Способ получения эхинококкового диагностикума

 

Использование: биотехнология, производство препаратов для серологической диагностики эхинококоза у людей и с/х животных, с целью повышения чувствительности и специфичности диагностикума. Сущность изобретения: для повышения точности диагностики выделяют собственно паразитарные антигены, практически не содержащие белки хозяина и перекрестнореагирующих антигенов паразитарного происхождения, обусловливающих неспецифичность реакции. Способ включает сбор жидкости из эхинококковых пузырей овец, ее концентрирование лиофилизацией, замораживание-оттаивание , центрифугирование и фракционирование антигена из супернатанта. Лиофилизацию проводят после замораживания-оттаивания до полного удаления воды, полученный лиофилизат растворяют в физиологическом растворе при весовом соотношении 0,1-0,2:1,2-2,4, центрифугирование осуществляют при 6-8 тыс.об/мин в течение 20-30 мин, а фракционирование ведут гель-электрофорезом с использованием 10%-ного додецилсульфата натрия и элюируют антиген с молекулярной массой 300 kg 5 мМ растворов бикарбоната натрия с 0,1 %-ным додецилсульфатом натрия . СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4898665/13 (22) 27.11.90 (46) 23.09.92. Бюл. N 35 (71) Ростовский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены (72) B.Ê.Ñàïà÷, Л,Л,Демидова и Н.И,Орешкина (56) Авторское свидетельство СССР

N 1363564, кл. А 61 К 39/00, G 01 N 33/53, 1985. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭХИНОКОККОВОГО ДИАГНОСТИКУМА (57) Использование: биотехнология, производство препаратов для серологической диагностики эхинококоза у людей и с/х животных, с целью повышения чувствительности и специфичности диагностикума, Сущность изобретения; для повышения точности диагностики выделяют собственно паразитарные антигены, практически не соИзобретение относится к биотехнологии, в частности к производству препаратов для серологической диагностики эхинококкоза у людей и с/х животных.

Наиболее близким является способ получения эхинококкового диагностикума для Ифа (авт,св. СССР ¹ 1363564

А1, А 61 К 39/00, G 01 N 33/53, 1985).

Способ включает в себя сбор жидкости из эхинококковых пузырей зараженных овец, ее концентрирование на лиофильной установке, замораживание-оттаивание, центрифугирование и фракционирование надосадочной жидкости комбинацией гельфильтрации на сефадексе (от Г-50 до Г-200) (s1)s G 01 N 33/53, А 61 К 39/00 держащие белки хозяина и перекрестнореагирующих антигенов паразитарного происхождения, обусловливающих неспецифичность реакции. Способ включает сбор жидкости из эхинококковых пузырей овец, ее концентрирование лиофилизацией, замораживание-оттаивание, центрифугирование и фракционирование антигена из супернатанта. Лиофилизацию проводят после замораживания-оттаивания до полного удаления воды, полученный лиофилизат растворяют в физиологическом растворе при весовом соотношении 0,1-0,2;1,2-2,4, центрифугирование осуществляют при 6-8 тыс.об/мин в течение 20-30 мин, а фракционирование ведут гель-электрофорезом с использованием 10О (,-ного додецилсульфата натрия и элюируют антиген с молекулярной массой 300 kg 5 мМ растворов бикарбоната натрия с 0,1%-ным додецилсульфатом натрия, и ионообменной хроматографии на ДЕАЕсефадексе А-50. Иммунологически активные фракции, полученные таким способом, не содержат мешающих проведению ИФ реакции перекрестно-реагирующих антигенов, Цель изобретения — повышение точности диагностики эхинококкоза в РНГА, Цель достигается путем выделения собственно паразитарных, практически не содержащих белков хозяина и перекрестнореагирующих антигенов параэитарного происхождения, обусловливающих неспецифичность реакции.

Для этого неустойчивые компоненты эхинококковой жидкости овец в процесе ее

1763985 замораживания, оттаивания, концентрирования (лиофилизированную эхинококковую жидкость растворяют в физ. растворе из расчета 0,1-0,2 г лиофилиэата на 1,2-2,4 г физ,раствора), выпадают в осадок и удаляются центрифугированием (20-30 мин при

6000-8000 об/мин), а супернатант фракционируют проведением аналитического гельэлектрофореза. Выделение целевого йродукта с мол,массой 330 кд и более осуществляют методом препаративного гельэлектрофореза с использованием 10 -ного додецилсульфата натрия (при этом используют гель 7,5%-ной концентрации). Элюирование белка проводят 5 мМ ИаНСОз, Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выполнение способа, Проводят сбор жидкости из эхинококковых пузырей зараженных овец, после замораживания и оттаивания жидкость лиофилизируют в течение 22-24 ч (время необходимое для полного высыхания эхиHoKoKKQBQA жидкости), Лиофилизат в дальнейшем растворяют в физиологическом растворе из расчета 0,1-0,2 г на 1,2-2,4 г физ. раствора, после чего концентрат центрифугируют 20-30 мин при 6000-8000 об/мин осадок отбрасывают, а супернатант фракционируют методом гель-электрофореза с использованием 10%-ного додецилсульфата натрия. Количество материала, фракционируемого в одном опыте, составляет до 10 мг белка на 1 см поверхности геля. При проведении препаративного гель-электрофореза используют 7,5%-ную конечную концентрацию акриламида для разделяющего геля.

