Способ получения стерильной поверхности изделий из полистирола, пригодной для монослойного культивирования клеток млекопитающих
Использование: биотехнология, медицина , ветеринария. Сущность изобретения: на поверхность изделий из полистирола воздействуют импульсным УФ-облучением с длиной волны в диапазоне эффективного поглощения полистирола. Интенсивность облучения 2-10-3-106 Вт/см2, доза 2-20 Дж/см2. Модификация поверхности полистирола УФ-облучением способствует повышению эффективности клонирования клеток млекопитающих. 2 табл.
союз советских
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РесПуБлик (51)5 С 12 N 5/00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
nQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4852423/13 (22) 18.07.91 (46) 23.09.92. Бюл. М 35 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт медицинских полимеров (72), M.È.Áëèíoâà, А,Д,Громов, Н,П.Кузьмина, В.B,Ëoáêo, Г.А.Матюшин, В.С.Нечитайло и А.В.Чадов (56) M.J.ËLódoï, С.S.Clay, СеП Biol. Internat.
Reports, 1985, 9, 911-921. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТЕРИЛЬНОЙ
ПОВЕРХНОСТИ ИЗДЕЛИЙ ИЗ ПОЛИСТИРОЛА, ПРИГОДНОЙ ДЛЯ МОНОСЛОЙНОИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве изделий из полистирола, предназначенных для монослойного культивирования клеток млекопитающих.
Известен способ получения стерильной поверхности полистирола, пригодной для монослойного культивирования клеток млекопитающих, путем обработки серной кислотой с последующей стерилизацией изделий (1).
Недостатком данного способа является использование агрессивной жидкости, необходимость соблюдения специальных условий, а также многостадийность процесса обработки.
Известен также способ получения стерильной поверхности изделий из полистирола путем обработки поверхности .УФ-излучением (2).
Однако степень модификации поверхности недостаточна и вследствие этого эф„„ Ж ÄÄ 1763486 А1
ГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ (57) Использование: биотехнология, медицина, ветеринария. Сущность изобретения; на поверхность изделий из полистирола воздействуют импульсным УФ-облучением с длиной волны в диапазоне эффективного поглощения полистирола. Интенсивность облучения 2 10 — 3-10 Вт/см, доза 2-20
Дж/см . Модификация поверхности полистирола УФ-облучением способствует повышению эффективности клонирования клеток млекопитающих. 2 табл, фективность монослойного кул ьтивирования клеток низка.
Целью изобретения является повышение эффективности культивирования клеток.
Цель достигается тем, что поверхность изделия из полистирола облучают импульсным УФ-облучением с длиной волны в диапазоне эффективного поглощения полистирола (коэффициент поглощения более 100 см ) и дозой 2-20 Дж/см .
При определении пригодности поверхности для монослойного культивирования клеток млекопитающих использовали метод клонирования на перевиваемых клетках линии СНО (клетки китайского хомячка) и на перевиваемых клетках Lgzg (опухолевые клетки соединительной ткани мыши (фибробластоподобные), а также на первичнотрипсинизированных эпителиальных клетках (кератиноцитах) кожи новорожденных крысят, B качестве изделия, предназначенного для модификации поверхности с
1763486 целью монослойного культивирования, были выбраны чашки Петри из полистирола, серийно изготовляемые заводом "Ленполимер". Питательный средой при культивировании клеток СНО была смесь среды Игла и среды 199 (1:1) + 10/, сыворотки крупного рогатого скота, при культивирования клеток
L9zg среда Игла в модификации Дальбекко
+ 10 эмбриональной сыворотки. При культивировании клеток СНО и Lgzg в чашки Петри диаметром 35 и 40 мм, содержащих 2 мл питательной среды, высеивали по 100 клеток в каждую чашку. Клетки культивировали в течение 8-10 суток, после чего питательную среду удаляли, а чашки с образовавшимися клонами промывали солевым раствором или раствором Хэнкса для удаления остатков среды. Для повышения контрастности клоны окрашивались кристаллвиолетом. Подсчет клоном проводили с помощью оптического микроскопа.
Количественным показателем ответа клеток на свойства поверхности чашек Петри служит эффективность клонирования, определяемая как отношение числа сформировавшихся на чашках Петри клонов к дозе посева (абсолютная эффективность).
