Способ получения человеческого эритропоэтина

 

Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих гены эритропоэтина, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов , и получения in vitro активного человеческого эритропоэтина. Целью изобретения является повышение активности эритропоэтина . Способ состоит в том, что осуществляют получение геномного ДНК клона эритропоэтина человека гибридацией с зондами и его выделение, конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих ЭПО человека, с последующей трансформацией полученными ДНК штаммов клеток млекопитающих (например cos I), выделением и очисткой целевого продукта.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 15/27

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ—

К ПАТЕНТУ

1 (21) 4203324/13 (22) 09,09.87 (62) 4028136/03 (86) РСТ/US 85/02405 (03.12.85) (23) 01.08.86 (46} 07.03.93. Бюл. N. 9 (31) 693.258 (32) 22.01.85 (33) US (71) Дженетикс Институт, Инк (US) (72) Эдвард Фритч (US), Родни М, Хьювик (GB) и Кеннет Джекобс (US) (56) US N - 4377513, кл, А 61 К 37/24, 1983, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЭРИТРОПОЭТИНА

Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих гены эритропоэтина человека, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов и получения in vitro активного человеческого эритропоэтина.

Целью изобретения является повышение активности эритропоэтина.

Способ, описанный в данной заявке, раскрывает массовое производство белков, проявляющих биологическую активность человеческого ЭПО. При этом возможно получать белки, которые химически отличаются от аутентичного человеческого ЭПО, но проявляют свойства характерные для него и в некоторых случаях даже улучшенные, Настоящее изобретение касается клонирования гена, кодирующего ЭПО, и его

1801118 А3 (57) Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих гены эритропоэтина, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов, и получения in vitro активного человеческого эритропоэтина. Целью изобретения является повышение активности эритропоэтина. Способ состоит в том, что осуществляют получение геномного ДНК клона эритропоэтина человека гибридацией с зондами и его выделение, конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих ЭПО человека, с последующей трансформацией полученными ДНК штаммов клеток млекопитающих (например cos l), выделением и очисткой целевого продукта. экспрессии in vitro. Описаны пригодные векторы экспрессии клетки, трансформированные рекомбинантными плазмидными

ДНК, кодирующими Э ПО. а также схема очистки ЭПО.

Способ состоит в том, что предварительно ЭПО подвергают очистке до гомогенности и переваривают трипсином. Эти фрагменты очищают и определяют нуклеотидную последовательность ЭПО. Синтезируют олигонуклеотиды. зная эти последовательности. Олигонуклеотиды используют для скрининга человеческой геномной библиотеки. из которой ген выделяют ген ЭПО.

Получают кДНК-библиотеку печени плода человека и подвергают ее скринингу.

Получают три клона кДНК ЭПО (после скрининга > 750000 рекомбинантов). Два из этих

О

j00 () 1801118

10

20

55 трех клонов имеют полную длину, Эти кДНК клонируют в вектор экспрессии, трансформируют ими клетки вируса SV-40 обезьяны (клеточная линия COS-1), а также клетки яичника китайского хомячка (клеточная линия

СНО), ЭПО, полученный из клеток COS, является биологическими активными ЭПО in

vitro u in vivo. ЭПО, полученный из клеток

СНО, также биологически активен in vitro u

in vivo, кДНК-клон ЭПО имеет открытую рамку считывания из 14 — 15 аминокислот(аа) с инициатором и терминатором из 20 — 30 нуклеотидов (ht) вверх по направлению кодирующей области. Образец Е.coli, трансформированный клонированным геном

ЭПО, депонирован в American Type Culture

Collection, Rock ville, Maryland, под номером

АТСС 40153.

Основные этапы способа состоят в следующем. Выделение геномного клона человеческого ЭПО.

1. Человеческий ЭПО очищают до гомогенности из мочи пациентов, страдающих апластической анемией. Полное переваривание этого очищенного ЭПО трипсином протеазы дало фрагменты, которые разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой, подвергают секвенированию (см. табл,2 и 3).

Две из аминокислотных последовательностей Val-Ash-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lyy u Val-TyrSer-Asn-Phe-Leu-Arg, выбирают для конструирования олигонуклеотидных зондов, Олигонуклеотиды используют для скрининга человеческой геномной ДНК-библиотеки в векторе Ñh4À.

