнатной температуре. PBS-Tween используют во всех рекомендуемых промываниях. Планшеты с покрытием блокируют с помощью PBS и 0,1% (мас./об.) обезжиренного сухого молока Carnation для IgM ELISA в концентрации 0,15 мл/лунку в течение 1 час с последующим промыванием. Сыворотки разводят в два раза в двух повторностях в планшетах по 100 мкл/лунку и инкубируют в течение 1 час с последующим промыванием. Конъюгат антитела (меченного пероксидазой антитела козы против кролика) [Kirkegaard & Perry Lab, Gaithersburg, MD] добавляют в концентрации 100 мкл/лунку и инкубируют в течение 30 мин с последующим промыванием. Краситель и раствор субстрата 1:1 (Kirkegaard & Perry TMB и пероксид) добавляют в количестве 0,05 мл/лунку и инкубируют в течение 10 мин. Затем реакцию пероксидазы останавливают с помощью 1 М Н
3РО
4 в количестве 0,05 мл/лунку и считывают результат на планшете с помощью ридера для микропланшетов Molecular Devices Emax (Molecular Devices, Menlo Park, CA) при длине волны 450 нм, с использованием 650 нм в качестве эталонной длины волны. Фоновое поглощение определяют в нескольких контрольных лунках, не содержащих сыворотку, и вычисляют среднее значение для каждого планшета. Из каждого разведения сыворотки вычитают среднее значение поглощения фона, а затем усредняют значения поглощения сыворотки в повторностях. Для последующего анализа данных используют модифицированный график Scatchard, в котором строят зависимость поглощения (ось Y) от обратного значения разведения (ось X) (18,22). В условиях, обеспечивающих равновесие и избыток антител, получают прямую линию для каждой серии разведении сыворотки, данную линию экстраполируют на ось Х для определения титра антител. Положительный контроль сыворотки с предварительно определенным титром антител используют на каждом планшете с целью обеспечения эталона, по которому стандартизуют все сыворотки, минимизируя вариации, зависящие от разных планшетов и дней. Результаты данных анализов, в которых сравнивают конъюгат PorB-PRP (с введением или без введения гидроксида алюминия) с конъюгатами, сконструированными из токсоида столбняка, CRM, представляют на фиг.4 и 5-1 - 5-8.
Пример 5. Сравнение Hib-rPorB, Hib-TT и двух имеющихся в продаже вакцин против Hib
Сравнивают иммуностимулирующие эффекты двух препаратов конъюгата Hib-rPorB (Hib-rPorB-1 и Hib-rPorB-2), конъюгата Hib-TT (токсоид столбняка) и двух имеющихся в продаже вакцин - НbОС от Lederle Laboratories, Division of American Cyanamide Company, Pearl River, NY (носитель CRM) и PRP-T от Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA (носитель токсоид столбняка).
Крыс (в возрасте 4-6 недель) иммунизируют конъюгированным PRP в дозах 10 мкг на 1, 28 и 49 дни. В дополнение к предварительно иммунизированным (преиммунным) образцам образцы сыворотки берут на 28, 38, 49 и 59 дни. Результаты представляют на фиг.6-1 и 6-2. Полученный с помощью ELISA титр IgG относится к антиполисахаридным антителам.
Графическое изображение данных на фиг.6-1 показывает, что конъюгаты Hib-rPorB генерируют ответ, по меньшей мере, на два порядка величины более высокий, чем ответ, полученный с другими конъюгированными вакцинами. На фиг.6-2 представляют соответствующие данные, сведенные в таблицу. "Отвечающие организмы" (респондеры) определяют как имеющие титры IgG по ELISA, превышающие более чем в 4 раза или равные 4-кратным относительно преиммунных, где все преиммунные значения составляют < 50 и подводят до 25 для вычислений. Аналогичные эксперименты для сравнения Hib-TT, Hib-rPorB-1 и Hib-rPorB-2 проводят на мышах, используя дозы конъюгатов 5,0 мкг и 0,5 мкг. Данные приводят на фиг.7.
Наконец, восемь различных препаратов Hib-rPorB (А-Н на фиг.8) сравнивают с конъюгатами Hib-TT и Hib-CRM. Препараты Hib-rPorB стабильно являются на два порядка величины более стимулирующими, чем конъюгаты Hib-TT и Hib-CRM, что показывают в исследованиях с помощью ELISA антиполисахаридных антител IgG у крыс. Данные результаты приводят на фиг.8.
