Способ выделения двухферментного биокатализатора для получения нуклеозидов

 

Использование: биохимия, очистка белков . Сущность изобретения: очистку лиофилизата яда кобры осуществляют методом колоночной гель-фильтрации на сефадексе G-75, упакованном в два слоя - верхний основной слой, состоящий из сефадекса марки сверхмелкий, и нижний вспомогательный слой толщиной не менее 1 см, состоящий из сефадекса с размером частиц 40-120 мкм. 1 табл., 1 фиг.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 12 N 9/22

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4779881/13 (22) 09.01,90 (46) 23.10 .92. Бюл. М 39 (71) Новосибирский государственный университет им, Ленинского комсомола (72) В.И.Ямковой (73) Новосибирский государственный университет им. Ленинского комсомола (56) Скоупс Р. Методы очистки белков. — М.:

Мир, 1976, гл, 5.

Василенко С.К., Райт B.Ê. Метод выделения высокоочищенной рибонуклеазы из яда среднеазиатской кобры. — Биохимия, 1975, т. 40, NЗ,,с,,578 — 583.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения ферментов-фосфодиэстеразы и 5

-нуклеотидазы из яда кобры с целью производства с их помощью нуклеозидов.

Известен способ выделения фосфодиэстеразы и 5 -нуклеотидазы иэ яда кобры, осуществляемый путем диализа раствора

1,5 г яда с последующей гель-фильтрацией диализата на колонке (Зх117 см) с сефадексом G-75 (аверхмелким), при этом диализ идет 18 часов, гель-фильтрация 35 ч (скорость элюции 6,9 мл/час) (11. Выход фосфодиэстеразы 7%; удельная активность в 2-х ферментном биокатализаторе 5 -нуклеотидазы равна 1350 ед/мг белка, фосфодиэстеразы — 220 ед/мг белка. Недостатки: невысокий выход лимитирующего фермента — фосфодиэстеразы. длительность процесса.

Целью изобретения является увеличение выхода фосфодиэстераэы и сокращение времени процесса. Ж 1771484 АЗ (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДВУХФЕРМЕНТНОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОЗИДОВ (57) Использование: биохимия, очистка белков. Сущность изобретения: очистку лиофилизата яда кобры осуществляют методом колоночной гель-фильтрации на сефадексе

G-75, упакованном в два слоя — верхний основной слой, состоящий из сефадекса марки "сверхмелкий", и нижний вспомогательный слой толщиной не менее 1 см, состоящий из сефадекса с размером частиц

40-120 мкм. 1 табл., 1 фиг.

Ф С

l . Поставленная цель достигается предлагаемым способом выделения двухферментного биакатализатора (фосфодиэетеразы и 5

-нуклеотидазы) из яда кобры, по которому очистку буферного раствора сухого яда кобры проводят методом гель — фильтрации на колонке. заполненной сефадексом в два слоя, причем нижний слой имеет толщину не менее 1 см и состоит из сефадекса G-75 с размером частиц 40-120 мкм, а верхний— толщиной 8,4-9,4 диаметра колонки, состоит из сефадекса 6 75 с размером частиц

10-40 мкм. фь

Чертеж поясняет предлагаемый способ.

Отличительные признаки от прототипа: — гель-фильтрацию проводят без предварительного диализа;. — колонку для гель-фильтрации заполняют гелем на высоту. равную 8.4- 9,4 ее диаметров; — перед наполнением в колонке предварительно подслаивают тонкую (1 см) "по1771484

Выделение ферментов из яда кобры душку" из крупного сефадекса G-75 (с диаметром гранул 40-120 мкм).

Предлагаемый способ иллюстрируется примерами.

Пример 1. Выделение фосфодиэстеразы и 5 -нуклеотидаэы проводят при 4-6ОС.