Фаг, гибридизирующий к 17 мег, отбирают распределяют на малые группы и гибридизуют с 14 мег и 18 мег пулами, Фаг, гибридизирующий к 17 мег. 18 мег и 14 мег пулам, очищают от пятен. а фрагменты субклонируют в векторы М13 для секвенирования путем дидезокси-метода, и получают два клона Л -HPOI и Л вЂ” НЕРО 2, 2, Выделение клонов кДНК ЭПО.

Northern анализ сыворотки плода телен ка (возраст 20 недел ь) пече ночной м P Н К осуществляют с использованием 95 nt однонитиевого зонда, полученного из клона М13, содержащего участок 87 bp экзона, описанного в табл,1. Далее мРНК ЭПО идентифицируют с использованием того же зонда для скрининга Л -кДНК библиотеки бактериофага мРНК сыворотки плода теленка. Месколько гибридизирующих клонов получают с частотой приблизительно 1 положительный на 250000 подвергнутых скринингу рекомбинантов. Полная нуклеотидная и аминокислотная последовательности для этих клонов (Л-HEPOF L13 и Л -HEPOF L8) представлены в табл,5 и 6.

3, Структура и последовательность гена

ЭПО человека. Гибридизационный анализ этих клонированных ДНК при помощи олигонуклеотидных зондов и различных зондов позволил определить положение гена ЭПО внутри приблизительно 3,3 кб области. Полный анализ секвенирования этой области и сравнение с клонами кДНК приводят к получению карты интронной и экзонной структуры гена ЭПО. Ген ЭПО имеет 5 экзонов.

Часть экзона 1, полные экзоны II, III и И, а также экзон V содержат кодирующую белок информацию. Оставшиеся части экзонов! и

V кодируют 5- и 3-нетранслируемые последовательности.

4, Неустойчивая экспрессия ЭПО в клетках COS.

Вектор р9 1023/В/ содержит основной поздний промотор аденовируса, последовательность полиаденелирования SV40, SV40 — начало репликации, ген-усилитель SV40 и ген VA аденовируса. Вставку кДНК из

HEPOF L13 встраивают в вектор р91023 и получают рекомбинантную плазмидную

ДНК pPTF — L13. Полученной ДНК трасфектируют штамм Мб клеток COS 1, клетки промывают, переносят в среды, не содержащие сыворотку, клетки собирают через 48 ч.

С использованием количественного радиоиммунного анализа исследуют уровень экспрессии ЭПО в культуральную надосадочную жидкость, Вектор, содержащий кДНК ЭПО из Л -HEPOF L13, трансфектируют в клетки COS-1. Наличие ЭПО в культуральной среде определяют с помощью Н-тримидин и CFU-E методом или з любым из двух анализов in vivo. а именно гипоксическая мышь и голодающая крыса, Этй результаты показывают. что биологически активный ЭПО продуцируется в клетках

COS-1. Было установлено, что ЭПО, продуцируемый клетками COS, имеет подвижность на SDS-полиакриламидном геле, которая идентична подвижности нативного

ЭПО, полученного из человеческой мочи.

Различные векторы, содержащие другие промоторы, также могут быть использованы в клетках COS или в других млекопитающих или эукариотических клетках. Примеры этих иных промоторов, которые могут быть использованы в заявленном способе, включают ранние и поздние промоторы SV40, генный промотор металлотеоннина мыши, промотор, обнаруживаемый в длинных концевых повторах ретровирусов

1801118

55 птиц или млекопитающих, полиэдральный генный промотор бакуловируса и другие.

Примерами штаммов — реципиентов, которые могут использоваться в заявленном способе, являются Е.coli, дрожжи клетки млекопитающих, такие как СНО (яичник китайского хомячка), С127 (эпителий обезьяны), 3ТЗ (мышиный фибробласт), CV-1 (почка африканской зеленой мартышки) и клетки насекомых такие, как клетки от

Spodoptera trugiperda u DrosophIla

metanogaster. Эти промоторы и типы клеток могут обеспечить возможность регулирования уровня экспрессии ЭПО.

