Нитроксильные производные 3'-азидо-2'3'-дидеокситимидина, обладающие антивирусной активностью

 

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям -нитроксильным производным азидотимидина общей формулы где R¹ - радикал, содержащий нитроксильную группу >N O, а R²=R¹ или H, которые обладают антивирусной активностью против РНК-содержащих вирусов (вирус иммунодефицита человека и вирус везикулярного стоматита) и ДНК-содержащего вируса (цитомегаловирус). 5 табл.

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям-нитроксильным производным азидотимидина (АЗТ) (3'-азидо-2',3'-дидеокситимидин, 1-(3'-азидо-2',3'-дидеокси-α- пентафуранозил)тимин) общей формулы (I) где R¹ радикал, содержащий нитроксильную группу > N O; R²=R¹ или H, которые обладают антивирусной активностью.

Нитроксильные производные АЗТ в литературе не описаны. Ближайшим аналогом заявляемых веществ является АЗТ, который среди известных модифицированных нуклеозидов обладает наибольшей активностью против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Синтез АЗТ осуществлен в 1964 r.(J. P. Horwitz, J. Chu, M. Noel, J. Org. Chem. , 1964, 29, 2076-2080), а его активность против ВИЧ в культуре клеток впервые описана в 1985 г. (H. Mitsuya и др. Proc. Natl. Acad. Sci. -USA, 1985, 82, 7096-7100). В конце 1986 г. была завершена II стадия этнических испытаний, показавшая, что АЗТ продлевает жизнь больных с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) (M. J. Jotnston. D. F. Hoth. Science, 1993, 260, 1286-1293). В настоящее время АЗТ является основным препаратом при лечении СПИДа и профилактике потенциальных больных - носителей ВИЧ.

Однако последние исследования показали, что АЗТ вызывает лишь временное улучшение состояния больных и через 3 года после начала болезни нет различий в выживании больных, получавших и не получавших АЗТ. Неэффективность этого препарата при длительных курсах лечения связана с развитием лекарственной устойчивости. Применение АЗТ вызывает тяжелые побочные эффекты. У 50% больных, принимающих АЗТ, развивается анемия, обусловленная подавлением костномозгового кроветворения. Кроме того, АЗТ вызывает паралич периферических окончаний нервной системы. АЗТ слабо воздействует на сопутствующие СПИДу вирусные инфекции (в первую очередь, на цитомегаловирус (ЦМВ)), являющиеся основной причиной гибели больных СПИДом.

Другой близкий аналог заявляемых соединений - дигидропиридиновый эфир азидотимина (1, R¹=1,4-дигидро-1-метилпиридин-З-илкарбонил, R²=H) был синтезирован с целью улучшения доставки лекарства в мозг. Анти-ВИЧ-активность этого производного на культуре клеток сравнима с таковой для АЗТ, а об его анти-ЦМВ-активности не сообщается (P. F. Torrence, J. Kinjo, K. Lesiak, J. Balzarini. E.De Clercq, FEBS Letters, 1988, 234, 135-140).

Известны также немногочисленные модифицированные нуклеозиды (оксетаноцин и его производные), обладающие умеренной активностью против широкого спектра вирусов, включая ВИЧ (AA. Krayevsky, K. A. Watanabe. Modified nucleosides as anti-AIDS drugs: current status and perspectives. - Bioinform, Moscow, 1993, pp. 48, 209). Однако сведений о клинических испытаниях такого рода препаратов в доступной литературе не найдено.

Недавно установлено, что нитроксильные радикалы существенно снижают цитопатическую активность вируса простого герпеса ВПГ-1 как в опытах на культуре клеток, так и в опытах с животными (Горбунов Н.В. и др. Бюл. эксп. биол., 1992, 113(6), 604-606).

Получены данные о том, что развитие СПИДа вызывает в организме больного окислительный стресс, выражающийся в снижении уровня естественных антиоксидантов и появлении признаков перекисного окисления липидов ( W. Droge, H. P. Esk, S. Mihm. lmmunol. Today, 1992, 13, 211-214). Благодаря введению нитроксильных радикалов, которые обладают свойствами специфических антиоксидантов, заявляемые производные (I) в отличие от упомянутых аналогов, могут оказывать регулирующее воздействие на клеточные окислительно- восстановительные процессы, что показано, например, для нитроксильного производного противоопухолевого антибиотика рубомицина (Гуревич С.М. и др. Вопр. мед. химии, 1993, 39, 16-20).

