Способ определения резистентности к вирусу гриппа

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки иммунной защиты людей от гриппа А и В в эпидемии. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ включает в себя следующие операции: забор сывороток крови в предэпидемический период, определение количества антител в РТГА через 0,25 ч, 0,5 ч, 1,0 ч, 2,0 ч, 4,0 ч и 16,0 ч контакта сыворотки с антигеном, вычисление по формуле индекса функциональной активности антител у обследуемых лиц, выделение группы с высокими (10,0) индексами. Эту группу, считают защищенной от заболевания гриппом . Совпадение прогноза - в 85-90% случаев . Способ обладает простотой и доступностью, его преимущество перед традиционным методом оценки защиты от гриппа по титрам антител заключается в значительно большей точности (точность возрастает по сравнению с прототипом на 75%).

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ И СТИЧ Е СКИХ

РЕСПУБЛИК (5! ) 5 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4825526/14 (22) 14.05.90 (46) 23.10.92. Бюл. М 39 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа (72) А.Н.Найхин, С.A,Àðòåìüåâà, Л.Г.Каторгина, Ю.Г.Кустикова и T.Ë,Ïoïîâà (56) 1. Гордон М.А. Корреляция между уровнем гуморального иммунитета и заболеваемостью вирусом гриппа. А. — Автореферат, канд. дисс., Л., 1975. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ВИРУСУ ГРИППА (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки иммунной защиты людей от гриппа А и В в эпидемии. Цель изобретения — повышение

Изобретение относится к медицине (к эпидемиологии и иммунологии вирусных инфекций) и может быть использовано для оценки иммунной защиты людей в эпидемии гриппа А и В, Грипп является глобальной инфекцией, приносящей значительный урон здоровью населения, экономике и обороноспособности страны. Для проведения целенаправленных профилактических мероприятий в открытых (предприятия) и изолированных (воинские гарнизоны, училища, интернаты) коллективах необходима разработка надежного способа контроля защищенности людей в предстоящую эпидемию.

Известен метод основания на количественном определении у людей в реакции непрямой гемагглютинации иммуноглобулинов А в секретах верхних дыхательных путей. Однако названный способ не имеет самостоятельного значения и может быть

Ы2 „1770908 À1 точности способа. Способ включает в себя следующие операции: забор сывороток крови в предэпидемический период, определение количества антител в РТГА через 0,25 ч, 0.5 ч, 1.0 ч, 2,0 ч, 4,0 ч и 16,0 ч контакта сыворотки с антигеном, вычисление по формуле индекса функциональной ак1ивности антител у обследуемых лиц, выделение группы с высокими (10,0) индексами. Эту группу. считают защищенной от заболевания гриппом. Совпадение прогноза — в 85 — 90 случаев. Способ обладает простотой и доступностью, его преимущество передтрадиционным методом оценки защиты от гриппа по титрам антител заключается в значительно большей точности (точность: ! возрастает по сравнению с прототипом на

75 / ) использован лишь в совокупности с исследованием сывороток крови на наличие циркулирующих в крови антител.

Наиболее близким к заявленному (прототип) является широко применяемый способ оценки резистентности к гриппу А и В, предусматривающий количественное выявление у людей в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) циркулирующих в крови специфических антител (1), Поданным авторов, имеется четкая корреляция между заболеваемостью людей в коллективах в эпидемию гриппа и исходными титрами этих антител: лица, имеющие титры 1:20 и меньше (1:20) заболевают гриппом существенно чаще, чем лица с более высокими титрами. Однако, при использовании прототипа при обследовании колгективов доля людей с низкими титрами антител (1:20) к возбудителю предстоящей эпидемии составляет подавляющее большинс1 во (901770908

30 )г,:Т) +(4) +(Т16: Т16) () tmax

0,5 ) + ... « °

I/2 (2) Тпих . Т4 +

50, 957;). Однако из их числа заболевают гриппом лишь 30-70%, а остальные остаются резистентными, т.е. точность способа довольно низка.

Целью предлагаемого способа является повышение точности определения устойчивости людей к заболеванию гриппом.

