Способ микроклонального размножения ели обыкновенной ин витро
Использование: биотехнология, культивирование тканей и клеток, лесное хозяйство . Сущность изобретения: зиготический зародыш эксплантируют на питательную среду Арнольд-Эриксона, получают первичный каллус, который переносят на ту же среду, дополнительно содержащую 6- БАП и АБК, получают соматические эмбриоиды, Полученные эмбриоиды помещают на жидкую питательную среду, содержащую 2% сахарозы и 1/4 часть ингредиентов по прописи Арнольд-Эриксона и получают регенеранты с использованием для поддержки гранул полиэтилена высокой плотности. 1 з. п. ф-лы, 2 табл. СО с «
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 А 01 Н 4/00, С 12 N 5/04
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ,4 0
C) (л
4 (21) 4846701/13 (22) 09.07.90 (46) 15.09.92. Бюл. ¹ 34 (71) Ленинградский научно-исследовательский институт лесного хозяйства (72) П.В. Божков, Л.А. Лебеденко и Г.А. Ширяева (56) Verhagen S,А., Warm ЯЯ. — Norway
spruce somatic embryogenesis: high
frequency initiation from iight-cultured
mature embryos. — Plant Cell. Tissue à, Organ
Culfure 1989, 16, с. 103 — 111.
Jain S.M., Newton R,l. 5oltes Е.l.—
EnhGncement of somatic embryogenesis in
Norway spruce (Picea abies (.) — Theoretical а, applied genetics 1988, 76, 4, с. 501-506.
Becwar М.R., Noiand ТЛ.„Wyckoff I,L,—
Maturation, germinatiom and conversion of
Norway spruce (Picea abies 1.) somatic
embryes to plants — In vitro, 1989, ч. 25. ¹ 6, с. 575-580.
Arnold S., Hakman i. — Regulatiom of
somatic embryo development in Picea abies
by abscisis acid (АВА) — J, Plant physiol. 1988, 132, 3. с. 164-169.
Изобретение относится к методам микроклонального размножения растений ин витро и может быть использовано для ускоренного получения посадочного материала северных видов хвойных пород, Существует два основных подхода к микроклонированию ин витра: органогенез, при котором образуются побеги, и соматический эмбриогенез, когда происходит образование эмбрионов не из зиготы, как при половом размножении, а из соматических клеток.... Ж „, 1761057 А1 (54) СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РА3МНОЖЕНИЯ ЕЛИ ОБЫКНОВЕННОЙ ИН
ВИТРО (57) Использование: биотехнология, культивирование тканей и клеток, лесное хозяйство, Сущность изобретения: зиготический зародыш эксплантируют на питательную среду Арнольд-Эриксона, получают первичный каплус, который переносят на ту же среду, дополнительно содержащую 6БАП и АБК, получают соматические эмбриоиды, Полученные эмбриоиды помещают на жидкую питательную среду, содержащую
27, сахарозы и 1/4 часть ингредиентов по прописи Арнольд-Эриксона и получают регенеранты с использованием для поддержки гранул полиэтилена высокой плотности.
1 з. и, флы, 2 табл.
Известен способ получения проростков из соматических эмбрионов ели, включающий получение эмбриогенного каллуса из зрелых семенных зародышей на половинной агаризованной среде Брауна и Лоренса с добавлением нафтилуксусной (НУК) или 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и 6-бензиламинопурина (БАП), созревание соматических эмбрионов на агаризованной среде Арнольд и Эриксона с добавлением 0,3 мг/л абсцизовой кислоты (АБК) и индукцию корней на той же среде без гормонов, (Verhagen S.À., Warm S.R.—
1761057
50
Norway spruce somatic embryogenesis: high
frequency initiation from light-cultured
mature embryos, — Plant Cell. Tissue a. Organ
Culture. 1989, 16, с. 101 — 111).
Известен способ, при котором культивирование зрелых зародышей происходит в темноте с использованием на первом этапе среды Арнольд и Эриксона с добавлением 2,2 мг/л 2,4-Д, 1,1 мг/л БАП и 1 сахарозы, а на втором этапе с добавлением 0,2 мг/л НУК и 0,3 мг/л АБК, (Tain S.Ì.
Newton КЛ., Soltes Е,l. — Enhancement of
somatic embryogenesis in Norway spruce (Picea abies L.) — Theoretical à, applied.
genetics. 1988, 76, 4, с. 501-506), Известен способ поэтапного культивирования незрелых зародышей на агаризованной среде Арнольд и Эриксона с
2,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л БАП (для инициации эмбриогенного каллуса), с 1% активированного угля в течение 1 недели, с добавлением 0,3 мг/л АБК и 0,2 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМ К) в течение
2 недель и с дальнейшими пересадками на свежую среду с АБК и ИМ К через каждые 3 недели (для стимуляции созревания), с разбавлением среды 1:3 и исключением гормонов (для проращивания соматических эмбрионов). (Becwar М,R., Noland T,L„
Wyckoff I.L. — Maturation, germination and
conversion of Norway spruce (Picea abies L.)
somatic embryos to plants. — In vitro, 1989, 25, 6, с. 575 — 580).
