Способ получения иммуноглобулинового конъюгата

 

Изобретение касается нуклеозидов, в частности получения иммуноглобулинового конъюгата ф-лы-KJLJ :оссн2сн2ососн2 Jh) О AN обладающего противоопухолевой активностью , что может быть использовано в медицине . Цель - создание нового более активного соединения указанного класса. Синтез ведут реакцией раствора соединения ф-лы Ш2 ОССН2СН2ОСОСН2 tЈj) | О N те НО F в диметилформамиде с антителом 007 В при рН 8,6 в водном боратном буфере при соотношении 20,7 моль нуклеозида на моль антитела и температуре 19-20°С в течение 3 ч с последующим выделением полученного конъюгата гель-фильтрацией. Новый конъюгат обеспечивает более, чем в 2 раза выше известного, ингйбирование роста опухоли при низких нетоксических дозах (до 97% при дозе 2,5-5 мг/кг на 14-ый день после инокулирования). 2 табл. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 07 Н 19/073

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Ho F

-ОССИАН,ОСОСН, 1

H0 F (21) 4203967/04 (22) 16.12.87 (46) 07.01.93. Бюл. М 1 (31) 946351 (32) 24.12.86

{33) US (71) Эли Лилли Энд Компани {US) (72) Гари Аллен Коппель, Джордж Дэвон

Кеннеди, Генри Кеннет Армор и Вильям Леонард Скотт (US) (56) Патент США М 4526988, кл. С 07 0 307/32, 1985. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛО- .БУЛИНОВОГО КОНЪЮГАТА (57) Изобретение касается нуклеозидов, в частности получения иммуноглобулинового конъюгата ф-лы И2

Изобретение относится к биологически активным соединениям, а именно к способу получения нового иммуноглобулинового конъюгата общей формулы! 2

ОССН2СН,ОСОСН2 1

Ы2,, 1787160 АЗ обладающего противоопухолевой активностью, что может быть использовано в медицине. Цель — создание нового более активного соединения указанного класса. Синтез ведут реакцией раствора соединения ф-лы 2

ЯО С Н2СН2ОСОСН2 в диметилформамиде с антителом 007 В при рН 8,6 в водном боратном буфере при соотношении 20,7 моль нуклеозида на моль ан1итела и температуре 19 — 20 С в течение 3 ч с последующим выделением полученного конъюгата гель-фильтрацией. Новый конъюат обеспечивает более, чем в 2 раза выше известного, ингйбирование роста опухоли при низких нетоксических дозах (до 977; при дозе 2,5 — 5 мг/кг на 14-ый день после инокулирования). 2 табл. который обладает противоопухолевой активностью.

Известен способ получения дифторнуклеозидов, который заключается в раскрытии лактона, получаемого гидролизом алкилового эфира З-диоксоланил-2,2-дигидро-3-гидроксипропионовой кислоты.

Однако данные соединения обладают относительно невысокой ингибирующей способностью к некоторым опухолям.

Цель изобретения — получение нового биологически активного соединения, обла1787160 дающего повышенной противоопухолевой активностью.

Поставленная цель достигается коньюгированием дифторнуклеозида с антителом

007 В при определенных значениях рН, температуры, временного интервала и соотношения реагентов.

Пример 1. 5 -0-(3-карбокси-1-оксопропил)-2 -диокси-2, 2 -дифторцитидин.

Сухой 2 -диокси-2, 2 -.дифторцитидин (311 мг) добавляют в сухой этанол и полученную смесь нагревают с обратным холодильником. В течение 0,5 ч частями добавляют янтарный ангидрид (2,5 r) и полученную смесь нагревают с обратным холодильни- "5 ком еще в течение 0,5 ч. Полученную смесь концентрируют в вакууме и полученный в результате продукт пропускают через колонку с силикагелем и проводят элюирование смесями 5, 20 и 50% метанола в 20 хлористом метилене, Желаемый продукт . выделяют из фракции 50% метанола в хлористом метилене, которая содержит 148 мг материала. Полученный продукт объединяют с продуктом из аналогичных эксперимен- 25 тов, в результате чего получают всего 253 мг вещества. Это вещество переносят в 8 мл

0,01 моль раствора ацетата аммония, рН системы устанавливают равным 8,6 с помощью гидроксида аммония и полученный 30 раствор пропускают через свежеприготовленную колонку с моно-Q анионообменной смолой (фармация Инк.). Желаемые фракции объединяют, замораживают и лиофилизуют, Остаток растворяют в дистиллированной воде, замораживают и несколько раз лиофилизуют, после чего растворяют в смеси метанола и бензола, вымораживают и лиофилизируют, в результате чего получают 60 мг целевого продукта. 40

Спектр протонного ЯМР соответствует структуре желаемого продукта, д7,68,дублет, 1Н/С6, = СН вЂ” N/, д 6,24, триплет, 1Н/С1, 0-CRH — /; 6,13, дублет, 1Н вЂ” СБ, С==CH — /; д 4,78, синглет, 4 обмениваю- 45 щихся протона (-ОН, -NH); д 4,2 — 4,7, мультиплет, 4 протона (протоны сахара в положениях СЗ, С4, С5 ); д 2,60 и 2,73, дублет триплетов, 4 протона (сукцинатные протоны СН2СН2 ).