Способ осуществляют следующим образом, В ноябре у лиц, у которых необходимо определить устойчивость к гриппу в предстоящую эпидемию, берут образцы крови иэ пальца в,количестве 1,0 мл. После осаждения эритроцитарной массы сыворотку отсасывают, разводят ее B пробирках до рабочего разведения 1:10(0,2 мл сыворотки

+ 1;8 мл физраствора) и прогревают при 56 в течение 1 часа в водяной бане. Далее ставят кинетический вариант РТГА, для чего s лунки серологических макропланшет вносят по 0,1 мл физиологического раствора, Каждую исследуемую сыворотку (разведение

1:10) делят на 6 частей по 0,2 мл каждая и титруют на планшете с разведения 1:10 до

1:320. Таким образом, получают 6 раститрованных образцов одной и той же сыворотки, необходимых для различных временных контактов с антигеном.

Каждую порцию раститрованной сыворотки соединяют (строго фиксируя время) с

0.1 мл 4ЛЕ антигена актуального вируса гриппа, Из трех ныне циркулирующих сераподтипом /A(H1N1), А(НЗ)ч2) и В/ выбирают где Т1г;То,zq — обратные величины титров антител после контакта сыворотки с антигеном в течение 16,0; 4,0; 2,0; 1,0; 0,5 и 0,25 часа;

tmax — время достижения максимального титра антител; где Tmax — обратная величина максимального титра антител;

Ч вЂ” и) декс ФА антител.

Далее выделяют группу людей с индексом ФА антител 10 и выше (>10) и считают ее защищенной от гриппа в предстоящую эпидемию.

Примеры конкретного выполнения способа, П р и м,е р 1. У Новохатского А,А., 1970 г, рождения, новобранца учебного батальоантиген из актуального штамма того серопадтипа, который по ежегодному прогнозу

Всесоюзного центра по гриппу и ОР3 вызовет эпидемию. Соединение сыворотки с 4АЕ антигена осуществляют по следующей схеме; 1-я порция — в 20 часов, 2-я — в 8 часов утра следук)щего дня, 3-я — в 10 часов, 4-я— в 11 часов, 5-я — в 11 часов 30 минут и 6-я— в 11 часов 45 минут. В 12 часов во все лунки планшетов вносят по 0,2 мл 1 эритроцитов кур. В итоге получается, что 1-я-6-я порции сыворотки конкретного человека контактируют с антигеном соответственно 16, 4, 2, 1, 0,5 и 0,25 часа.

После оседания эритроцитов фиксируют титры антител в зависимости от времени контакта исследуемой сыворотки с антигеном, что дает возможность наблюдать за ско ростью, интенсивностью и прочностью

20 соединения антител с антигеном (образованием иммунных комплексов) у разных людей. Данные процесса оцениваются в едином интегральном количественном показателе — индекс функциональной а ктивности (ФА) антител.

Подсчет индекса ФА осуществляется по двум формулам: а) для случаев с прочными иммунными комплексами (ИК), т.е. rîãäà титры антител за 16 часов контакта сыворотки с антигеном не снижаются после достижения максимального показателя, применяется формула .

V1 — индекс ФА антител. б) для случаев с непрочным ИК, т.е, когда титры антител снижаются после достижения максимального показателя, используется формула: на в конце ноября 1988 г. взята кровь иэ пальца в количестве 1,0 мл. После осаждения зритроцитов отделили сыворотку в количестве 0,6 мл, В начале декабря 1989 r. сыворотку исследовали в РТГА на функциональную активность антител. Для этого

0,2 мл cb)BopoTKw соединили в пробирке с

1,8 мл физиологического раствора. С целью удаления термолабильных ингибитаров гемагглютинации разведенную 1:10 сыворотку прогревали в водяной бане при 56ОС в течение 1 часа. Далее в 6 рядов серологиче1770908

10 згз: з згс:1 зго}+ э

57,5 ского макропланшета, содержащего во всех лунках, кроме первой, по 0,1 мл физраствора, внесли в первые и вторые лунки по 0,1 мл прогретой сыворотки. Все 6 порций сыворотки рэститровали со второй лунки до разведения 1:320, Таким образом, получили

6 разведений сыворотки с 1:10 и 1:320.

В качестве антигена использовали актуальный ингибиторорезистентный вирус

А/Тайвань/1/86 (H1N1), поскольку прогноз

Всесоюзного центра по гриппу и ОРЗ свидетельствовал о возникновении эмидемии гриппа A(H1N1), Каждую порцию раститрованной сыворотки соединяли последовательно с 0,1 мп 15

4АЕ антигена по следующей схеме: 1-ая порЗа титр антител по прототипному способу принимали показатель, который фиксировали после контакта сыворотки с антигеном в течение 1 часа, т.е. 1:10.