Цель изобретения - получение новых гибридных препаратов с широким спектром антивирусной активности, воздействующих одновременно на ВИЧ и сопутствующие ему вирусные инфекции, Поставленная цель достигается предлагаемыми нитроксильными производными АЗТ общей формулы (I), обладающими активностью как против РНК-содержащих вирусов (ВИЧ и вирус везикулярного стоматита (ВВС)), так и против ДНК-содержащего вируса (ЦМВ).

Нитроксильные производные азидотимидина получают конденсацией азидотимидина, например, с хлорангидридами нитроксилкарбоновых кислот (2а, б) и (3).

Реакцию проводят в среде инертного растворителя, например, ацетонитрила или в среде пиридина. В качестве катализатора и акцептора выделяющегося хлористого водорода используют пиридин или другой третичный амин.

В ходе реакции происходит последовательное замещение атомов водорода 5'-гидроксильной группы сахарного остатка и 3-иминогруппы тимина на нитроксилацильные группы. Селективность замещения зависит от ацилирующей активности хлорангидридов нитроксилкарбоновых кислот (2), (3) и от условий проведения реакции. При медленном добавлении эквимолярных количеств хлорангидридов (2), (3) к раствору азидотимидина преимущественно образуются мононитроксильные производные азидотимидина по кислороду 5'- гидроксильной группы. Замещение атома водорода иминогруппы на нитроксилацильную группу происходит существенно медленнее и для получения динитроксильных производных азидотимидина необходимы избыток хлорангидрида и большое время реакции.

Нитроксильные производные азидотимидина - твердые вещества желтого цвета. Они могут находиться в двух состояниях - в кристаллическом и в аморфном (стекловидном). Кристаллическое состояние имеет четкую температуру плавления, а аморфное при нагревании постепенно переходит в жидкое состояние. Аморфное и кристаллическое состояния также заметно различаются по ИК-спектрам. ИК-спектры аморфного состояния близки спектрам растворов.

Строение полученных нитроксильных производных подтверждено элементным анализом и методами ЭПР, ИК-, УФ- и масс-спектроскопии. Спектры ЭПР разбавленных растворов (C≅10^-3 моль/л) мононитроксильных производных азидотимидина состоят из трех линий, характерных для монорадикалов. Спектры ЭПР динитроксильных производных азидотимидина кроме трех линий содержат дополнительные компоненты, характерные для нитроксильных бирадикалов. Масс-спектры нитроксильных производных азидотимидина содержат пики молекулярных ионов, а также пики осколочных ионов, обусловленные фрагментацией нитроксилацильных и тиминовых групп.

В ИК-спектрах нитроксильных производных азидотимидина присутствуют полосы валентных колебаний азидогруппы около 2100 см^-1 и система полос карбонильных групп тиминового и ацильного фрагментов в области 1670-1730 см^-1. В ИК-спектрах мононитроксильных производных азидотимидина имеются полосы колебаний группы N-H при 3180 см^-1 и нет полос гидроксильной группы около 3460 см^-1. В спектрах динитроксильных производных отсутствуют полосы как имино-, так и гидроксильной группы, поскольку они замещены на нитроксилацильные группы.

Электронные спектры нитроксильных производных азидотимидина обусловлены наложением полос поглощения тиминового и нитроксилацильного хромофоров. Тиминовому фрагменту принадлежат две интенсивные полосы в УФ-области с λ_max около 215 и 265 нм. Желтая окраска полученных соединении обусловлена слабым поглощением нитроксильной группы в области 320-430 нм. Вторая полоса нитроксильной группы с максимумом около 240 нм перекрывается полосами тиминового хромофора.

Ниже приведены примеры получения нитроксильных производных азидотимидина (1а-д), где а - R¹=R³, R²=H; б - R¹=R²-R³; в - R¹=R⁴, R²=H; г - R¹=R²-R⁴; д - R¹=R⁵, R²=H.