Пример 2. Связывание 5 -0-(3-карбокси-1-оксопропил)-2 -дезокси-2,2 -дифторцитидина с антителом 007 В.

25 мг образца (0,069 ммоль) продукта, полученного по примеру 1, растворяют в 55 смеси бензола и метанола, замораживают и лиофилизуют в общей сложности три раза.

Остаток растворяют в 1 мл сухого диметилформамида и 4 мл свежедистиллированного тетрагидрофурана. Смесь охлаждают до 4ОC и добавляют один эквивалент (0,069 ммоль, 151 микролитр) N-метилморфолина в тетрагидрофуране. Через 10 мин добавляют один эквивалент (0,069 ммоль, 177 микролитов) пробы изобутилхлорформиата в тетрагидрофуране. После перемешивания в течение

20 мин при 4 С добавляли один эквивалент (0,069 ммоль, 248 микролитров) й-оксисукцинимида. Перемешивание продолжают

20 мин при 4 С и 3 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и оставляют на ночь в вакууме, Активированный сложный эфир, полученный на предыдущем этапе (31,7 мг, 0,069 ммоль, 460 г/моль, максимальное

9 теоретическое значение), растворяют в

4,18 мл сухого диметилформамида. Антитело 007 В получают субклонированием линии клеток, продуцирующих опубликованное антитело KS1/4 и отбором вариантных гибридных клонов, которые продуцируют только релевантное 1gG2a моноклональное антитело KS1/4, а не неродственный белок IgG1. Такие клоны выращивают s клеточной культуре традиционными методами, чтобы получить антитело

007 В. 500 миллиграммов антитела 007 В (мол. вес 150000, 500 мг = 3,33 х 10 з моль) в боратном буфере с рН 8,6 помещают в колбы с круглым дном и добавляют раствор активированного сложного эфира в течение

10 мин, реакционную смесь перемешивают

3 ч в темноте, устанавливают рН 7,4 однонормальной хлористоводородной кислотой и центрифугируют в течение 10 мин при

2000 оборотах в минуту. Насадочный слой разделяют пополам и каждую часть помещают в колонку с биогелем P-6 и элюируют физиологическим раствором, стабилизированным фосфатным буфером (PBS) при рН 7,4. Связанные пики собирают в три фракции от каждой части. Одинаковые фракции смешивают от двух погонов. Объединенные вторые фракции концентрируют до трех мл, разбавляют с помощью PBS и получают раствор с концентрацией 25,44 мг/мл в общем объеме 13,29 мл. Выделенный белок составил 338 мг (67,6% выход белка) и молярное отношение нуклеозида к белку составило 4:1. Продукт стерилизуют и используют в дальнейших экспериментах.

Ингибирование Р3-УС1 А аденокарциномы у самцов голых мышей определяли стандартными способами. Заражение мышей осуществляли в нулевой день, испытуемые соединения.(нуклеозид по примеру 1 и конъюгат по примеру 2) вводили внутривенно на 2,4 и Одень, а оценку результатов

1787160

RO« CHROM

Таблица 1

Ингибирование РЗ-YCLA аденокарциномы у голых мышей

" Дозу вводили внутривенно на 2,4 и 8 день, Инокулирование клеток в день 0; оценка — в день 14 и 21. Дозу в примере 2 рассчитывали в мг/кг родственного нуклеозида

Таблица 2 проводили на 14 или 21 день. Процент ингибирования роста опухоли определяли с использованием контрольных животных, которым вводили только вещество — носитель. В каждой испытуемой и контрольной группах испольэовали по 5 мышей, Дозу конъюгата выражали в мг(кг применяемого нуклеоэида, Результаты проведенных испытаний суммированы в табл.1.

Проводили дополнительные аналогичные . испытания, в которых наблюдали животных на 14, 21 и 28 день после инокулирования (табл.2), Одна из пяти мышей, получившая максимальное количество соединения примера

1, погибла, что также произошло и с тремя из пяти мышей, получивших максимальное количество соединения примера 2, Таким образом, приведенные результаты испытаний демонстрируют значение конъюгации нуклеоэида с направляющим антителом. Из представленных данных следует, что конъюгированное соединение, обеспечивает более чем двухкратное ингибирование опухоли по сравнению с родственным нуклеозидом, даже в случае низких, нетоксичных дозировок.

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулинового конъюгата формулы Н2

-OCCHXCH OtOCH

2 г ) 10 отличающийся тем, что осуществляют реакцию раствора соединения формулы где R — сукцинимидокси, в диметилформамиде с антителом 007 В при

25 рН 8,6 в водном боратном буфере при соотношении 20,7 моль нуклеозида на 1 моль антитела при 19-20 С в течение 3 ч с последующим выделением полученного конъюгата гель-фильтрацией. 2 табл.

17871 6О . Продолжение табл.2

Составитель А.Коннова

Редактор И.Никольская Техред М.Маргентал Корректор Л.Пилипенко

Заказ 267 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035; Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101