Вирус ядерного полиэдроза имеет геном двунитевой кольцевой ДНК размером

128 кб. Нуклеокапсид вируса имеет палочковидную форму и находится упакованным в двух формах. Эти вирусы могут быть обычным путем размножены в культуре клеток насекомых. Среды для культивирования этих клеток — это обычно питательный солевой раствор и 10 -я фетальная телячья сыворотка. In vitro, вирусный рост инициируется, когда неокклюдированный вирус (НОВ) входит в клетку и продвигается к ядру, где он реплицируется, Репликация является ядерной, В течение начальной фазы (8 — 18 ч постинфекции) вирусной аппликации нуклеокапсиды собираются в ядре и впоследствии проходят через плазменную мембрану распространяя инфекцию по культуре клеток. Кроме того, некоторые нуклеокапсиды впоследствии (еще 18 ч постинфекции) остаются в ядре и закупориваются в белковой матрице, известной как полиэдральное внутриклеточное включение (ПВВ).

Эта форма не является инфекционной в культуре клеток. Матрица состоит из белка, известного как полиэдрин, молекулярный вес 33 кд. Каждое ПВВ имеет приблизительно 1 мм в диаметре и в ядре могут быть до

100 ПВВ, Ясно, что большое количество полиэдрина продуцируется позже в цикле заражения и оно составляет до 25 общего количества клеточного белка.

Так как ПВВ не играет роли в цикле репликации In vitro, полиэдриновый ген может быть убран из вирусной хромосомы без какого бы то ни было влияния на жизнеспособностып vitro, При использовании вируса в качестве вектора экспрессии заменяют область, кодирующую полиэдриновый ген, чужеродной ДНК и помещают ее под контроль полиэдринового промотора. Это приводит к вирусному фен отипу, не образующему Il B B.

Описаны рекомбинантные плазмидные

ДНК, содержащие ген ЭПО под контролем промотора вируса ядерного полиэдроза, В результате генетической рекомбинации происходит замещение области полиэдринового гена AsN PYC дезоксирибонуклеиновой кислотой из плазмиды.

Рекомбинантный ЭПО, полученный в клетках СНО, очищают традиционными методами колоночной хроматографии, Биологическую активность очищенного рекомбинантного ЭПО in vitro определяют известными методами (биопроба на пролиферацию клеток селезенки).

Удельная активность in vitro полученного и очищенного рекомбинантного ЭПО составила 200000 ед./мг белка. Среднее значение находится в интервале 275000—

300000 ед./мл белка. Наблюдались значения выше чем 300000. Отношения активности in vivo к активности in vitro, исследуемые для рекомбинантного ЭПО, равны 0,7 — 1,3.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. ЭПО очищают от мочи пациентов, страдающих апластической анемией, известным методом за исключением того, что опускают фенольную обработку и заменяют термообработкой и ри 80" С в течение 5 мин для инактивации нейраминидазы.

Конечную стадию очистки проводят путем фракционирования на колонке С-4 VyLac высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием от 0 до 95 / ацетонитрильного градиента с 0,1 трифторуксусной кислоты (ТФК) в течение

100 мин. Положение ЭПО в градиенте определяют электрофорезом в геле и анализом

N-концевой последовательностью основных пиков, ЭПО элюируют при 53 / ацетонитрила и обнаруживают приблизительно

40 белка, подвергаемого высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЭПО, выпаривают до 100 мкл. доводят до рН 7 бикарбоната аммония и обрабатывают 2 ым ТРСК-обработанным трипсином в течение 18 ч при 37 С. Полученные фрагменты подвергают ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано выше. Хорошо отделенные пики выпаривают почти до сухости и подвергают непосредственно анализу N-концевой аминокислотной последовательности. используя газофазный секвениатор модели 480А.

Определяют последовательность. приведенную в табл. 2 и 3. Два фрагмента, полученные в результате обработки трипсином. отбирают для синтеза олигонуклеотидных

1801118 зондов. Из последовательности Val-AsnPhe-Tyr-Ala-TrP-Lys получают 17 мег со следующей нуклеотидной последовательностью, А А А

TTCCANG CGTAGAAGTT и 18 мег со следующей нуклеотидной последовательностью 10

А А А

CCANGCGTAGAAGTTNAC.

