Способ выявления хламидий

 

Использование: ветеринарная микробиология . Сущность изобретения: способ выявления хламидий включает приготовление препаратов, их окрашивание, инкубацию и микроскопию, при этом в качестве красителя используют 0,1%-ный раствор толуидинового синего в ацетатном буфере при рН буфера 4,2-4,5, а инкубацию препаратов проводят в течение 15-20 мин. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ V

О

О

О фь

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ6СТВУ (21) 4878399/13 (22) 3.1.10.90 (46) 23.01.93. Бюл. ¹ 3 (71) Украинская сельскохозяйственная академия (72) В.Б. Борисевич, В,А. Бортничук и О.Ф.

Петренко (56) Лабораторные исследования в ветеринарии: Вирусные, риккетелозные и паразитарные болезни.: Справочник/Под ред. Б.M.

Антонова. M.: Агропромиздат, t 987, с. 20-33.

Лабораторное дело, 1988. N3,,с. 76 — 77.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к микробиологии и хирургии, и может быть использовано в качестве одного из этапов диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных.

Способ выявления хламидий мржет найти применение при непосредственном обнаружении корпускул хламидий в мазках из патологического материала, а также в гистологических срезах, приготовленных из пораженных органов и тканей, окрашенных толуидиновым синим. Особое значение способ приобретает в процессе прижизненной диагностики хламидиоза, осуществляемой путем выявления хламидий в кляч-препаратах, приготовленных из биопсийного материала, Хламидий в препаратах-отпечатках и гистологических срезах достоверно выявляют иммунофлуоресцентным методом. Однако этот способ применяется только в хорошо оснащенных лабораториях, требует дефицитных реактивов, сложного оборудования и дает весьма нестойкие препараты, непригодные к длительному хранению и повторному излучению. В диагностике хламидиоза в условиях обычной лаборатории или хозяйства этот метод прак. Ы 1789904 А1 (я)ю G О1 N 1/30, С 12 N 1/00 (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ХЛАМИДИЙ (57) Использование: ветеринарная микробиология. Сущность изобретения: способ выявления хламидий включает приготовление препаратов, их окрашивание, инкубацию и микроскопию, при этом в качестве красителя используют 0,1 -ный раствор толуидинового синего в ацетатном буфере при рН буфера 4,2-4,5, а инкубацию препаратов проводят в течение 15 — 20 мин. 1 табл. тически неприменим; к тому же он требует затрат большого количества времени.

Аналогичным недостатком обладает также метод выявления корпускулярйых частиц хламидий в препаратах, окрашенных акридиновым оранжевым, приготовленным на фосфатно-цитратном буфере.

Близкой по технической сущности к изобретению является окраска хламидий по Романовскому-Гимза, которая дает весьма нечеткие результаты, поскольку краситель сильно закрашивает фон препарат-отпечатка, а на гистологическом срезе вообще неприменим. Кроме того,"при данном способе окраски хламидии трудно отличать от клеточного детрита и остатков красителя.

Окраска хламидий по Стемпу карболфуксином возможна только на препаратахотпечатках. Способ требует отмывки избытка красителя (дифференцировка) и докраска малахитовым зеленым для образования фона, на котором будут видны хламидии, Этот метод требует известного мастерства и интуиции. Окраска гистологических срезов этим методом практически невозможна.

1789904

Окраска хламидий по методу Маккиавелло фуксином основным с докраской препара-та метиленовой синью характеризуется теми же недостатками, что и приведенный выше способ. Это же относится и к другим почти идентичным способам выявления хламидий, Наиболее близким к изобретению является метод обнаружения включений

Chiamydea trachornat1s в патологическом материале. Метод йредубйа1 риЬает окраску препаратов смесью меТи7гового зеленого и нейтрального красного с добавлением

ДМСО. Затем пРепараты с нанесенной окрашивающейей смесью ин кубируют 10-15 мин в термостате при 37 С с последующей микроскопией, Однако данный метод рассчитан на выявление компактных колоний, характерных для СЫавудеа trachomatis, ло- кализующихся в клетках. Информативность его значительно снижается в отношении хламидий, находящйхся вне клеток.