Пример 1. Получение 5-0'-(2,2,5,5-тетраметил-1-оксил-Δ³-пирролин-3-илкарбонил)-3'-азидо-2', 3'-дидеокситимидина (1a). К раствору 1,34 г (5 ммоль) азидотимидина в 10 мл пиридина добавляют за 1 ч при перемешивании 1,02 г (5,05 ммоль) хлорангидрида 2,2,5,5-тетраметил-1-оксил-ν-пирролин-3-илкарбоновой кислоты (2а). Реакционную смесь оставляют при комнатной температуре. Через 3 ч добавляют 10 мл толуола. Выпавший осадок пиридинийхлорида отфильтровывают, а раствор упаривают в вакууме. К остатку трижды добавляют по 10 мл толуола и упаривают в вакууме. Получают 2,1 г твердого желтого вещества, которое очищают хроматографией на колонке 30х200 мм с силикагелем 30-40 мкм, элюент CHCl₃-MeCN (20: 1). Получают 1,70 г хроматографически чистого (1а) в виде стекловидного желтого порошка. Вещество не имеет четкой температуры плавления и разжижается при температере выше 70^oC.

Найдено, %: C 52,4; H 5,92; N 19,27.

C₁₉H₂₅N₆O₆.

Вычислено, %: C 52,65; H 5,81; N 19,39.

M 433,45.

ИК-спектр (в вазелиновом масле, λ_max см^-1): 3165 (N-H), 2097 (N₃), 1717 (С= O ацила), 1685 (C=O тимина). УФ-спектр (EtOH, ε см^-1 (Δ³, л/моль·см)): 30700 пл (74), 37700 (9600) и 46750 (22560). ЭПР-спектр (PhMe, 5·10^-4 моль/л, 20^oC): 3 линии с соотношением амплитуд 100:100:87, а^N 1,49 мТ, g 2,0059. Масс-спектр (ЭУ, 70 еВ), m/z (I_отн, %): 433 [M]⁺ (7), 403 [M-110]⁺ (1.2), 309 [M-124]⁺ (6.6), 184 [C₉H₁₄NO₃]⁺ (9), 136 [M-297]⁺ (39), 81 [M-352]⁺ (100).

Пример 2. Получение 3,5'-O-бис(2,2,5,5-тетраметил-1-оксил-Δ³- пирролин-3-илкарбонил)-3'-азидо-2', 3'-дидеокситимидина (1б). К раствору 1,34 г (5,0 ммоль) азидотимидина в 10 мл пиридина добавляют при перемешивании 2,40 г (11,8 ммоль) хлорангидрида 2,2,5,5-тетраметил-1-оксил-ν-пирролин-3-илкарбоновой кислоты (2а). Реакционную смесь оставляют при комнатной температуре. Через 20 ч добавляют 10 мл толуола, выпавший осадок, пиридинийхлорида отфильтровывают, а раствор упаривают в вакууме. Желтый твердый остаток хроматографируют на колонке 30 х 200 мм с силикагелем 30-40 мкм. Элюируют смесью CHCl₃-MeCN (20:1). Вещество (1б) идет первой желтой зоной, которую переводят в элюат. После упаривания элюата получают 0,6 г (1б) в виде желтого порошка, не имеющего четкой температуры плавления и разжижающегося при свыше 70^oC.

Найдено, %: C 56,2; H 6,25; N 16,5.

C₂₈H₃₇N₇O₈.

Вычислено, %: C 56,08; H 6,22; N 16,35.

M 599,65.

ИК-спектр (в вазелиновом масле, λ_max см^-1): 2097 (N3), 1740 (C=O ацила), 1718, 1700, 1660 (С=O тимина), 1622 (С=С). УФ-спектр (EtOH, ε, см^-1, (Δ³, л/моль·см)): 28000 пл (107), 38300 пл (11200) и 45150 (35400). Спектр ЭПР (PhMe, 5·10^-4 моль/л, 60^oC): 5 линий с соотношением амплитуд 100:18:97:18: 90, а_N 1,42 мТ, g 2,0059. Масс-спектр (ЭУ, 70 eB), m/z (I_отн, %): 433 [M-C₉H₁₃NO₂+1] ⁺ (1.4), 403 [M-196]⁺ (1.2), 292 [M-307]⁺ (2.9), 262 [M-337]⁺ (4.7), 184 [C₉H₁₄NO₃]⁺ (14), 136 [M-463]⁺ (93), 41 [M-558]⁺ (100).