Из последовательности, Val-Tyr-Ser-Asn- 15

Phe-Leu-Arg получают два пула 14-меров.

TTGNTT TTGNTT

ТАСАСТААСТТССТ и ТАСАСТААСТТСТТ

Олигонуклеотиды метят в 5-конце Р, ис32 пользуя полинуклеотидную киназу и гамма

P-ATP, Удельная активность олигонуклеотидов варьирует между 1000 и 3000 дюйм /ммол олигонуклеотида. Геномную 25

ДНК-библиотеку человека в бактериофаге лямбда подвергают скринингу. Приблизительно 3,5 х 10 фага высевают с плотностью

6000 фага на 150 мм чашку Петри со средой

NZCYM и инкубируют при 37 С до тех пор, 30 пока пятна не станут видными, однако маленькими (приблизительно 0,5 мм), После охлаждения при 4 С в течение 1 ч дупликатные реплики переносят на найлоновые мембраны и инкубируют в течение ночи при 35

37 С на чашках со свежими средами

NZCYM. Затем фильтры денатурируют и нейтрализуют в течение 10 мин каждого на тонкой пленке 0,5Н NaOH-1М NaCI и 0,5М

Tris (рН 8) — 1М NaCI соответственно, Вслед 40 за вакуумной сушкой при 80 С в течение 2 ч фильтры промывают в 5 х SSC, 0,5 SDS в течение 1 ч и клеточные остатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухой тканью. Это соскабливание 45 снижает фоновое связывание зонда с фильтрами, Фильтры затем промывают водой и предварительно гибридизируют от 4 до 8 ч при 48 С в ЗМ растворе тетраметиламмонийхлорида, 10 мМ NaP04 (рН 6,8), 5 х 50

Denhardt s, 0,5/ SDS и 10 мМ ЭДТК, 17 мег, меченый Р, затем прибавляют при концентрации 0,1 пмол/мл и гибридизацию осуществляют при 48 С в течение 72 ч. Вслед за гибридизацией фильтры промывают экстен- 55 сивно в 2 х SSC (0,3 М NaCI — 0,03М цитрат натрия, рН 7) при комнатной температуре и затем в течение 1 ч в ЗМ TMACP-10 мМ

NaPO4 (рН 6,8) при комнатной температуре и от 5 до 15 мин при температуре гибридизации. Приблизительно 120 сильных дупликатных сигналов обнаруживают вслед за 2-х дневной авторадиографией усиливающим экраном. Положительные сигналы отбирают, группируют в пулы из 8, пересевают и вновь подвергают скринингу с использованием 1/2 14 мег пула на каждом из двух фильтров и 127 мег на третьем фильтре. Условия высева и гибридизации при этом те же, но гибридизацию осуществляют при

37 С. Вслед за авторадиографией зонд с фильтра переносят в 50 -ом формамиде в течение 20 мин при комнатной температуре и фильтр повторно гибридизируют при 52 С

18 мег зондом. Два независимых фага гибридизируют со всеми тремя зондами. ДНК из одного из этих фагов обозначают здесь

il-HE POI, Переваривают рестриктазой

Sau3A и субконируют в М13 для анализа

ДН К-последовател ьн ости.

Пример 2, 5 мкг мРНК человеческой печени эмбриона и мРНК печени взрослого человека подвергают электрофорезу в 0,8 ом агарозном формальдегидном геле и переносят на нитроцеллюлозу. Однонитевый зонд получают, из матрицы М13. содержащей вставку, показанную в табл.1. Праймером является 20 мег, происходящий из того же фрагмента, что и первоначальный 17 мег зонд, Получают зонд за исключением того, что вслед за расщеплением Smal малый фрагмент очищают от М13 хроматографией на колонке с Сефарозой С14В и 0,1 N NaOH — 0,2М NaCI. Фильтр гибридизируют приблизительно до 5 х 10 отсчетов в минуту с

6 этим зондом в течение 12 ч при 68 С, про-мывают в 2 х-SSC при 68 С.

