Рекомбинатная плазмидная днк pgp 120 - 428, кодирующая гибридный белок с антигенными свойствами белка @ р 120 вич- 1

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 15/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4925515/13 (22) 04.04.91 (46) 23.01.93. Бюл. ¹ 3 (71) Научно-исследовательский и конструкторско-технологический институт биологических активных веществ

Научно-производственногс объединения

"Вектор" (72) В.А.Белявская, А.И.Закабунин, И.Н,Долгова, А.A.Èëüè÷åâ, К.Н.Веревкина, И.В.Юдина, И,Й.Красноборов, lO.Ë.Õðèïèí и B.À.Ïåòðåíêî (56) Матер. всес. конф. Тарту — Кяэрику, 20—

22 сент. 1988. T. — Тарту, 1989, с. 113-119.

Патент ЕРВ, 0201716, кл. С 12 N t5/00, 1986. (54) PEKOMGMHAHTHAR ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК P G P 120 — 428, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С АНТИГЕННЫМИ

СВОЙСТВАМИ БЕЛКА G Р120 ВИЧ-1

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению рекомбинантных белков, обладающих антигенными свойствами белков вируса иммунодефицита человека (ВИЧ}, Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), причиной которого является

ВИЧ-опасное, плохо поддающееся лечению заболевание, распространен сейчас во многих странах мира. Основное направление борЬбы с ним — профилактика распространения заболевания и своевременное выявление заболевших, Актуальным является всестороннее изучение заболевания.

Для прогнозирования течения и исхода болезни необходимы диагностические тестсистемы с набором известных антигенных детерминант, гомологичных различным ан,, Я2„„1789562 А1 (57) Использование: получение белков, обладающих антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека. Сущность изобретения: рекомбинантная плазмидная

ДНК pGp 120 — 428 состоит из фрагмента плазмиды pLZ 4. химически синтезированного фрагмента ДНК, кодирующего полипептид, соответствующий области 428-443 епч-ior ВИЧ-1, и фрагмента плазмиды рЕМВ

303, содержащего промотор гена а-амилазы 8. Subtilis, S0-последовательность и инициирующий AT G кодон. Плазмида pGp

120-428 обеспечивает в клетках E. cell синтез гибридного белка, имеющего на Nконце область гомологии с областью 428443 белка gp 120 ВИЧ-1 и обладающего антигенными свойствами gp 120, Выход гибридного белка составляет 1-2 мг/г биомассы, тигенкозначимым областям белков ВИ4-1, с

Весьма перспективным представляется получение антигенов ВИЧ-1 с помощью бактериального синтеза, в частности, в клетках

E. coil, трансформированныхрекомбинантными плазмидами с фрагментами ДНК, ко- 0" дирующими антигеннозначимые участки белков ВИЧ-1, слитые с легко детектируемыми стабильными белками Е. coll, такими как Р-галактозидаза и т. и. ааай

Известно достаточно большое количество работ Ао экспрессии в бактериальйых клетках фрагментов гена епч; кодирующего белок оболочки ВИЧ-1 gp120. Так, в работе на основе векторов экСпрессии рЕх 1 — 3, содержащих слитый cro-lac- с полилинкером на 3-конце lac 2 гена, описано конструироФ вание плазмид, содержащих фрагменты ге1789562 на env: Bg! !! (7071) — Bgi 11 (7651) (276 — 466) и Вдl !1(7651) — Bam Hf à. k(467-750).

Рекомбинантный белок, кодируемый плаэмидой, содержащей Вд! 11 — Bam HI фрагмент, обладал высокой антигенной активностью в условиях иммуноблотинга. Однако рекомбинантный белок, содержащий полипептид, кодируемый фрагментом BglllBg I I t, в состав которого входит область с 428 по 443 аминокислоту белка др 120, антигенными свойствами не обладал.

В другой работе тот же самый Bg !!! (707,) — Вс» И! (7651) фрагмент клонирован в составе экспрессионноговектора р.»М, содержащего промотор-оператор и ген trp Е триптофанового оперона Е соИ;

К основному недостатку Описанного аналога следует отнести отсутствие антигенной активности у рекомбинантного белка, несущего полипептид, кодируемый Bgl II 20 — Bgl !! фрагментом гена епч ВИЧ-1.