При анализе белкового спектра эхинококковой жидкости выявляют 8 основных белковых фракций с мол.массой от 14 кддо 330 кд и более. Фракции выделяют путем элюирования 5 мМ ИаНСОз, содержащего 0,1%ный додецилсульфат натрия. Для полной элюции выдерживают кусочек геля в этом растворе при перемешивании 12 ч при 37 С, От геля освобождаются путем продавливания через шприц с владипором М 5. В каждой выделенной таким образом фракции определяют содержание белка методом Лаури и сорбируют на эритроцитах барана по общепринятой методике.

Пример 2. Определение оптимального времени, необходимого для полного

BblcblxBHNsI эхинококковой жидкости и эхинококковых оболочек приведено в табл.1, Из таблицы видно, что сушка эхинококковой жидкости менее 22 ч недостаточна, так как не происходит полного высыхания препарата, также нет смысла сушить более

24 ч, ибо 24 ч достаточно для полного высыхания эхинококковой жидкости.

Пример 3, Подбор оптимального количества физ. оаствора и лиофилизата, необходимого для получения требуемой концентрации белка в растворе и достаточно полного растворения лиофилизата, приведен в табл.2.

Количество материала, фракционируемого водном опыте,,должно составлять

0,1-0,2 г, а минимальное количество физ. раствора, в котором достаточно полно растворяется лиофилизат, составляет 1,2-2,4 г.

Концентрат при этом содержит необходимую для фореза концентрацию белка—

9-10 мг, Пример 4, Параметры очистки концентрата от неустойчивых компонентов эхинококковой жидкости центрифугированием приведены в табл.3.

Из таблицы видно, что оптимальными параметрами центрифугирования, при которых происходит 100%-ная очистка от неустойчивых компонентов эхинококковой жидкости, является 20-30 мин при 6-8 тыс. об/мин.

Пример 5. Иммунологическую активность каждой фракции проверяют в РНГА (табл.4).

Результаты РНГА с эхинококковыми сыворотками показывают, что фракции с мол.массой ниже t00 кд являются непригодными в качестве диагностикума, тогда как фракции, элюируемые с мол.массой 330 кд и более, обладают высокой точностью диагностики, Иммунологически активные компоненты эхинококковой жидкости распределяются в 1 фракции. РТПГА в концентрации Аг 10 мкг/мл 1 фр. затормозила на 5 разведений (снижала титр от 40960 до

2560).

Чувствительность и специфичность диагностикума на основе 1 фр. определяют в РНГА путем сопоставления данных

РНГА с коммерческим диагностикумом, полученных при исследовании сывороток крови больных различными паразитарными заболеваниями (аскаридоз, трихинеллез, геминолепидоз) табл.5, 6;

Таким образом, наиболее чувствительным и специфичным диагностикумом в

РНГА при эхинококкозе является часть полученной методом препаративного гельэлектрофореза высокомолекулярной фракции эхинококковой жидкости (330 кд и более).

В полученном данным способом препарате не содержится белков хозяина (овцы), поэтому он может быть применен в качестве

1763985

Таблица 1

Таблица 2 универсального диагностикума при эхинококкозе животных и человека.

Формула изобретенияСпособ получения эхинококкового диагностикума, включающий сбор жидкости из эхинококковых пузырей овец, ее концентрирование лиофилизацией, замораживание-оттаивание, центрифугирование и фракционирование антигена из супернатанта, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности диагностикума, лиофилизацию проводят после замораживания-оттаивания до полного удаления воды, полученный лиофилизат растворяют в физиологическом

5 растворе при массовом соотношении 0,10,2:1,2-2,4, центрифугирован ие осуществляют при 6-8 тыс.об/мин в течение

20-30 мин, а фракционирование ведут гель-электрофорезом с использованием

10 10 додецилсульфата натрия и элюируют антиген с мол.м, 330 кД 5 MM раствором бикарбоната натрия с 0,1 додецилсульфатом натрия.

1763985

Таблица 3

Таблица 4

Таблица б

Результаты сравнительного изучения чувствительности диагностикума на основе очищенной 1 белковой фракции, мол. масса которой 330 кд и более

Таблица 6

Результаты сравнительного изучения специфичности диагностикума на основе очищенной 1 белковой фракции, мол. масса которой 330 кд и более

Составитель В. Сапач

Техред М.Моргентал

Редактор Т, Куркова

Корректор Н. Ревская

Заказ 3454 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент",.г. Ужгород, ул.Гагарина, 101