Способ оценки восприимчивости пшеницы к ржавчинным грибам

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 А 01 Н 1/04

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) О ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOIVlY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4911609/13 (22) 10,12,90 (46) 30.12.92. Бюл. М 48 (71) Северо-Кавказский научно-исследовательский институт фитопатологии (72) В.В.Чигрин, Т.Е,Жигалкина и, Т.В.Паршина (56) Методы ф итопатологии./ Под. ред.

М.В.Горленко. M.: Колос, 1984, 34 с.

Изобретение относится к области фитопатологии, в частности к способам диагностирования восприимчивости растений к ржавчинным грибам, основанным на химическом анализе биохимического материала, и может быть использовано при выведении сортов пшеницы и при изучении защитных реакций растений против болезней, Селекция зерновых культур на устойчивость к болезням является перспективным способом снижения потерь зерна, вызываемых различными патогенами, Поэтому большое значение в процессе отбора имеет отбраковка восприимчивых растений.

Известен способ визуальной оценки восприимчивости селекционного материала к ржавчинным грибам путем определения типа поражения по шкале Питерсона, Недостатком прототипа является то, что визуальная оценка типа поражения не дает представления о восприимчивости раствний в начале патогенеза. Однозначное выявление восприимчивых растений по типу пустул возможно лишь на 9-11 день после заражения, . Ж 1784 I42 А1 (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ВОСПРИИМЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К РЖАВЧИННЫМ ГРИБАМ (57) Использование: биотехнология, сельское хозяйство, фитопатология. Сущность изобретения: восприимчивость пшеницы к ржавчинным грибам оценивают по активности экзоцеллюлазы в клеточных стенках инфицированных растений и контроля, при этом при возрастании данного показателя у исследуемых растений по сравнению с контрольными идентифицируют восприимчивые формы. 1 табл.

Заявляемый способ оценки восприимчивости основан на биологических показателях.

Сущность изобретения заключается в том, что из листьев, взятых от здоровых и зараженных возбудителями стеблевой или бурой ржавчины растений пшеницы, уже на следующий день после заражения выделяют препарат клеточных стенок, который используют для определения активности экзоцеллюлазы. Этот фермент, гидролизуя целлюлозу до водорастворимых сахаров, улучшает условия углеводного питания патогена. Активность экзоцеллюлазы определяют flo гидролизу карбоксиметилцеллюлозы с последующим определением прироста редуцирующих сахаров методом

Нельсона. По повышению активности фермента в сравйении с контролем идентифицируют восприимчивые формы, Пример 1, Выращивание растений, инокуляция, отбор проб. Растения выращивают в тепличном грунте или в 1 л вазонах до фазы 2-ro листа. Инокуляцию проводят в вечерние часы, Растения обильно поливают, 1784142 наносят на листья росу, накрывают полиэтиленовой пленкой и опыливают смесью свежесобранных уредоспор с тальком из расчета 40 мг/м (1:50), На следующее утро пленку удаляют с растений. Через 18-24 часа после заражения со здоровых и зараженных растений отбирают flo 10 г листьев.

Образцы до анализа хранят в сосуде Дьюара с жидким азотом.

Пример 2. Получение препаратов клеточных стенок, Листья пшеницы гомогенизируют в гомогенизаторе при максимальном числе оборотов в течение 2 мин с 25 мл

0,1 M фосфатно-солевого буфера рН 6,0, содержащем 0;1% Тритон х 100 и отжимают через полотно. При отсутствии гомогенизатора листья можно растереть до тонкого порошка с жидким азотом. Остаток на полотне гомогенизируют в том же буфере без детаргента. отжимая каждый раз ткань, Отмытый остаток растирают в ступке с жидким азотом до тонкого порошка, который суспендируют в том же буфере без детергента, настаивают 40 мин в холодильнике и эту суспензию используют в качестве источника активности экзоцеллюлазы.