Известна плазмида pENV 83, содержащая слитый с началом гена Р-галоктозидаэы природный фрагмент ДНК гена env

ВИЧ-1 размером 1240 н. и., включающий 25 фрагмент, кодирующий область (428-443 а. к,), Полученный гибридный белок узнает антитела к ВИЧ-1 в сыворотках больных СПИДом в тесте ELtSA и предлагается авторами для диагностических тест-систем, Недостатком. рекомбинантной плазмиды pENV 83 является использование потенциально опасного чужеродного генетического материала для ее конструирования, а также наличие в ее основе не- 35 скольких антигеннозначимых участков белков gp 120 и gp 41.

Таким образом, близких аналогов, описывающих конструирование рекомбина нтной плаэмиды, содержащей системати- 40 ческйй фрагмент, соответствующий строго определенному зпитопу антигеннозначймой области (428-443 а. к.) др 120 ВИЧ-1, и зкспрессирующей этот фрагмент в виде пептида, слитного с "N-концом Р- галакто- 45 эидазы, s литературе не имеется.

Целью изобретения является создание рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей высокий уровень синтеза химерного полипептида, имеющего область 50 ,гомологии с областью (428-443) белка др

120 ВИЧ-1, являющейся антигеннозначи-. мой и обеспечивающей высокий уровень синтеза химерного полипептида, обладающего антигенными свойствами белка gp 120 55

В ИЧ-1.

Поставленная цель достигается с помощью рекомбинантной плазмиды pQP

120-428, обеспечивающей синтез в клетках

Е. cali полипептида, обладающего антигенными свойствами белка gp 120 ВИЧ-1. Плазмида рбр 120-428, содержащая химически синтезированный фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент белка gp 120 ВИЧ с координатами 428-443, состоит иэ следующих элементов: большого фрагмента EcoRI-HamHI плазмиды рЫ .4 размером (6790 н, п,); химически синтезированного SauÇA$ацЗА фрагмента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность 428-443 белка env ВИЧ-1, HTLV !11; фрагмента Есор»-$ацЗА, размером 98 н. и. плазмиды рЕМВ 303, содержащего аамилазн ый и ромотор, SD-последовательность и отстоящий от нее на расстоянии 6 нуклеотидных пар инициирующий кодон

ATG, Плазмида pGp 120 — 428 содержит; ген устойчивости к ампициллину в качестве генетического маркера; имеет молекулярную массу 4,6 МДА (раэмер 6955 н, и.); обеспечивает в клетках Е. соИ синтез гибридного полипептида, имеющего область гомологии с областью (428-443) белка

gp 120 БИЧ-1 и обладающего антигенными свойствами белка gp 120 ВИЧ-1, Гибридный полипептид синтезируется в виде химерной

Р -галактоэидазы, имеющей ía N-конце антигеннозначимый фрагмент, соответствующий участку с 428 по 443 аминокислоту белка gp 120.

Сущность изобретения заключается в том, что химически синтезируемый фрагмент ДН К, кодирующий анти ген нозначимую область белка gp 120 env (428-443)

ВИЧ-1, соединяют с геном P -ãaëaêòñýèäàзы в экспрессирующем векторе.

Полученная рекомбинантная плазмида обеспеч»»веет синтез гибридного белка состоящего из полипептида, несущего, антигенную детерминанту белка gp 120 env (428-443) ВИЧ- I, слитного с N-концом P -ãàлактозидазы., Полученный гибридный белок обладает способностью связывать антитела к ВИЧ-1 сыворотки больных СПИДом в EUSA тестах.