Таким образом, Новохватский А.А. имел 25 перед эпидемией титр антител 1;10 и индекс

ФА антител 57,5. Прогноз по прототипному способу — не защищен от гриппа и заболеет, по предлагаемому- защищен и не заболеет.

Вспышка гриппа A(H1N1) в коллективе 30 развилась в конце января и закончилась в феврале 1989 г. В начале марта 1989 r. y

А.А.Новохатского взята вторая сыворотка крови по описанной выше методике, и парные сыворотки (отобранные до и после эпи- 35 демии) исследованы в РТГА с вирусом гриппа А/Тайвань/1/86 (H1N1} традиционным способом на предмет обнаружения диагностического прироста антител. Титр антител 1-й сыворотки — 1 10, второй — 1:10. 40

Учитывая, что в период вспышки у А,A.Íîâoхатского не обнаружено клинических проявлений болезни, а также отсутствовала диагностическая сероконверсия антител, сделан вывод о том, что Новохатский грип- 45 пом не болел, т.е. был защищен вследствие высокой ФА специфичности антител, несмотря на их низкий количественный показатель.

Пример 2. Приходько И.Г„1970 r. 50 рождения из того >ке коллектива, Все манипуляции по забору и исследованию сывороток крови проделаны как в примере 1.

При постановке кинетической РТГА получены следующие данные: контакт сы- 55 воротки с антигеном в течение 0,25 часа— титр антител 1;20, контакт 0,5 часа — титр

1:20, контакт 1,0 час — титр 1:20, контакт 2,0 часа — титр 1:20, контакт 4,0 часа — титр 1:20, контакт 16,0 часов — титр 1:10. ция — в 20 часов, 2-ая — в 8 часов утра следующего дня, 3-я — в 10 часов, 4-я — в 11 часов, 5-я — в 11 часов 30 минут и 6-я — в 11 часов

45 минут. В 12 часов в каждую лунку вносили

0,2 мл 1% эритроцитов кур. После оседания эритроцитов фиксировали титры антител, Были получены следующие показатели в зависимости от времени контакта сыворотки с антигеном: контакт 0,25 часа — титр 1:5, контакт 0,5 часа — титр 1:10, контакт 1,0 часа— титр 1:10, контакт 2,0 часа — титр 1:320,-контакт 4,0 часа — титр 1:320, контакт 16.0 часов — титр 1;320. Поскольку титр антител не сниэился после достижения максимального значения, по формуле 1 рассчитали индекс ФА антител:

Поскольку титр антител снизился через

16 часов, для подсчета индекса ФА антител использовали формулу 2:

V2-з,о

Согласно прототипному способу титр антител через 1 час контакта сыворотки с антигеном соответствовал 1:20.

Таким образом, И.Г.Приходько имел перед эпидемией титр специфических антител

1:20 и индекс ФА этих антител 3,0, Прогноз на предстоящую эмидемию по прототипному и предлагаемому способу — заболеет.

Во время вспышки И.Г.Приходько перенес грипп с клиническими проявлениями болезни. Серологические исследования парных сывороток в РТГА с тем же антигеном подтвердили диагноз: прирост специфических антител с титра 1:20 до 1:160.

Клинические и серологические данные по использованию предлагаемого способа показали, что из 132 исследуемых лиц переболели гриппом 18 (14%), не заболели 114 человек (86%). Совпадение прогноза по предлагаемому способу — 86%, по способупрототипу — 14О/,, т.е. точность прогноза по предлагаемому способу была выше, чем по прототипу на 72%, В отдельные эпидемии этот показатель колебался от 72 до 78%. Во всех случаях разница показателей точности прогноза по обоим методам статистически достоверна при Р<0,01 или 0,001.

Таким образом, при использовании предлагаемого способа точность определения устойчивости людей к гриппу возросла на 70-78% по сравнению с прототипным, что свидетельствует о наличии положительного эффекта.

1770908

Формула изобретения

Составитель Г, Крюкова

Редактор А. Козлова Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор М. Ткач

Заказ 3740 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Ф

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Способ определения резистентности к вирусу гриппа, включающий забор крови, выделение сыворотки, инкубацию ее с вирусом гриппа, выявление противогриппозных антител, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, сыворотку перед выявлением антител инкубируют в течение 0,25 ч, 0.5 ч, 1,0 ч, 2,0 ч, 4,0 ч, 16,0 ч, вычисляют индекс функциональной

5 активности антител, и при его величине больше или равной 10 определяют резистентность к заболеванию гриппом.