Пример 3. Определение активности экзоцеллюлазы. Фракцию клеточных стенок, выделенных из 20 г листьев (зараженных и незараженных), растирают с жидким азотом, суспендируют в 25 мл фосфатного буфера рН 6,0. И н куба цион ная смесь содержит 5 мл суспензии клеточных стенок, 5 мл

1% водного раствора карбоксиметилцеллюлозы (Na — соль) и 2 капли толуола. В нулевое время и через 3 ч отбирают 1 мл реакционной смеси, к которой добавляют 4 мл дистиллированной воды и 1 мл реактива

Нельсона, нагревают 20 мин на кипящей бане, и после охлаждения приливают 1 мл арсеномолибдата, доводят объем до 10 мл и центрифугируют 10 мин при 6000g. Оптическую плотность голубого раствора измеряют при 500 нм, Пример 4. Определение содержания белка из клеточных стенок, Из препаратов клеточных стенок, полученных из здоровых растений и растений, зараженных стеблевой и бурой ржавчиной, белок извлекают щелочью следующим образом; к 3 мл суспензии клеточных стенок прибавляют 0,3 мл

10 н. NaOH, настаивают 1 ч, подкисляют до рН 6,0, центрифугируют 20 мин, при 6000g, осадок отбрасывают. В надосадочной жидкости определяют содержание белка по известному методу.

Расчет целлюлозной активности определяют по формуле:

C> — Co

Х а °

5 где Х вЂ” высвободившаяся глюкоза, мкг r "х хмин

C1 — количество глюкозы после t мин инкубации (180 мин);

Co — количество глюкозы в нулевое вре10 мя; а — навеска в граммах (сырой вес), мг (при определении содержания белка), взятая на окрашивание по Нельсону, Активность выражают в мкг глюкозы/г

15 сырого веса или мг белка/мин. Калибровочную кривую строят по глюкозе. Полученные результаты и од ве рга ют статистическому анализу с определением доверительного интервала при P = 0,05. Определение актив20 ности проводят в 4-кратной повторности, Данные результатов определения восприимчивости пшеницы к стеблевой и бурой ржавчине известным (визуальным) и Заявляемым (биохимическим) способом приведе25 ны в таблице, Как видно из таблицы, степень поражения растений известным (визуальным) способом можно определить через 9 — 11 суток, а при использовании заявляемого биохими30 ческого способа восприимчивость растений определяют уже через 18-24 часа по повышению активности экзоцеллюлазы у зараженных растений, Таким образом, заявляемый способ

35 оценки восприимчивости пшеницы дает воэможность, при аналогичных характеристиках сортов, почти в 10 раз ускорить проведение оценки.

40 Формула изобретения

Способ оценки восприимчивости пшеницы к р>кавчинным грибам, включающий заражение инокулюмом патогена исследуемых растений и определение их

45 восприимчивости по сравнению с неинфицированными контрольными растениями, отличающийся тем, что, с целью ускорения проведения оценки, определение восприимчивости проводят по активно50 сти экзоцеллюлазы в клеточных стенках, измеренной на следующие сутки после заражения, и по ее возрастанию по сравнению с контролем идентифицируют восприимчивые формы.

17<>г11г12

Г>

С >! т " и !

JllliIII!l ri >I - 1 IP

ВИ?1, р>?<а нчи? <«1 спрей масон

Акт.<пность на l г

f\|

119

9о

П7

I,3i+O,07

О, Р+О, 04

I,00IO,08

0,90+0,05

Î;I г,3

0,1

2,3

I,12+0,00

0,94+0,05

0,96+0,03

1,05+0,05 устоИчин. носприпм. устойчив. носприим. устойчин. носприим.

ycтоИчин. носприим.

СтеблеI 08+0,05

0,89+0,05

2,1

2,3

I,13+0,02

0,79 0,05 устойчив. нос?триим.

96 устойчин.

1I3 восгри>!и вая

0,77+0,01

I 00(.0,00

0,44+0,03

I,32+0,02

0,30+0,03

0,51+0,03

I,20I-О,ОЗ

0 7((5>+О 04

I,24+0,03

0,37+0,03

1,36+0,03

0,37 0,01

0,70+0,04

I,05+0,05

96

П5

04

П2

> г

137

0;() 3

0;I

3,4

3

I,2 устойчип. носпрпим. устойчив. носприим. устойчин. носприим. устой

Нг7СПРППМ. устойчив, х СКО

7 ткл о? <3?-?ие . устойчин. восприим.