Способ конструирования pGp 120 — 428 состоит из нескольких последовательных этапов: на первом этапе в исходную плазмиду pLZ 4 по уникальному BamHI сайту вводят химически. синтезированный Sau ЗА — Sau

ЗА фрагмент ДНК, содержащий в своем составе сайты для двух зндонуклеаз рестрикции Вд! !1 и Harn Ht. Полученная плазмида названа pZ 41. По двум сайтам EcoRI и Вд!!! плазмида pZ 41 встраивают Есой»-SauÇA

1789562

50 фрагмент ДНК из плазмиды рЕМВ 303, содержащий промотор гена а-амилазы, SOпоследовательность и следующий за ним на расстоянии 6 н. и, инициирующий ATG кодон. Полученная плаэмиданазвана;рАЕВ, Она обеспечивает синтез Р- галактозидазы с конститутивного промотора Ра гена а амилазы и может быть использована для получения N-концевых гибридных с P-галактоэидазой белков, т. к. в начале гена Ргалактозидазы за ATG инициирующим кодоном расположен BamHI уникальный сайт.

На следующем этапе плаэмиду pAZR гидролизуют эндонуклеазой рестрикции

BamHi и лигируют с химически синтезированным Bglll - Bam Hl фрагментом ДНК, кодирующим полипептид, соответствующий области 428 — 443 gp 120 ВИЧ-1, Полученная плазмида, названная pGp

120-428, обеспечивает в клетках Е. colt синтез гибридного белка, имеющего область гомологии с областью белка др 120 (428443) и обладающего антигенными свойствами белка gp 120.

Таким образом, впервые получена плазмидная ДНК, обеспечивающая в клетках Е. соИ синтез гибридного белка, обладающего энтигенными свойствами gp 120 ВИЧ-1 за счет экспрессии искусственного гена, кодирующего антигенно-значимую область белка gp 120 (428-443), слитую с P -ãaëaêòoзидазой, На чертеже показана схема конструирования плазмиды pGp 120-428, Обозначения; Ыа — ген Р-лактомазы;

lacZ — ген Р -галактозидазы; Ра SD — регуляторная область, состоящая иу промотора, гомологичного промотору гена а -амилазы из В. subtttts u SD-сайта связывания рибосом.

Сущность предлагаемого изобретения раскрывается в следующих примерах.

Пример 1. Способ конструирования рекомбинантной плазмиды pGp 120-428.

1 мкг ДНК плазмиды pLZ4 расщепляют эндонуклеазной рестрикции Bam Hl (10 единиц) в R-буфере, содержащем 10 мМ трисНС1, рН 7,5, 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCtz, 1 мМ дитиотрейтола (ДТТ). Реакцию проводят в течение 1 ч при 37 С, Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза. Препарат депротеинизируют с помощью фенольной экстракции, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в ТЕ-буфере, содержащем 10мМ НС!, рН 8и 1 мМ ЭДТА.

Препарат индивидуального адапторно- го фрагмента получают при отжиге 60 пикомолей каждого из двух олигонуклеотидов, 5

45 длиной 18 нуклеотидов. Полученный адапторный фрагмент имеет в своем составе сайты для эндонуклеаз рестрикции Bgl П и Bam

Hl, содержит выступающие липкие концы для эндонуклеазы рекстрикции Sau ÇA и имеет следующую структуру:

Bgt II Bam Hl Sau 3A

GATCAGATCTGGATCCGA

TCTAGACCTAGGCTCTAG

Sau ЗА

Лигирование гидролиэованной векторной ДН К pLZ4 (0,02 мкг) адапторного фрагмента (0,40 мкг) проводят с помощью ДНК лигазы фага Т4 (4 единицы) в объеме 10 мкл (инкубацию ведут в течение 10 ч при 12 С), Полученную смесь плазмид используют для трансформации клеток Е. coll JC 5183.

Трансформанты высевают на агаризован ную среду с ампициллином, перекалывают на нитроцеллюлозный фильтр и отбирают клоны, гибридизующиеся с олигонуклеотидным зондом в качестве зонда используют меченый P олигонуклеотид, входящий в состав адапторного фрагмента).