Пример 3. Получение 5'-О-(4-бром-2,2,5,5-тетраметил-1-оксил-Δ³-пирролин-З -илкарбонил)-3'-азидо-2', 3'-дидеокситимидина (1в). К раствору 2,67 г (10 ммоль) азидотимидина в 20 мл пиридина за 1,5 ч добавляют при 20^oC и перемешивании 2,85 г (10,1 ммоль) хлорангидрида 4-бром-2,2,5,5-тетраметил-1-оксил-ν-пирролин-3-илкарбоновой кислоты 26. Реакционную смесь перемешивают еще 1 ч при 20^oC, затем добавляют 20 мл толуола. Выпавший осадок пиридинийхлорида отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме. Для удаления следов пиридина оставшееся оранжевое масло трижды растворяют в свежих порциях толуола (10мл) и упаривают в вакууме. Наконец, масло растворяют в 10 мл ацетона и после упаривания в вакууме получают 5,0-5,2 г твердого аморфного продукта, который согласно ВЭЖХ содержит около 4% примеси исходного АЗТ. Вещество очищают хроматографией на колонке с силикагелем, элюент CHCl₃-MeCN (9: 1) или кристаллизацией из ацетона. Из ацетона (1в) кристаллизуется при наличии затравки в виде желтых пластинчатых кристаллов с т.пл. 167^oC.

Найдено, %: C 44,73; H 4,74; N 16,35.

C₉H₂₄BrN₆O₆.

Вычислено, %: С 44,54; H 4,72; N 16,40.

M 512,36.

ИК-спектр (в вазелиновом масле, ε, см^-1): 3191 (N-H), 2091 (N₃), 1731 (C-C); (в CHCl₃): 3386 (N-H свободная), 3181 (N-H связанная), 2104 290( λ_max 290 л/моль·см) (N₃), 1719 (C-O ацила), 1711, 1701, 1691 и 1680 (C=O тимина), 1609 (C=C). УФ-спектр (EtOH, ε, см^-1, (Δ³ л/моль · см)):30000 (62±3), 38200 (12350±20), 4190 (15350±70) и 47200 (17570±70). ЭПР-спектр (PhMe, 5·10^-4 моль/л, 20^oC): 3 линии с соотношением амплитуд 100:100:96, а_N 1,45 мТ, g 2,0057. Масс-спектр (ЭУ, 70 еВ), m/z (I_отн,%): 513 [М]⁺ (2.1), 511 [М]⁺ (2.1), 483 [M-110] ⁺ (0.3), 481 [M-110]⁺ (0.4), 264 [C₉H₁₃BrNO₃ (1.1), 262 [C₉H₁₃BrNO₃]⁺ (0.9), 81 [M-431]⁺ (100).

Пример 4. Получение 3,5'-O-бис-(4-бром-2,2,5,5-тетраметил-1-оксил--пирролин-З-илкарбонил)-3'-азидо-2', 3'-дидеокситимидина (1г). К раствору 1,0 г (3,7 ммоль) азидотимидина в 8 мл пиридина добавляют за 10 мин при перемешивании 2,4 г (8,5 ммоль) хлорангидрида 4-бром-2,2,5,5-тетраметил-1-оксил-ν-пирролин-3-илкарбоновой кислоты (2б). Реакционную смесь оставляют на 6 ч при 20^oC, затем добавляют 10 мл толуола. Желтый пиридино-толуольный раствор отделяют от выпавшей смолы и упаривают в вакууме. К остатку трижды добавляют толуол и упаривают в вакууме. Оставшееся желтое масло при растирании с гептаном и последующем упаривании затвердевает в желтый порошок массой 1,54 г. По ТСХ (Силуфол UV-254), элюент CHCl₃-MeCN (2:1) продукт реакции содержит бирадикал (1г) (R_f 0,75), монорадикал (1в) (R_f 0,30) и другие примеси. Бирадикал (1г) выделяют хроматографией на колонке (30 х 250мм) с силикагелем (30-40 мкм), элюент CHCl₃-MeCN (20:1). После упаривания элюатов, содержащих чистый (1г), получают 460 мг (16%) целевого продукта в виде желтого аморфного порошка. (1г) не имеет четкой температуры плавления и разжижается при свыше 80^oC Найдено, %: C 44,27; H 4,76; N 12,85.