Теперь после полного обсуждения данного изобретения для специалистов будет понятно, что изобретение может быть практически реализовано в широком и эквивалентном круге условий, препаратов и других параметров без влияния на объем изобретения или какой-либо вариант его осуществления. Все патенты, патентные заявки и публикации, цитированные в данном контексте, полностью включены в него в качестве ссылок во всей их полноте.
Формула изобретения
1. Иммуногенный конъюгат полисахарида Haemophilus influenzae типа b (Hib) с практически очищенным переуложенным зрелым белком наружной мембраны класса 2 или 3 Neisseria meningitidis или его слитой формой, содержащей аминокислоты 1-20 или 1-22 капсидного белка
10 гена Т7 (rРоrВ).
2. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что полисахарид имеет молекулярную массу в интервале 5000-50000.
3. Конъюгат по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный rРоr В является rРоrВ класса 3.
4. Способ получения конъюгата полисахарид Hib - rPorB, предусматривающий получение полисахарида Hib, получение rРоrВ и последующее конъюгирование, отличающийся тем, что указанный полисахарид подвергают окислению или селективному гидролизу для получения альдегидных групп, а конъюгирование полисахарида, содержащего альдегидные группы, с rРоrВ осуществляют посредством восстановительного аминирования.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный полисахарид Hib подвергают окислению, причем окисленный полисахарид имеет молекулярную массу в интервале 5000-50000.
6. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что указанный rРоrВ является rРоrВ класса 3.
7. Иммуногенный конъюгат полисахарида Н. influenzae типа b (Hib) с практически очищенным переуложенным зрелым белком наружной мембраны класса 3 N. meningitidis или его слитой формой, содержащей аминокислоты 1-20 или 1-22 капсидного белка
10 гена Т7, полученный согласно способу по п.6.
8. Иммуногенный конъюгат полисахарида Haemophilus influenzae типа b (Hib) с практически очищенным переуложенным зрелым белком наружной мембраны класса 2 или 3 Neisseria meningitidis или его слитой формой, содержащей аминокислоты 1-20 или 1-22 капсидного белка
10 гена Т7 (rРоrВ), полученный посредством восстановительного аминирования полисахарида Hib и rРоrВ, при этом полисахарид Hib окислен или селективно гидролизован для введения альдегидных групп.
9. Фармацевтическая композиция для индукции иммунного ответа у животного, содержащая конъюгат по одному из пп.1, 7 или 8 и фармацевтически приемлемый носитель.
10. Способ индукции иммунного ответа у животного в отношении Н. influenzae, заключающийся в том, что животному вводят конъюгат по одному из пп.1, 7 или 8 в количестве, эффективном для индукции указанного иммунного ответа.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный конъюгат получают путем восстановительного аминирования полисахарида Hib и rРоrВ, причем полисахарид Hib предварительно окисляют для получения альдегидных групп.
12. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный полисахарид имеет молекулярную массу в интервале 5000-50000.
13. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный rPorB является rPorB класса 3.
РИСУНКИ
Рисунок 1,
Рисунок 2,
Рисунок 3,
Рисунок 4,
Рисунок 5,
Рисунок 6,
Рисунок 7,
Рисунок 8,
Рисунок 9,
Рисунок 10,
Рисунок 11,
Рисунок 12,
Рисунок 13,
Рисунок 14,
Рисунок 15,
Рисунок 16TZ4A - Поправки к описаниям изобретений
Часть описания, где обнаружена ошибка: Текст реферата, Кол. 2, строки 10-11
Напечатано: …influenzae типа в (Hib)…
Следует читать: …influenzae типa b (Hib)…
Номер и год публикации бюллетеня: 21-2004
Извещение опубликовано: 20.10.2004 БИ: 29/2004
TZ4A - Поправки к описаниям изобретений
Часть описания, где обнаружена ошибка: Текст опис., Кол. 9, строки 35-36
Напечатано: …у пациентов, иммунизированных порином/СМ2,…
Следует читать: …у пациентов, иммунизированных порином/GM2,…
Номер и год публикации бюллетеня: 21-2004
Извещение опубликовано: 20.10.2004 БИ: 29/2004
TZ4A - Поправки к описаниям изобретений
Часть описания, где обнаружена ошибка: Текст опис .,Кол. 25, строка 41
Напечатано: …, 20 мМ CaClg и…
Следует читать: …, 20 мМ CaCl2 и…
Номер и год публикации бюллетеня: 21-2004
Извещение опубликовано: 20.10.2004 БИ: 29/2004