1,5 r сухого яда кобры растворяют в 20 мл буфера А (0,05 M трис-сукцинат, рН 5,6) и наносят на колонку.К 50/60 (Pharmacta, Швеция), заполненную на 47 см(1:9,4) сефадексом G-75 (сверхмелким), наслоенным на

1 см "подушку" иэ сефадекса G 75 с диаметром гранул 40-120 мкм, уравновешенную буфером А. Элюцию осуществляют буфером

А со скоростью 24 мл/«ас. Во фракциях, собираемых каждые 15 мин„определяют ,активность фосфодиэстеразы. и 5 -нуклеотизады по методу (1). Фракции 32- 39, со; держащие элюирующиеся совместно фосфодиэстеразу и 5 -нуклеотидазу, объе.диняют(объем 48 мл), измеряют в них содержание ферментов и белка (см. таблицу) и концентрируют диалйзом против 50 j глицерина или лиофилиэуют., Пример 2. При соблюдении условий примера 1 заполняют на 42 см (1:8,4). Выход. целевых объектов аналогичен примеру 1.

Пример 3, При уменьшении высоты заполнения до 41 см (1:8,2) и соблюдении других условий по примеру 1 снижается степень очистки ферментов на 10 %.

Пример 4, При увеличении высоты до:

48 см (1:9,6) выход ферментов снижается на

S %, степень очистки сохраняется аналогично примеру 1.

Пример 5. При соблюдении условий примера 1 "подушку" наслаивают толщиной

1.5 см. Результаты аналогичны примеру 1.

Пример 6. Декарибоадейиловую кислоту (рА)10 инкубировали с двухферментным биокатализатором, выделенным из яда кобры, как описано в примере 1. Реакцию.проводили в объеме 0.5 мл при комнатной температуре, в течение 5 мин.

Концентрации компонентов полученной реакционной смеси: (рА)ю — 5,0

aemoIмл; трис-HCI-буфера (рН 8,5) — 0,1 М, Mg Clz -5 мМ, биокаталиэатора-8,9 мкг/мл.

Реакцию останавливали кипячением реакционной смеси в течение 2 мин. Пробу

5 анализировали методом микроколоночной хроматографии (см, чертеж), Как видно из чертежа, за 5 мин гидролизуется 20.7% фосфодиэфирных связей субстрата (активность фосфодиэстеразы). За

10 это же время 47,7% рА превращается в А (активность 5 -нуклеотидазы).

Таким. образом. активность содержащейся в двухферментном биокаталиэаторе

5 -нуклеотидаэы в 2,3.раза выше активности

15 фосфодиэстеразы, т,е. лимитирующим ферментом является фосфодиэстераза.

Технико-экономические и реимущества перед базовым объектом.(1). Указанные отличительные признаки в совокупности с из20 вестными обеспечивают: увеличение . выхода фосфодиэстеразы до 86%, т:.е, в 12,3 раза; сокращение времени выделения ферментов с 53 до 10 ч. (т.е. в 5,3 раза); исклю.чена стадия диалиэа;.а скорость элюции при

25 гель-фильтрации увеличивается до 24 мл/ч.

Двухферментный биокаталиэатор содержит в 12,3 раза больше лимитирующего фермен-. та-фосфодизстеразы; что позволяет гидролизовать до нуклеозидов в 12,3 раза больше

PHK (ДНК).

Формула изобретения

Способ выделения двухферментного биокаталиэатора для получения нуклеози35. дов, включающий очистку буферного раствора сухого яда кобры, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа и йоаышения выхода по активности, очистку проводят методом гельфильтрации на колонке, заполнейной сефадекеом в два слоя, причем нижний слой имеет толщину не менее 1 см и состоит из сефадекса 6-75 с размером частиц 40-120 мкм, а верхний слой толщиной 8,4-9,4 от диаметра колонки

45 состоит из сефадекса G-75 с размером частиц 10-40 мкм.

1771484

25 .О 60 ню 280 ивЂ

Составитель В. Ямковой

Техред M.Moðråíòàë Корректор М. Андрушенко

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3754 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4t5