C₂₈H₃₅Br₂N₇O₈.

Вычислено, %: C 44,40; H 4,46; N 12,94.

M 757,44.

ИК-спектр (в CHCl₃, ε, см^-1): 2105 (λ_max 490 л/моль·см) (N₃), 1739 (C=O ацила), 1705 и 1669 (C=O тимина), 1602 (C=C). УФ-спектр (MeCN, ε, см^-1,(ν, л/моль·см)): 26700 пл (89±3), 41000 (22800±400), 46300 (20400±600). ЭПР-спектр (PhMe, 5·10^-4 моль/л, 20^oC): 7 линий с соотношением амплитуд 100:2:4: 99:3:4:92, а_N 1,44 мТ, g 2,0058. Масс-спектр (ЭУ, 70 еВ), m/z (I_отн,%): (757 [M] ⁺ (2), 513 [М-245]⁺ (27), 371 [М-386]⁺ (79), 264 [C₉H₁₃BrNO₃]⁺ (26), 262 [C₉H₁₃BrNO₃]⁺ (24), 153 [M-604]⁺ (100).

Пример 5. Получение 5'-O-(2,2,5,5-тетраметил-1-оксилпирролидин-3-илкарбонил)-3'-азидо-2',3'-дидеокситимидина 1д.

К раствору 1,34 г (5,0 ммоль) азидотимидина в 10 мл пиридина добавляют за 5 мин при перемешивании раствор хлорангидрида 3 в 7 мл бензола, полученный без выделения из 0,9 г (5,0 ммоль) 2,2,5,5-тетраметил-1-оксилпирролидин-З-илкарбоновой кислоты и 0,36 мл SOCl₂. Реакционную смесь оставляют при комнатной температуре. Через 1,5 ч к ней добавляют 20 мл воды и подкисляют разбавленной HCl до pH 3. Бензольный слой отделяют, а водную фазу с осадком дважды экстрагируют этилацетатом (по 15 мл). После упаривания в вакууме бензол-этилацетатного раствора остается 1,5 г твердого желтого вещества, состоящего в основном из мононитроксильного производного 1д. Для очистки продукт хроматографируют на колонке 30х200 мм, заполненной силикагелем 30-40 мкм. Элюируют смесью CHCl₃-MeCN (9:1). Вещество 1д идет в виде желтой зоны, которую переводят в элюат. После испарения растворителей получают 1,1 г хроматографически чистого 1д в виде желтого порошка, не имеющего четкой температуры плавления и постепенно разжижающегося выше 60^oC.

Найдено,%: C 52,1; H 6,42; N 19,2.

C₁₉H₂₇N₆O₆.

Вычислено,% C 52,41; H 6,25; N 19,30.

M 435,46.

ИК-спектр (в CHCl₃, ε, см^-1): 3390 (N-H свободная), 3182 (N-H связанная), 2107 (λ_max 560 л/моль·см), (N₃), 1740 (C=O ацила), 1685 (C=O тимина). УФ-спектр (MeCN, ε, см^-1, (ε , л/моль·см)): 23000 (6,5); 37800 (10500) и 47800 (11600). ЭПР-спектр (PhMe, 5·10^-4 моль/л, 20^oC): 3 линии с соотношением амплитуд 100:98:91, а_N 1,41 мТ, g 2,0058. Масс-спектр (ЭУ, 70 еВ), m/z (I_отн,%): 435 [М]⁺ (7), 405 [М-110]⁺ (1), 311 [M-124] (0,5), 186 [C₉H₁₆NO₃]⁺ (30), 81 [M-354]⁺ (100).

Биологические испытания предлагаемых нитроксильмых производных азидотимидина. Широта спектра антивирусной активности препаратов определяется их способностью ингибировать одновременно как РНК-, так и ДНК-содержащие вирусы.

