Способ получения лектина

 

Изобретение относится к биохимии и касается способа получения лектина из коры робинии ложноакациевой. Целью изобретения является повышение степени чистоты. Способ осуществляют путем экстракции измельченной коры робинии ложноакациевой , собранной в период распускания почек 0,9%-ным водным раствором хлорида натрия, высаливания, диализа, аффинной хроматографии на сорбенте овомукоид, полученном из нерастворимых гликопротеидов белка куриного яйца, элюацию осуществляют 1 %-ным раствором уксусной кислоты, высаливанием хлоридом натрия, повторным диализом, очисткой на ДЭАЭ- целлюлозе в 0,07 м фосфатном буферном растворе, затем высаливают хлоридом натрия и лиофилизируют. Положительный эффект заключается в повышении степени очистки, по данным диск-электрофореза лектин представлен двумя близко идущими изоформами.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ts>>s А 61 К 35/78

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) «сии нтнр техничеекаи

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4882954/14 (22) 16.11.90 (46) 07.03.93. Бюл. N 9 (71) Львовский государственный медицинский институт (72) В.А.Антонюк, А.Е.Котык и Л.И,Амбарова (56) Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 532, ¹ 1,, рр. 98 — 104, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКТИНА (57) Изобретение относится к биохимии и касается способа получения лектина из коры робинии ложноакациевой. Целью изобретения является повышение степени чистоты. Способ осуществляют путем экстракции измельченной коры робинии ложночИзобретение относится к получению биологически активных веществ, в частности, к способам получения лектина из коры

Robinia pseudoacacia L, Этот лектин может использоваться для проведения исследований в биохимии и медицине, а именно, в гистохимических и цитохимических исследованиях, биотехнологии.

Цель изобретения — повышение чистоты получаемого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что очистку проводят на аффинном сорбенте

"овомуцин", полученном из нерастворимых гликопротеидов куриного яйца, высаливание проводят хлоридом натрия, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе в

0,07 М фосфатном буфере, Способ получения аффинного сорбента

"овомуцин" для очистки лектинов опубликован 07.04.90., бюлл. ¹ 13. А.С, ¹ 1554961.

Ы3 1 799599 А1 акациевой, собранной в период распускания почек 0,9%-ным водным раствором хлорида натрия, Bысаливания, диализа. аффинной хроматографии на сорбенте "овомукоид", полученном из нерастворимых гликопротеидов белка куриного яйца, элюацию осуществляют 1%-ным раствором уксусной кислоты, высаливанием хлоридом натрия, повторным диализом, очисткой на ДЭАЭцеллюлозе в 0,07 м фосфатном буферном растворе, затем высаливают хлоридом натрия и лиофилизируют, Положительный эффект заключается в повышении степени очистки, по данным диск-электрофореза лектин представлен двумя близко идущими изоформами.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для очистки используют аффинный сорбент "овомуцин". обладающий более высокой химической и механической прочностью, а также лучшими гидродинамическими свойствами, который к тому же обладает высоким средством к лектину коры Robinia pseudoacacia .

Пример. Кору Robinia pseudoacacia L собирают вмомент распускания почек,,когда активность лектинов максимальна. 1 кг измельченной коры экстрагируют 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении коры к экстрагенту 1:10 на протяжении 1 — 3 часа при непрерывном перемешивании. Полученный экстракт отжимают через плотную ткань и центрифугируют при 2500 g на протяжении 10 мин. Затем рН раствора доводят до 3,0 и добавляют NaCI из расчета 320 г/л.

Осадок собирают центрифугированием 15 мин при 3000 g. Супернатант сливают, а

1799599

Составитель В.Антонюк

Техред М,Моргентал

Корректор Н.Милюкова

Редактор С,Кулакова

Заказ 1123 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 осадок размешивают в пятикратном количестве воды и рН раствора доводят до 8,0»-0,5.

Нерастворившийся осадок отбрасывают, Надосадочную жидкость, полученную на предыдущей стадии, диализируют против 0,1 M фосфатного буферного раствора, рН 7,5+0,5 с 0,5 М натрия хлорида. После диализа наносят на колонну, заполненную аффинным сорбентом. Для очистки лектина, получаемого из 1 кг коры Robinia

pseudoacacia L. собранной в момент распускания почек, достаточно 2,2»-0,3 л сорбента. Колонку предварительно отмывают от консерванта и уравновешивают 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 7,5»-0,5.

После нанесения раствора лектина колонку промывают тем же буферным раствором до тех пор, пока светопоглощение при 280 нм не станет ниже 0,05, затем лектин снимают с колонки путем промывки ее 17, раствором 20 ацетатной кислоты, Фракции, содержащие лектин, объединяют и белок высаливают при рН 7,0 320 г/л хлоридом натрия. Осадок собирают центрифугированием, затем растворяют в 5-кратном количестве дистиллированной воды и ставят на диализ против 0,07» 0,01 М фосфатного буферного раствора, рН 7,0 с не менее, чем с трехкратной сменой растворителя с интервалом в 8 часов. Небольшой осадок, нерастворившийся после диализа, отбрасывают, Отдиализованный раствор лектина наносят на колонку, заполненную ДЭАЭ-цел- 35 люлозой (НПО "Биолар", Олайне), уравновешенную тем же буферным раствором. Объем колонки 50 см . В этих условиях з лектин проходит через колонку без задержки, тогда как пигмент и примесные белки 40 при этом задерживаются на колонке.

Контроль выхода лектина проводят с помощью реакции гемагглютинации с эритроцитами человека, Фракции, содержащие лектин, объединяют, лектин высаливают хлоридом натрия (320 г/л), осадок растворяют в пятикратном количестве дистиллированной воды и после диализа против воды лиофильно высушивают. Выход — 1,5»-0,3 г лектина из 1 кг воздушно-сухой коры, собранной во время распускания почек.

Готовый продукт после лиофильной сушки представляет собой белый аморфный порошок, хорошо растворим в 0,9 /-ном растворе натрия хлорида, Минимальная концентрация, агглютинирующая эритроциты человека I/О/ группы — 0,6 мкг/мл. Лучшим ингибитором активности лектина среди моносахаридов является 2-ацетамидо-2-дезоксигалактопиранозид (минимальная концентрация, угнетающая активность

4 гемагглютинирующих единиц лектина—

6,25 мМ). По данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле, в щелочной буферной системе, рН 8.6 в присутствии 0,1 /, додецилсульфата натрия, лектин состоит из двух близко идущих изоформ, которые имеют мол.массу 56+2 кД и 60+2 кД.

Формула изобретения

Способ получения лектина путем экстракции измельченной коры робинии ложноакациевой (Robinia pseudoacacia L,) 0,9 -ным водным раствором хлористого натрия, высаливания, диализа, аффинной хроматографии, элюции, повторного диализа и высушивания, отличающийся тем, что, с целью повышения степени чистоты, используют кору робинии ложноакациевой, собранную в период распускания почек, аффинную хроматографию проводят на сорбенте "овомукоид"; полученном из нерастворимых гликопротеидов белка куриного яйца, элюци ю осуществляют 1 / -и ы м раствором уксусной кислоты, высаливают хлоридом натрия и после диализа очищают на ДЭАЭцеллюлозе в 0,07 м фосфатном буферном растворе, а перед лигофилизацией повторно высаливают хлоридом натрия.