Для сравнительной характеристики вычисляют относительную эффективность, клонирования каждого варианта, т,е. отношение его абсолютной эффективности к абсолютной эффективности на чашках Петри зарубежных фирм в процентах.
Качественной характеристикой являлась морфология клонов (степень компактности и однородности), их размеры, а также морфология клеток в соответствии с их нормальным фибробластоподобным фенотипом (т.е. соответствует ли форма клетки их нормальному фибробластоподобному состоянию). В качестве контроля использовали чашки Петри, обработанные по известному способу УФ-излучением, а также чашки Петри зарубежных фирм "Nunc" и
"Flow Laboratories", специально предназначенные для монослойного культивирования клеток.
Примеры конкретного выполнения изобретения.
Примеры 1-5, 8 и 9.
Поверхность чашки Петри облучают импульсным УФ-излучением эксимерного лазера.
Примеры 6, 7 и 10.
5 Поверхность чашки Петри облучают излучением импульсной лампы ИФП-800. Изменение спектральной полосы излучения осуществляют за счет использования различных светофильтров (пример 6, свето10 фильтр УФС 5; пример 7, светофильтр
УФС 8).
Пример 11 (по прототипу).
Поверхность чашки Петри облучают, непрерывным излучением УФ лампы ДРТ-220.
Характеристики обработки полимерных изделий УФ излучением и эффективность клонирования перевиваемых клеток по примерам 1-11 приведены соответственно в
20 табл.1 и 2.
Эксперименты по культивированию первично-трипсинизированных эпителиальных клеток (кератиноцитов) кожи новорожденных крысят проводились при дозе
25 посева (70 — 100) 10 клеток на чашку Петри диаметром 35 и 40 мм. Было обнаружено, что на необработанной поверхности чашек
Петри производства завода "Ленполимер" клетки не прикрепляются. Эти же клетки, 30 посеянные на чашки Петри производства . фирм "Flow Lab. и "Corning" оседают, прикрепляются и за 7-10 дней формируют колонии или участки монослоя максимальной величины. Данные первичные клетки на по35 верхности чашек Петри, обработанных импульсным излучением, за тот же срок образуют колонии несколько меньшей площади, чем для указанных фирм, Формула изобретения
40 Способ получения стерильной поверхности изделий из полистирола, пригодной для монослойного культивирования клеток млекопитающих путем УФ-облучения, отличающийся тем, что, с целью
45 повышения эффективности культивирования клеток, поверхности облучают импульным УФ-излучением с длиной волны в диапазоне эффективного поглощения полистирола с интенсивностью 2 10 — 3 10
50 Вт/см и дозой 2 — 20 Дж/см .
1763486
Таблица 1
Характеристики обработки полимерных изделий
УФ излучением
Таблица2
Эффективность клонирования перевиваемык клеток линий CMO и 1. и описание клонов на ловерхности иэделий иэ полистирола
Клетки СНО
Клетки L <> и п эффективность клонирования состояние клонов и клеток состояние клонов и клеток эффективность клонирования морфоПОГИЯ
В КЛОне а бсолютная, 2 относи- морфотельная логия размер клонов абсолютная, 2 мОРФО" логия в клоне
МОРФОЛОГИЯ размер
КЛО нов относительная, Кр
Ко
Фирма uHov
Laboratorisu
Кр
100
Ко
32,3
Ко - компактные, однородные
Н - неодмородные
Иорфология клонов.
КрМ "Ф
Размер клонов:
ИОРФОПОГиЯ КЛЕток. крупные мелкие фибробластоподобные округлые
Составитель М. Смиренская
Техред М.Моргентал Корректор Л. Ливринц
Редактор Н. Козлова
Заказ 3430 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва. Ж-35. Раушская наб„4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
2
4
6
8
11
47 102
53 116
48 104
47 102
46 100
47 104
20 44
24 53
ll 23
32 70
Фирма "Nunc"
46 100
l Ко Ко Ко Ко Ко Н Н Н Ко Кр Ф 38 Кр Ф 36 Кр Ф 34 Кр Ф 37 Кр Ф 40 Кр Ф 34 Кр 0 26 Кр Ф 12 И 0 6 Н О 27 И 0 1,1 117 Ко Кр 111 Ко Кр 105 Ко Кр 115 Ко Кр 124 Ко Кр 105 Ко Кр 80 Н И 37 Н Н 19 Н И 84 Н И 3 Н И Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф 0 Ф 