Из отобранных клонов выделяют плаэмидную ДНК, анализируют на наличие сайтов для эндонуклеаз.рестрикции . Bgl II и Bam

Hl, Структуру подтверждают секвенированием: полученную плазмидную ДНК, содержащую-адапторный фрагмент, обозначают

pZ 41. 1 мкг ДНКря41 расщепляют эндонуклеазой рестрикции ЕсоЮ в течение часа в

R-буфере, После этого добавляют рестриктазу Bgl Il и также инкубируют в течение часа при 37 С. Препарат депротеинизируют с помощью фенольной экстракции, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в ТЕбуфере, Фрагмент размером 98 н, и., содержащий промотор а -амилазы, SD-последовательность и расположенный от нее на расстоянии 6 нуклеотидных пар, инициирующий кодон, получают на смеси EcoRI — Sau

ЗА фрагментов ДНК плаэмиды рЕМВ 303.

Выделение индивидуального фрагмента проводят путем электрофоретического разделения в 6 70-ом полиакриламидном геле с последующей электроэлюцией. Лигирование смеси гидролизованной плазмиды pZ41 (0,5 мкг) и фрагмента, кодирующего регуляторную область из рЕМВ 303 (5 мкг), проводят с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (4 единицы) в объеме 10 мкл (инкубацию ведут в течение 10 ч при 12 С).

Полученную смесь плазмид используют. для трансформации клеток Е.colt JM 103.

Трансформанты высевают на агаризованную среду с ампициллином (50 мкг/мл) и J-Gа! (0,1 мкг/мл), отбирают клоны, имеющие синюю окраску, выделяют плазмидную ДНК и

1789562

7 анализируют на содержание клонированного фрагмента.

Плазмидная ДНК, содержащая в своем составе нужный фрагмент, обозначейа

pAZR. Она обеспечивает синтез Р-галакто- 5 зидазы с конститутивного промотора Рц гена а-амилазы. В начале гена

/3 -галактозидазы на расстоянии 15 нуклеотидов от инициирующего кодона ATG находится уникальный сайт Bam HI. 10

1 мкг pAZR расщепляют эндонуклеазой рестрикции Bam Н! (10 единиц) в R-буфере, Реакцию проводят в течение 1 ч при 37 С.

ion íîòó гидролиза анализируют с помощью электрофореза, Препарат депротеинизируют фенольной экстракцией, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в ТЕ-буфере.

Препарат индивидуального фрагмента, кодирующего полипептид, соответствующий области 428-443 белка gp 120 ВИЧ-1, 20 получают при отжиге по 50 пикомолей двух комплементарных олигонуклеотидов. длиной 54 нуклеотида.

Полученный фрагмент ограничен выступающими липкими концами: слева — для эн- 25 донуклеазы рестрикции Bgl И, справа — для рекстриктазы Bam Hl и имеет следующую структуру:

8am Hl

GATCTGAAGCAGATCATCAACATGTGC

CAGCAAGTTCGCAAAGCTATGTACGCG

ACTTCGTCTAGTAGTTGTACACCGTCC

TTCAACCGTTTCGATACATGCGCCTAG

Bglu

Лигирование смеси гидролизованной 35

ДН К pAZR (0,05 мкг) и полученного фрагмента (1 мкг) проводят с помощью ДНК лигазы фага Т4 (4 единицы) в обьеме 10 мкл, инкубацию ведут в течение 10 ч,,Полученный смесью плазмид трансформируют Е, coll JM 40

103. Трансформэнты высевают на агариэованную среду с ампициллином (50 мкг/мл), . не утратившие синей окраски клоны перекалывают на нитроцеллюлозный фильтр (т. к. при встраивании фрагмента в обратной ори-....45 ентации в рамке считыванйя находятся два стоп-кодона, что приводит к остановке счи- .. тывания гена Р-гэлактоэидазы и появлению неокрашенных клонов) и отбирают клоны, гибридизующиеся с олигонуклеотидным 50

"зондом". В качестве "зонда" используют. один из меченых P îëèãîíóêëåîòèäîâ, входящий в состав лигированного фрагмента.