В СССР вообще нет публикаций, касающихся соматического эмбриогенеза хвойных пород ин витро, Общим недостатком описанных спосов является невысокая продуктивность отдельных этапов формирования соматических эмбрионов и низкий выход регенера нтов.
Наиболее близким к предлагаемому является способ регенерации растений из зрелых и незрелых семян путем темновой индукции эмбриогенного каллуса на среде
Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:1, с
1,9 мг/л НУК, 1,1 мг/л БАП и 1 сахарозой, темновой стимуляции созревания соматических эмбрионов на той же среде с 2,0 мг/л
АБК и 3 сахарозы и укоренения на свету при 20-часовом фотопериаде на безгормонной среде Арнольд и Эриксона с.2 сахарозой (Arnold S., Hakman I, — Regulation of
somatis embryo development in Picea abies
by abscisis acid (АВА) — J. Plant Physiol„
1988, 132, 3, 164-169).
Однако выход растений-реагентов по данному способу также невелик;
Целью изобретения является увеличение выхода растений-регенерантов, 5
Поставленная цель достигается тем, что в отличие от известного способа, включающего инициирование эмбриогенного каллуса на агаровой питательной среде
Арнольд и Эриксона, получение соматических эмбрионов на той же питательной среде с использованием абсцизовой кислоты и последующее их проращивание, на этапе получения соматических амбрионов на питательную среду Арнольд и Эриксона абсцизовую кислоту вводят совместно с б-бензиламинопурином, а проращивание осуществляют на свету на жидкой среде
Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:3 с
2 сахарозой. В качестве поддержки при проращивании используют гранулы полиэтилена высокой плотности, Абсцизовую кислоту и б-бензиламинопурин вводят в питательную среду в количестве 2 мг/л и 0,2 мг/л соответственно.
Таким образом, сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом подтверждает его соответствие критерию изобретения "новизна".
Для выявления соответствия заявляемого технического решения критерию "существенные отличия" проведен поиск известных решений, содержащих отличительные от прототипа признаки. в результате которого выявлено раздельное поэтапное введение БАП и АБК в питательную среду, в частности, во всех указанных выше аналогах, где они выполняют свою роль регулятора роста.
Действие АБК известно как ингибитора клеточных делений, ростовых и регенерационных процессов, как индуктора старения, ингибитора синтеза РНК, ферментов белкового синтеза и фотосинтеза. (В,И, Кефели, В.М, Коф, П,В. Власов, Е.Н, Кислин. Природный ингибитор роста — абсцизовая кислота.
M. Наука, 1989, с, 183).
Отмечена роль БАП в активизации клеточных делений, ростовых и регенерационных процессах, в задержке старения, его способность активизировать синтез PHK и белка, ферментов белкового синтеза и фотосинтеза, активизировать транспорт метаболитов(О.Н. Кулаева. Цитокинины, их структура и функция. М„Наука, 1973, с, 264.
Е.Г. Романенко, С,Ю. Селиванкина и др, Активация цитокинин-рецепторным комплексом из листьев ячменя синтеза PHK ин витра, Докл. АН СССР 1980, 252, 2, 488—
489), Известно стимулирующее действие
АБК и БАП (вместе) на синтез РНК, причем
АБК увеличивает количество РНК с низкой молекулярной массой, а БАП вЂ” с высокой
1761057
20 (С.Ю. Селиванкина, Романенко Е.Г., Каравайко М.Н., Кулаева О.Н, Активизация синтеза PHK ин витро под действием цитокинина и абсцизовой кислоты в присутствии цитокининосвязывающих белков, Докл, АН СССР, 1983, т. 272, 3, 761 — 763).
Однако совместное применение АБК и БАП в данном случае использовалось лишь для изучения механизма их действия и не затрагивало проблемы морфогенеза.
Эффект применения АБК на стадии формирования зрелых соматических эмбрионов связан с торможением деления эмбриогенных клеток, в результате чего, по-видимому, создаются благоприятные эндогенные условия для дальнейшего развития образовавшихся ранее проэмбриональных структур.
Усиление действия АБК в присутствии
БАП скорее всего объясняется способностью последнего активизировать транспорт подвижных метаболитов к центрам эмбриональной активности. Таким образом, при совместном введении в питательную среду
БАП и АБК проявляется новое их свойство как стимулятора созревания соматических эмбрионов, что ведет в свою очередь к увеличению выхода растений-регенерантов, Таким признаки, как проращивание соматических эмбрионов на свету на жидкой среде Арнольд и Эриксона, разбавленной
1:3 с 2 сахарозой, с использованием в качестве подддержки гранул полиэтилена высокой плотности не выявлены в других технических решениях при изучении информационных источников в данной области биологии. Следовательно, заявляемый объект соответствует критерию изобретения
"существенные отличия", Предлагаемый способ реализован следующим образом, Опыты были проведены в лаборатории лесовосстановления ЛенНИИЛХ.