Целью изобретения является более точное выявление хламидий" на препаратах-отпечатках и гистологических срезах в" процессе диагностики хлэмидиоза сельскохозяйственных животных, При этом можно проводить исследовайия на месте, непосредственно в хозяйствах, где представляется возможным использование светового микроскопа, Препараты-отпечатки получень1 из поверхности слизистых оболочек, паренхиматозных органов, семенников, суставной жидкости, плодовых оболочек и отделяемого родовых путей (в случае аборта . или патологических родов); Предлагаемый способ вместе с проведением биопсии печени, легких, семенников или пункций пораженных суставов дает возможность непосредственно на месте ставить прижизненный диагноз и проводить необходимые лечебно-профилактические мероприятия.

Применение предлагаемого способа при окраске гистопрепаратов, кроме того, дает возможность увязать наличие хламидий с olt ределенными патогистологическими и патоцитологическими изменениями, что позволяет верифицировать диагноз и углубить изучение болезни, в частности патогенеэ; выяснить изменение хламидий в связи с использованием лечебных средств, наличие полной или частичной санации различных органов и тканей, Эта цель достигается тем, что хламидий содержат обе нуклеиновые кислоты (ДНК и

PHK}, и их обнаружение в препаратах-отпечатках и гйстологйческих срезах предлагается осуществлять при помоЩи гистохимических реакций, используемых для суммарного выявления нуклеиновых кйслот, Препараты-отпечатки готовят из свежеиссеченной поверхности кусочка оргайэ или

10

15 крепляются к стеклу, причем в первую оче20 рудь прилипают подвижные клеточные. хламидиями и теряющие прочную связь с соседними элементами.

Приготовленные препараты подсуши30, вэют на воздухе, помещают в чашку Петри отпечатками вверх на фильтровальную бумагу, предварительно пропитанную 40 /, раствором формальдегида (формалина), и закрывают крышкой. Препараты оставляют при комнатной температуре в течение 12 ч или в бытовом холодильнике при 4 С на

24-48 ч, что приводит к нежной их фиксации парами формальдегида. Фиксированные таким способом препараты-отпечатки можно хранить в чашках Петри в холодильнике на

40 протяжении нескольких месяцев, Из исследуемых тканей готовят также парафинированные срезы, которые депарафинируют, проводят через этанол нисхо45

55 ткани, полученного после убоя или гибели животного, а также хирургическим путем при жизни (метод биопсии). У молодняка и плодов, в том числе абортированных, хламидии локализуются в печени, селезенкЕ, почках, легких, мезентериальных лимфоузлах, семенниках, капсуле суставов, стенке сухожильного влагалища, конъюнктиве, Препараты также готовят из плодынх оболочек абортировэвших коров и свиноматок, из отделяемого родовых путей (после аборта или патологических родов), семенников производителей

Свежеиссеченный острой бритвой или скальпелем отобранный кусочек материала ополаскивают физиологическим раствором с целью удаления крови с его поверхности, затем осторожно прикасаются к обезжиренному в спирт-эфире предметному стеклу.

При этом клетки с поверхности разреза приэлементы (моноциты и макрофаги), инфильтрующие орган или ткань в связи с хламидиозным воспалением. Лейкоциты при данном процессе отсутствуют или встречаются очень редко. Кроме моноцитов и макрофагов на стекло хорошо переходят паренхиматозные клетки, инфицированные,. дящей концентрации (100, 96, 70 ) ополаскивают ацетатным буфером (рН 4,24,5) и помещают в рабочий раствор (1:1000) толуидинового синего, приготовленного на указанном буфере, Время окраски 10 — 15 мин. Затем срезы подсушивают фильтровальной бумагой, высушивают в термостате при 37 — 40 С в течение 1 ч, просветляют ксилолом, наносят каплю бальзама, накрывают покровным стеклом и исследуют с помощью обычного светового микроскопа под средним и иммерсионным увеличением.