Из отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК, анализируют расщеплением 55 эндонуклеазой рестрикции Взр Rl, Структуру подтверждают секвенированием, Полученную плазмидную ДНК, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, соответствующий области белка

gp 120 с координатами 428-443, обозначают

pGp 120-428.

Пример 2, Очистка рекомбинантного антигена..

Клетки Е. соИ JM 103, содержащие плазмиду рбр 120-428, выращивают на среде LB в присутствии ампициллина (50 мкг/мл) при

37 С в течение 18 ч. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об,/мин в течение 20 мин при 2О. С, промывают 0,1 M NaCI и снова осаждают центрифугированием, После определения массы осадка биомассу суспендируют в 0,1 М трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCIz, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ PMSF, 5 % глицерина, при соотношении: биомасса: буфер: 1: (10 - 30). Клетки разрушают ультразвуком сериями по 30 с с 30-секундными перерывами при охлаждении в ледяной бане, Суммарное время обработки 5 мин. Суспензию центрифугируют при 10 тыс. об./мин, 2 С в течение 15 минут. К полученному осветленному лизату добавляют 30 ый трептомицинсульфат до конечной концентрации 3 . После 30-минутной выдержки при 0 С образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Супернатант, содержащий рекомбинантный антиг ен, обнаруживаемый n o активности/З-галактоэидазы, наносят нэ колонку с ДЭАЭ-целлюлозой ДЕ 52, уравновешенную 0,2 М MTM (буфером, содержащим

0,2 M NaCI, 10 мМ трис-HCI, pH 7,5, 1 мМ

Mg Clz и 1 мМ ДТТ).

После нанесения колонку промывают

0,2 M MTM и элюируют сорбировэнные белки линейным градиентом МаС! (0,2-0Я M}.

Выход гибридного белка определяют по наличию д ктив ности Р-гэлактозидээы

Фракции, содержащие рекомбинантный;.нтиген, объединяют, гибридный белок осаждают сульфатом аммония, добавляя его до конечной концентрации 231 мг/мл. Осадок, собранный центрифугированием, растворяют в 20 мМ трис-НС1 рН 7,5, 20 мМ ЭДТА и хромэтографируют белок на геле Toypearl

Т5К бе1 HW 557. Обнаружение белка производят кэк описано в случае хроматографии нра ДЭАЗ-целлюлозе. Концентрацию рекомбинантного энтигенэ определяют, учитывая, что величина удельной активности

Р-галактозидазы равна 300 тыс, ед. акт./мг

Антигенную активность гибридного белка, полученного после ионообменной хрома- . тографии и гель-фильтрации, оценивают по результатам иммуноферментвого анализа с сыворотками крови человека, унифицированного ВИЧ. Выход гибридного белка, обпадающего энтигенными свойствами белка

1789562

Р-галактозидазы, t

9

gp 120, составляет 1 — 2 мг/г клеточной биомассы.

П р и M е р 3. Имуноферментный анализ, Селективное связывание антител к ретровирусу HTLVIII с иммобилиэованным рекомбинантным полипептидом, включающим фрагмент белка gp 120 ВИЧ-1, Рекомбинантный полипептид, включающий область (428 — 443) белка gp 120 ВИЧ-1, подвергали сорбции на полистироловых планшетах производства NUAk (Дания) или Flow (Великобритания) в концентрации 2-10 мкг/MR в 0,06 М бикарбонатного буфера рН

9,6 в течение 16 ч при 2-8 С. Далее проводят стандартный тест иммуноферментного анализа с сыворотками донорской крови человека ("отрицательные" Я и с сыворотками, содержащими антитела к структурным белкам вируса HTLV III, предварительно верифицированными в тесте иммуноблотинга ("положительные" (+)).

Иммуноферментатйвный анализ проводят согласно инструкции по применению тест-системы "Рекомбинант-ВИЧ" для выявления антител к ВИЧ-1.

1. Выдерживают испытуемые сыворотки в разведении 1: 100 на физиологическом растворе, забуференном фосфатами, рН 7,4, . с добавлением детергента ТВИН-80 до конечной концентрации 0,5 % (ФСБ-Т) в лунках планшета с сорбированным полипептидом, включающим фрагмент белка gp 120 ВИЧ-1, Инкубацию проводят при 37 С в течение 60 мин.