В качестве РНК-содержащих вирусов использовали вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и вирус везикулярного стоматита (ВВС), а в качестве ДНК-содержащего - цитомегаловирус (ЦМВ).

Пример 6. Активность нитроксильных производных азидотимидина против вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1. Антивирусную активность предлагаемых соединений определяли по ингибирующему действию препаратов на развитие ВИЧ-1 в клетках человеческих лимфоцитов MT-4 (MPC. Britain). Клетки MT-4 суспендировали в среде RPMI LMO (Rosewell Park Memorial Institute), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки. Взвесь клеток, содержащую 2·10⁵ кл/мл, распределяли в 24 луночные плата по 0,5 мл. После короткого периода оседания клеток на дне лунки вносили 0,25 мл вирусной суспензии, полученной из ВИЧ-инфицированных клеток MTHIV (штамм получен в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. H.Ф. Гамалеи РАМН) с множественностью инфекции, равной 100. Затем клетки культивировали при 37^oC в атмосфере воздуха с 5% CO₂ в течение 7 дней и фиксировали охлажденным ацетоном. К фиксированным клеткам добавляли 0,02 мл сыворотки человека, содержащей антитела к ВИЧ-1, и после отмывания клеток фосфатным буфером добавляли 0,02 мл люминесцирующей кроличьей сыворотки против глобулинов человека. По флюоресценции меченных флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) антител, адсорбировавшихся на поверхности клеточных мембран, с помощью люминесцентного микроскопа определяли число клеток, зараженных вирусом, используя три повторности по 1000 клеток в каждой. Для вычитания фона, обусловленного незараженными вирусом флюоресцирующими клетками, параллельно проводили опыты с использованием сыворотки человека, свободной от антител к ВИЧ-1.

Из полученных результатов измерений вычисляли долю зараженных вирусом клеток, которая в контрольных опытах составляла 70%, а в опытах с добавками исследуемых препаратов находилась в интервале 0-70%. По зависимостям эффективности защитного действия препаратов от их концентрации находили минимальную концентрацию препаратов ЕС₁₀₀, которая защищает на 100% клетки МТ-4 от цитопатического действия ВИЧ-1. Величины EC₁₀₀ приведены в табл. 1, где показана антивирусная активность к ВИЧ-1 азидотимидина и предлагаемых нитроксильных производных АЗТ.

Из полученных результатов следует, что антивирусная активность к ВИЧ-1 у нитроксильных производных АЗТ сильно зависит от строения радикала и числа нитроксилышх групп. У предлагаемых нитроксильных производных 1а-д противовирусная активность заметно понижена по сравнению с азидотимидином, однако в случае соединений 1а, 1в и 1г она остается на достаточно высоком для лекарственных препаратов уровне.

Пример 7. Определение токсичности нитроксильных производных азидотимидина на диплоидных клетках М-19. Определение токсичности нитроксильных производных АЗТ проводили на культуре диплоидных клеток эмбриона человека (штамм М-19, зарегистрированный в Международной коллекции клеточных культур Всемирной организации здравоохранения). Применяли взвесь клеток, содержащую 2·10⁵ кл/мл, которую рассевали по 1 мл в 24-луночные плата. Культуральная среда Игла-MEM (из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМП) с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Плата термостатировали при 37^oC в атмосфере воздуха с 5% CO₂. Через 3 сут. на дне лунок формировался слой фибробластов. К фибробластам добавляли по 1 мл раствора препаратов в культуральной среде с концентрацией ≅1 мг/мл. Через 2 сут. термостатирования плата просматривали с помощью микроскопа. По наличию или отсутствию токсического эффекта определяли концентрацию препарата, вызывающую полную дегенерацию культуры клеток ТД₁₀₀, концентрацию препаратов, вызывающую 50%-ную гибель клеток ТД₅₀ и максимальную концентрацию препаратов, не токсичную для клеток НТД. Результаты токсичности производных АЗТ даны в табл. 2. Из полученных результатов следует, что АЗТ и его нитроксильные производные обладают сравнимой токсичностью. Наименее токсичны препараты 1а, 1б и 1д.