Окраску препаратов-отпечатков рабочим раствором толуидинового синего проводят по

1789904 аналогии с гистосрезами в химических ста- разведение толуидинового синего 1:1000 канчиках, придавая предметному стеклу испытанос различной концентрацией водовертикальное или наклонное положение. родных ионов в растворе. начиная c pH 4 0

Профильтрованный раствор красителя мож- до 4,8 с интервалом в 0,1. Максимальную но наносить и на горизонтальную поверх- 5 контрастность маркировки хламидий уданость препарата. Окраску проводят в лось получить при рН раствора толуидинотечение15-20мин при комнатнойтемпера- вого синего 4,2-4,5, Именно при такой туре или (лучше) в термостате при 37 С. 3а- концентрации водородных ионов толуидитем препараты дифференцируют ксилолом до новый синий наиболее отчетливо выявляет наступления просветления, наносят каплю внутриклеточные и внеклеточные формы пихтового или канадского бальзама, накры- хламидий. Первые в виде мелких (0,2-0,8

10 вают покровным стеклом и исследуют под мкм) образований круглой или овальной обычным световым микроскопом при сред- формы определяются в цитоплазме заранем и иммерсионным увеличениях. женных клеток, формируя иногда рыхлые

Толуидиновый синий относится к основ- колонии. Окраска ядра и цитоплазмы не меным красителям ф-лы 15 шает обнаружению хламидий, так как ДНК м NH в клетке содержится главным образом в яд(i

Ц- 1

2 ре, à PHK — в цитоплазме, в связи с чем

3)g " 3 интенсивность окраски этих клеточных

В структур в два-три раза меньше, чем микроОн взаимодействует с фосфатными группа- 20 организма, содержащего обе нуклеиновые ми нуклеиновых кислот и в слабокислой сре- кислоты; кроме того, концентрация нуклеиде при рН 4 — 5 дает синее окрашивание новыхкислотнаединицуобъемавхламидиклеточных и субклеточных структур. Реак- ях в несколько раз больше, чем в клетке, где ция красителя с обеими нуклеиновыми кис- паразитирует микроорганизм. лотами протекает более интенсивно Одновременно при таком методе опре(примерно вдвое), чем с белками или проте- 25 деления хламидий выявлено специфическое огликанами, с которыми толуидиновый си- изменение хламидийных телец за пределаний также способен связываться своими миклетки,кудаонипоступаютвсвязисразруреакционноспособными группировками. В шением инфицированных клеточных связи с этим при сравнительно высоких сте- элементов. Здесь элементарныетельца хламипенях разведения красителя толуидиновый 30 дий в силу неблагоприятного воздействия сресиний относительно слабо окрашивает фо- ды претерпевают выраженные морфологиновые структуры, довольно отчетливо, одна- ческие изменения, которые могут быть использоко, маркируя хламидий. ваны в диагностировании зараженного этим

Опытным путем подобрана концентра- видом паразита материала. 3а пределами ция красителя, которая оказалась наиболее 35 клетки отдельные тельца хламидий сравниоптимальной в разведении толуидинового тельно быстро увеличиваются в размерах, как синего 1:1000. Важную роль в специфично- бы разбухают, и внутри них возникает вначале сти выявления нуклеиновых кислот играет точечное, а затем все более увеличивающееся рН раствора красителя. При рН последнего просветление.Вследствиеэтогообразуютсявесьма.

4,6 в структурах цитоплазмы и ядра только характерныекольцеобразныеструктуры,покрытые нуклеиновые кислоты сохраняют резко вы- 40 снаружи гликолипопротеидной оболочкой, что раженный отрицательный заряд, Осталь- помогает легко дифференцировать хламидий в ные компоненты цитоплазмы, в том числе препаратах-отпечаткахигистологическихсрезах. белки, заряжены положительно или слабо Предлагаемый способ также выявляет и отрицательно, в результате чего краситель инициальные(ретикулярные)тельца хламидий, ими почти не связывается. 45 которые имеют обычную конфигурацию и расЧем дальше рН раствора сдвигается в полагаются скоплениями различной величины. щелочную сторону, тем больше белков учв- Данные по зависимости качества иденствует в связывании основных красителей, тификации от параметров способа приведетем менее специфической в отношении нук- ны в таблице. леиновых кислот становится адсорбция Данные таблицы свидетельствуют о этих красителей. В кислой среде, начиная с значительном преимуществе выявления рН 2,0, ДНК и РНК легко денатурируют, что хламидий путем окрашивания препаратов приводит к изменению сорбции основных 1:1000растворомтолуидиновогосинегоприрН красителей припостановкереакциинанукле- 4,2 — 4,5, лучше при 37 С (хорошие результаты иновые кислоты, что ухудшает их выявление, получены окраской при комнатной температуДля определения максимальной специ- 55 ре). Четкая контрастность хламидий обеспечифичности в целях обнаружения хламидий вает постановкудостоверногодиагноза, 1789904 точности способа, в качестве красителя используют 0,1 -ный раствор толуидинового синего в ацетатном буфере при рН буфере