Несвяэавшиеся компоненты сывороток отмывают 3 раза ФСБ-Т, 2. Вьдерживают отмытые планшеты с коньюгатом (белок А золотистого стафилококка — пероксидаза хрена) в рабочем разведении, Инкубацию проводят при 37 С в течение 60 мин, отмывают 3 раза.

3. Инкубация с ферментативным субстратом, представляющим собой 5 М раствор ортофенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере, рН 6 с добавлением 0,025 % перекиси водорода. Инкубацию с субстратом проводят 30 мин при комнатной температуре в темноте. Для остановки реакции к пробе (100 мкл) прибавляют 50 мкл 2 М Н2304, стабилизирующей хромогенный продукт реакции.

Формула изобретения

Рекомбинантная плазмидная ДНК pGp

120 — 428, кодирующая гибридный белок с

4. Для количественной оценки результатов планшеты с субстратом после остановки реакции помещают в автоматический фотометр типа "Мультискан" для измерения поглощения при длине волны 492 нм. Для вынесения заключения о специфическом связывании антител к ретровирусу НТЮ !И с рекомбинантным пептидом оценены следующие показатели: интенсивность связывания иммуноглобулинов из положительной сыворотки с рекомбинантными полипептидом, включающим область gp 120 (А 492); интенсивность связывания иммуноглобулинов из коммерческого диагностического набора в рекомбинантным пептидом (А 492)

В 20 экспериментах в качестве подложки были использованы четыре образца рекомбинантного полипептида. Среднее значение величин связывания иммуноглобулинов из положительной сыворотки с рекомбинантным полипептидом (А+4Эг) составило 0,499, среднее значение величин связывания иммуноглобулинов из отрицательной сыворотки (А 4g2) 0,266 математическая обработка по методу вычисления критерия Стьюдента показала, что отличия значений А 49г и А 82 достоверны (Р > 0,999).

Предлагаемое изобретение позволяет получать с 1 л клеточной суспензии 10 мг гибридного белка, имеющего область гомологии с белком gp 120 (428-443)ВИЧ-1 и обладающего антигенными свойствами белка

gp 120 ВИЧ-1. При этом синтеэируемый гибридный белок представляет собой полипептид. состоящий из 16 аминокислот, соответствующих области белка gp 120 (428 — 443), фланкированный слева 8 аминокислотами, кодируемыми регуляторным фрагментом и адапторной последовательностью, и справа 4 аминокислотами, кодируемыми линкерной областью, и 1033 аминокислоты белка P галактозидазы. Таким образом, в изобретении впервые получен гибридный полипептид, обладающий антигенными свойствами белка gp 120

ВИЧ-1 за счет экспрессии химически синтезированного фрагмента ДНК, гомологичного антигеннозначимой области белка gp 120 с координатами 428-443, слитого с геном антигенными свойствами белка др 120 ВИЧ1, имеющая размер 6955 н. и, и состоящая иэ:

1789562

Составитель В.Белявская к

Редактор:

Техред М.Моргентал Корректор И,Мус а

Заказ 329 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Пройзводственн6- издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, f 01

11

EcoRI — 8am Hl фрагмента ДНК вектора

pLZ4, размером 6790 н. и., Sau ЗА — Sau ЗА сйнтетического фрагмента ДНК. размером . 54 н и., кодирующего область белка gp 120 епч (428-443) ВИЧ-1; Заи ЗА — Есор фрагмента ДНК из плазмиды РЕМВ 303, размером 98 н. и.. кодирующего промотор, гомологичный промотору а -амилазы из

Есор

BacIIIus subtIIIs, SD-последовательность, AH/-инициирующий кодон, генетические маркеры Ар -ген устойчивости к ампициллину; уникальные сайты рестрикции

EcoRI, SatG1, расположенный вправо от

EcoRI на расстоянии 3248 н. и.. Рз0. расположенный влево от Есор! на расстоянии 752 н. и.