Пример 8. Антицитомегаловирусная активность нитроксилых производных азидотимидина. Оценку действия препаратов на ЦВМ проводили в культуре диплоидных клеток человека M-19. Использовали стандартный штамм цитомегаловируса АД-169, полученный в 1992 г. из Института гигиены г. Варшавы. За титр вируса (титр цитопатической дозы, ТЦПД₅₀/мл) принимали обратное разведение маточного образца, вызывающее поражение 50% клеток М-19, т.е. количество цитопатических доз вируса (ЦПД₅₀) в 1 мл маточного образа. В качестве культуральной среды применяли среду Игла-МЕМ (из института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) с 10% сыворотки крупного рогатого скота.

Определение антицитомегаловирусной активности проводили по двум тестам: А - по влиянию препаратов на цитопатическое действие ЦМВ и В - по влиянию препаратов на репродукцию ЦМВ.

Тест А. Взвесь клеток М-19, содержащую 2·10⁵ кл/мл, рассевали по 0,2 мл в 96-луночные плата и культивировали при 37^oC в течение трех суток в атмосфере воздуха с 5% CO₂. Затем культуральную среду сливали и к клеткам добавляли среду поддержки (Игла-МЕМ без сыворотки) по 0,1 мл, содержащие разные разведения маточного материала ЦМВ (от 10^-1 до 10^-8). Две первых полосы (NN 1 и 2) плата оставляли в качестве контроля и к ним добавляли по 0,1 мл среды. В другие полосы (3-12) добавляли также по 0,1 мл среды, содержащей различные концентрации (начиная от нетоксической и меньше) АЗТ и его производных. Через 3 сут. культивирования определяли в микроскопе наличие цитопатического эффекта при разных разведениях вируса, т.е. титр цитопатической активности ТЦП₅₀ в контроле и при воздействии АЗТ и его нитроксильных производных. По разнице титров вируса в контроле и в опыте вычисляли индекс ингибирования (ИИ) цитомегаловируса. Результаты влияния нитроксильных производных АЗТ на цитопатическую активность ЦМВ даны в табл. 3. Из полученных результатов следует, что аницитомегаловирусная активность нитроксильных производных АЗТ определяется строением и числом нитроксилсодержащих фрагментов. Так, азидотимидин и нитроксильные производные 1б, 1в, 1д, взятые в максимальных нетоксических дозах, практически не влияют на цитопатическую активность ЦМВ. В отличие от них соединение 1а на порядок снижает активность этого вируса. Наиболее эффективен препарат 1г, который понижает активность ЦМВ на 2-3 порядка, т.е. на 99,0-99,9%.

Тест Б. Взвесь клеток М-19, содержащую 2·10⁵ кл/мл, рассевали в 24 луночные плата по 1 мл в каждую лунку и культивировали при 37^oC в атмосфере воздуха с 5% CO₂ в течение трех суток. Затем культуральную среду сливали и клетки заливали по 0,5 мл средой Игла-MEM с различными концентрациями вируса (10⁴ ЦПД₅₀/мл, 10³ ЦПД₅₀/мл, 10² ЦПД₅₀/мл), чтобы получить разную множественность инфекции. Последнюю вычисляли из соотношения количества ЦПД₅₀ на 10⁴ клеток М-19. После этого в контрольные лунки добавляли по 0,5 мл среды Игла, а в опытные лунки добавляли по 0,5 мл этой среды, содержащей нетоксические концентрации исследуемых препаратов. Все плата культивировали при 37^oC в атмосфере воздуха с 5% CO₂ в течение трех суток, потом плата замораживали, оттаивали и в каждой лунке определяли титр вновь образованного вируса ТЦПД. По разнице титров ЦМВ в контроле и опыте вычисляли индекс ингибирования (ИИ).

В табл. 4 прослежено влияние АЗТ и его производных на репродукцию ЦВМ. Из полученных результатов следует, что несмотря на разную множественность инфекции, приводящей к различной интенсивности инфекционного процесса (см. результаты контроля) все нитроксильные производные АЗТ оказывают заметное ингибирующее действие на репродукцию ЦМВ. Более выраженную противовирусную активность проявляет препарат 1в, уменьшая выход инфекционного вируса на два порядка. Наиболее эффективным из предлагаемых нитроксильных производных оказался препарат 1г, который практически полностью блокирует репродукцию ЦМВ вне зависимости от множественности инфекции.