0Ä

84 устойчин, I3(н(к:приим.

0,90+0,06

1,31+0,05

I,07+0,04

1,00+0,08

87 (Jc7 ойчнн.

I20 н(7сприим.

1,00+0,07

I,01+0,05

I, 17+0, 08

0,84+0,03 устоГ?ин. носприим.

0,90(.0,05

0,80+0,05

88 устойчин.

107 носпри?щ.

I,14+0,08

0,75+0,05

0;I

3,4 устойчив. восприим.

Бурая

I,06,0,05

0,60+0,07

99 усто Ич:?н.

ПЗ воспри>гл.

I,07+0,03

0,52+0,04

0,1

4 устойчив. восприим.

85 устой п<н.

99 устойчин. ног прцим

0,81+0,03

0,80+0,04

0,91+0,05 устойчин. 0,94+0,05 устойчив. О 81+0 04 восприим. 0,80+0,08

O,I

1,2

Актинность на I t!t с<1 7«7 устойчин. 255 носприим. 133

О;

I04

174

72

I30 у. »ойчин.

Н:>СПР? 1??.? .

1 устойчив, 363

3 носприим. 245 устой?1(н.

1Е6

Бурая

НОСI?PIйчин.

»Г> ".1 tt;ll( г

0;l устойчив. 250

3 восприим. 100

I59

I28

64

I ББ

I 2

3,4

1,2

4 устойчив. восприим. устойчив. восприим. восприим.

277

I32

141

I59

323

204

I75

П4

2I4

399

74

I33

0l

l35

I24

У:;::> 1.11!».

tIC t ° ?1!»? 1<,1 устой :(л. н е и(II>1

II,;г ii >I(It(t. р

Л?Зтесценс

2610! 1-2542: >

Xapb?IIC:.ÿ И .1;

ЭР><т Рос(?е 1>ь(У(.

O>?eCCt

Лютесценс

4503 Н88

ЯхарЬ Одное < П г(Картинен?<7 нис?<а

КрасноЗарг>?<г>. » .:

ЛИд iÄt

И?<очей I

Ли !

<(арк>?о

Дон 5 — сре>ч??ек в<1,><рати и

JIvJTeciticнг

2510(!2.".>42 .

Xapt t 9,) .Лнтосп I«.

4503 1<10

>i>!P 75>8

Л?Отес? (ене

Ха(r>it

Зритрск:i;; p;1 ".

123:(- .гС

Литл К7:.

Парт«на?<«г. писка

Игл

Уэбст ..р

Лотесценс

20 101!2г<>4 г":,и>

Харь?(овск и:, ? 1

Лчтесиенс

45031169

J(I77ecite«c

2621!1-24-88

Лчтесценс

3017Й50 л >> — 7 !

1артиэо? Пг> писка

Хасси

Игл

Литл Клаб

Уэбстер

> л >ill" Рооп(1??<мч?<н!.< penò и ° И Гиэупл? .и и (..э?>с .т>i;»,,) и биакими Icc«lf,". (эа??«7>?е?1?71) с ис>с:сбои! Иагестн. И спо.(об Заявлг?с:.и и сп соб! (1.1? ПЕ!>ЫЕ-! Xapnt<7epIIC! а?:т:?В??О(:тЬ Э«аецЕЛЛ:.>Лае:: 1>р га! Х>(p»t<7ep:IC?1??>< на IO cор- 10-24 и по :tc сара:.;. .-;::и, нг ти .<а сорта ! пень пг." ло тэ Гл. >?Г> ?Гк>Р.PJ)5! по иэ;>ее?енин

? I!чокул я:.<п>1,?,а 7Ä»t? ь оп? т ",, э ко оцеллюла.;". к

t ? «<1нTp.!