При инициировании эмбриогенного каллуса зрелые и незрелые семенные зародыши ели помещают на агаризованную модифицированную среду Арнольд и
Эриксона (1981) с 450 мг/л МН4ИОз, 50 мг/л 1=глутамина, 3 сахарозы, 2,2 мг/л
2,4-Д(дихлорфеноксиуксусной кислоты) и
1,1 мг/л бензиламинопурина.
Полученный на этой среде эмбриогенный каллус через 6 недель переносят на поддерживающую рост среду Арнольд и
Эриксона, разбавленную 1:1, с 1200 мг/л
NH 6 недель. Первые 9 недель культуры растут g0 55 в темноте, затем при 16-часовом фотопериоде до формирования соматических эмбрионов. Для стимуляции созревания соматических эмбрионов каллус переносят на среду того же состава с пониженным до 2 содержанием сахарозы, 0,2 мг/л БАП и 2 мг/л АБК, Затем через каждые 3 недели каллусы пассируют на эту же основную среду с 2,0 мг/л АБК без БАП и многократно отделяют созревшие соматические эмбрионы. На этапе проращивания отделяемые соматические эмбрионы высаживают на стерильные гранулы полиэтилена высокой плотности, покрытые слоем марли, увлажНВННоА жидкой безгормональной средой Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:3, с 2 сахарозой. После 4 недель проращивания проростки с первичным корнем длиной не менее 10 мм высаживают в стерильную смесь торфпесок-перлит (6:2:1 по объему). Растения содержат под полиэтиленовой пленкой при 16-часовом фотопериоде (освещенность 3,0 тыс. лк), ежедневно опрыскивают водой и через день поливают раствором минеральных солей по Арнольд и Эриксону, разбавileHHblM 1;3, В тех же условиях были проведены опыты, в которых на этапе проращивания соматических эмбрионов использована агаровая среда по прототипу и жидкая среда Арнольд и Эриксона, разбавленная 1:3, с различным содержанием сахарозы, Опытные данные сведены в таблицу. Наилучшие результаты отмечены при использовании жидкой среды Арнольд и Эриксона, разбавленной 1;3, с 2 / сахарозой. При использовании 1 сахарозы получают лишь 55 корнеобразования. Увеличение же содержания сахарозы выше 2 не влияет на процент корнеобразования, не уменьшает длину корня, что важно при перенесении проростков е почву, Из приведенных результатов исследований видно, что при использовании жидкой среды Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:3, образование корней увеличивается до 82 по сравнению с 32 на агаровой среде по прототипу. Таким образом, предлагаемый способ за счет стимуляции созревания соматических эмбрионов и стимуляции корнеобразования, достигаемой совокупностью отличительных признаков, дает сле1761057 Формула изобретения Таблица 1 Таблица 2 П е лагаемый способ Известный способ Ха акте истика Частота образования эмбриогенных линий относительно введенных в культуру зародышей, Среднее количество соматических эмбрионов, отделяемых с r каллуса Частота ко необ азования 97 472 51 Составитель Г, Ширяева . Редактор M. Васильева Техред М.Моргентал Корректор П. Гереши Заказ 3199 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101 дующие преимущества на примере незрелых семян(табл.2), При использовании в опытах зрелых семян изменяется лишь показатель частоты образований эмбриогенных линий, составляющий 65о . Предлагаемый способ позволяет получить в среднем 200 проростков от одного зрелого семени и 300 от незрелого на срок 6 — 7 месяцев, 1. Способ микроклонального размножения ели обыкновенной ин витро, включающий эксплантацию зиготического зародыша и инициацию эмбриогенного каллуса на агаризованной питательной среде Арнольд и Эриксона, содержащей ауксины и цитокинины, получение соматических эмбрионов на той же питательной среде, содержащей 2,0 мг/л абсцизовой кислоты, и последующее выращивание из эмбриоидов растений-регенераторов на безгормональной среде, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода растений-регене5 рантов, на этапе получения соматических эмбриоидов в питательную среду абсцизовую кислоту вводят совместно с 6-бензиламинопурином и растения-регенеранты получают на жидкой питательной среде с 10 использованием для поддержки эмбриоидов гранул полиэтилена высокой плотности, при этом содержание сахарозы в среде составляет 2 j, а остальные ингредиенты питательной среды разбавляют в соотноше15 нии 1:3. 2, Способ по п, 1, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода соматических эмбриоидов, для начала стимуля20 ции их образования 6-бензиламинопурин вводят в питательную среду в количестве 0,2 мг/л.