Пример 9. Активность нитроксильных производных азидотимидина против вируса везикулярного стоматита. Оценку действия препаратов на репродукцию ВВС проводили в культуре диплоидных клеток эмбриона человека М-19. Использовали модельный лабораторный штамм ВВС Индиана из Института вирусологии им. Ивановского РАМН. За титр вируса ТЦПД₅₀/мл принимали обратное разведение маточного образца, вызывающее гибель 50% клеток М-19 и равное числу цитопатических доз ЦПД₅₀ вируса в 1 мл образца. Для определения анти-ВВС активности взвесь клеток М-19, содержащую 2·10⁵кл/мл в среде Игла-МЕМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота, рассевали в 24 луночные плата по 1 мл в каждую лунку и культивировали при 37^oC в атмосфере воздуха с 5% CO₂ в течение трех суток. Затем культуральную среду сливали и заливали по 0,5 мл средой Игла-МЕМ, содержащей ВВС в концентрации 10³ ТЦПД₅₀/мл. При этом множественность инфекции ТЦПД⁵⁰/кл=0,1. Затем в контрольные лунки добавляли по 0,5 мл среды Игла, а в опытные лунки добавляли по 0,5 мл этой среды, содержащей нетоксические концентрации препаратов. Все платы культивировали при 37^oC в атмосфере воздуха с 5% CO₂ в течение двух суток. Далее в каждой лунке определяли титр вновь образованного вируса. Для этого ту же взвесь клеток М-19 разливали в 96-луночные плата по 0,2 мл в каждую лунку, культивировали 3 сут. при 37^oC в атмосфере воздуха с 5% CO₂ и на выросшем монослое проводили титрование вновь полученного вируса путем заражения десятикратными разведениями. Затем клетки вновь культивировали 2 сут. при 37^oC и при помощи оптического микроскопа в них учитывали наличие или отсутствие цитопатического эффекта. Последнее разведение вирусосодержащего материала, вызывающего гибель 50% клеток, принимали за титр вируса. По разнице титров ВВС в контроле и опыте определяли индекс ингибирования ИИ. Результаты исследования для двух соединений представлены в табл. 5, где прослежено влияние нитроксильных производных АЗТ на репродукцию ВВС.

Из полученных результатов следует, что анти-ВВС активность зависит от числа нитроксильных групп в соединении. Так, нигроксильный монорадикал 1а в 1000 раз снижает выход инфекционного вируса, а близкий ему по строению бирадикал 1б не влияет на репродукцию ВВС.

Совокупность полученных результатов по биологической активности свидетельствует о широком спектре активности нитроксильных производных азидотимидина по отношению как к РНК-, так и ДНК-содержащим вирусам. По сравнению с АЗТ предлагаемые нитроксильные производные обладают меньшей активностью по отношению к ВИЧ-1, однако в случае соединений 1а, 1в и 1г она сохраняется на достаточно высоком для лекарственных препаратов уровне. В отличие от АЗТ, который имеет низкую анти-ЦМВ активность, нитроксильные производные 1в и 1г эффективно ингибируют репродукцию этого ДНК-содержащего вируса. Проверка двух нитроксильных производных 1а и 1б на анти-ВВС активность показала, что соединение 1а эффективно ингибирует репродукцию этого вируса. Токсичность нитроксильных производных АЗТ сравнима с токсичностью азидотимидина. В связи с перспективностью применения лекарственных средств, воздействующих одновременно на ВИЧ и сопутствующие вирусные инфекции, нитроксильные производные азидотимидина 1а, 1 в и 1г являются перспективными препаратами для лечения больных СПИДом.

Важным преимуществом предлагаемых препаратов является их парамагнетизм. Методом электронного парамагнитного резонанса можно определять локализацию парамагнитных препаратов в организме на уровне клетки и ее органелл и получать данные о механизме их биологического действия.

Формула изобретения

Нитроксильные производные 3'-азидо-2',3'-дидеокситимидина общей формулы

где R¹ азотсодержащий гетероцикл, имеющий нитроксильную группу
R² R¹ или H,
обладающие антивирусной активностью.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 20.11.2004        БИ: 32/2004