4,2 — 4,5, а инкубацию препаратов проводят в течение 15-20 мин. рН раствора

Время окрашивания мин

Температура раствора, С

Степень контрастности

Количество

Краситель, его концентрация выявляемых хлами ий, 12

15 . 35

18

37

42

18

37

42

18

37 42

3,5

Толуидиновый синий 0,1

38

30 н

20

15

4,2

18

18

37

84

Формула изобретения

Способ выявления хламидий, включающий приготоаление препаратов, их окрашивание, инкубацию и микроскопию, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения .

18

37

18

37

42

18

37

42

18

37 . 42

37 . 42 ,," 18

37

17

28

18

24

18

26

22

26

34

38

22

46

62

62

Слабая контрастность выявляемых хламидий за счет нарастающего закрашивания фона.

Слабая контрастность, не все хламидии окрашиваются

Достаточный контраст. между фоном и хламидиями, однако хорошо выявляются только элементарные (зрелые) тельца

Количеств выявляемых хламидий значительно возрастает

1789904

18

37

89

4,2

88

18

37

25 18

37

46

68

40

4,2

18

37

62

76

4,5

82

18

37

10

° 1

90 . 86

18

37

12 15"

18

37

42

18

37

68

96

86

54

72

° I

20 дий

18

37

96

45

18

40

° t

Толуидиновый синий 0,1

Продолжение таблицы

Высокая степень контраст- ности окрашиваем

ых хламидий

Полное выявление хламидий за счет оптимизации гисто химических реакций при 37 С

Ухудшение контрастности окрашиваемых хламидий, закрашивание фона

Н изкая степень контрастности окрашиваемых хламидий

Сохраняется средняя степень контрастности окра шиваемых хламидий

Усиливается контрастность окраски промежуточных телец хламидий

Средняя степень контрастности окрашиваемых хламиВысокая степень контрастности Окраши. ваемых хламидий

Снижение контрастности, закрашивание она

1789904

Продолжение таблицы

5,0

18

37

Толуидиновый синий 0,1 %

12

32

Очень слабая контрастноть, заметное окрашивание фона

Некоторое усилие контраста окраски зрелых телец хламидий

Заметное на10

18

37

36

12

18

37

42

18

37

Н

22

54

26

42

56 растание ин,тенсивности

Н закрашивания фона цитоплазмы клеток и ухудшение выявления хламидий

Слабая контрастность в связи с закрашиванием фона

Ухудшение выявления хламидий в связи с закрашиванием фона

Очень плохая

18

37

Н

44

25

18

37

38

40 18

37

Н

18

16 контрастность хламидий в связи с закрашиванием фоHB

Толуидиновый синий

О.О1%

Толуидиновый синий 1

20

Слабое окрашивание хламидий, плохая контрастность

Удовлетворительное окрашивание, плоРомановского

Гимэа (стандартный метод) по стандарту

38 хая контрастность

При всех значениях рН, температурных режимах и экспозициях хламидии закрашиваютя очень плохо; ойи слабо заметны на неокрашенном фоне, При всех значениях рН, температурных режимах и экспозициях происходит сильное закрашивание фона, в связи с чем хламидий обнаружить не удается

1789904

Продолжение таблицы

42

20

Метод Стемпа (стандартный) 15

48

42

Редактор Г.Бельская

Закэз 346 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Составитель О.Петренко

Техред М.Моргентал Корректор С.Юско

Интенсивное закрашивание цитоплазмы, в связи с чем недостаточно четко маркируются хламидии

Недостаточно четкая контрастность в связи с закрашиванием фона (цитоплазмы)

Закрашиван ие фона (цитоплазмы) обусловливает малоудовлетворительную контрастность

Значительное прокрашивание фона предопределяется недостаточно четкую контрастность выявляемых хламидий; трудно дифференцировать хламидии от клеточных элементов и частиц краси-. теля