Пример 3. Зонд, идентичный описанному в примере 2, получают и используют для скрининга библиотеки кДНК печени эмбриона, полученной в векторе A --Ch21A, используя стандартные методики скрининга бляшек. Три самостоятельных положительных клона — обозначены здесь

А-HEPOF L6 (1350 пар оснований), HEPOF 1 8 (700 п.о.) и А-HEPOF L13 (1400 п,о.) выделяют вслед за скринингом 1 х

10 бляшек. Полную вставку 1 -HEPOF

L13 и А -HEPOF L6 секвенируются вслед за субклонированием в М13 (табл. 7 и 5 соответственно). Только часть вставки

-HEPOF L8 секвенируют. Остальные фрагменты считают идентичными двум другим клонам (табл.7). 5 — и 3 нетранслируемые последовательности представлены строчными буквами. Кодирующая область представлена прописными буквами, 1801118

10

20 плазмида содержит кДНК-ген дигидрофолятредуктазы мыши (DFHP), который находится под контролем позднего промотора 25 аденовируса 2 (Аб2), 5-часть аденовирусной

ДНК и 3-часть гена иммуноглобулина, межВ отношении табл.2 и 3 следует упомянуть, что определенная аминокислотная последовательность, показанная ниже нуклеотидной последовательности, пронумерована начиная с цифры 1 для первой аминокислоты созревшего белка, Остатки цистеи на в созревшем белке дополнительно указаны SH, и потенциальные N-сайты гликолизирования обозначены звездочкой. кДН К-клоны Л -Н Е POF L6, ЛHEPOF L8 и Л -HEPOF L13 задепонированы в AmericanType Culture Collektion, Pockville, Maryland под номерами АТСС

40156, АТСС 40152 и АТСС 40153 соответственно.

Пример 4, Геномные клоны Л -НЕР01, Л -НЕРО2, Л -НЕРОЗ и Л -НЕРО6 депонированы в AmericanType Culture

Collection, Рос1чШе. Maryland под номерами ATCC 40154, АТСС 40155, ATCC 40150 и

АТСС 40151 соответственно, Используют вектор pALD26 SA рА(3), эта ду поздним промотором аденовируса 2 и

DFHP-кодирующей последовательностью, pALD26 рА(3) превращают в плазмиду

pCVSVL12. pALD26VS рА(3) превращают в плазмиду pALD26-SVpA(3) (L) делецией одного из двух сайтов Pst 1 в плазмиде pALD26

SVpA (3) путем частичного переваривания

Pst 1 и получают субпопуляцию плазмид, в которой только один сайт Pst 1 расщеплен, затем осуществляют обработку и лигирование ферментом Кленова.

Плазмиду pALD26SVpA (3) (L) расщепляют Pvu 11. Плазмиду plAW43 переваривают

Xhol, обрабатывают фрагментом Кленова, переваривают Pvu 11 и выделяют электрофорезом в акриламидном геле фрагмент размером 140 п.о. Фрагмент 140 п,о, лигируют с плазмидой pALD26SV рА (3), обработанной с рестриктазой Pvull. Продукт лигирования используют для трансформации Е.coli, колонии подвергают скринингу с помощью зонда, меченого Р, комплементарного к фрагменту из 140 п,о. ДНК получают из положительно гибридизирующихся колоний, Фрагмент Ava11D вируса SV40, содержащего последовательность энхансера

SV40, получают путем обработки ДНК SV40 фермен ом Ava11, фрагментом Кленова Po(1 с последующей лигацией Xho 1-линкеров, Xhol-фрагментом и выделением фрагмента электрофорезом в геле. Этот фрагмент за30

55 тем лигируют обработанной рестриктазой

Xhol плазмидой pTPL и получают плазмиду

pCYSYL 2-TPL. Ориентация фрагмента

DSY40 в pCYSYL 2-TPL такова, что поздний и ромотор вируса SV40 находится в такой же ориентации, что и основной поздний промотор аденовируса, Для интродуцирования генов VA в

pCYSYL 2-TPL вначале конструируют плазмиду pBR322, которая содержит в Hindlllсайте фрагмент В аденовируса типа 2, ДНК аденовируса типа 2 переваривают Hindlll u фрагмент В выделяют электрофорезом в геле, Этот фрагмент встраивают в плазмиду

pBR322, которая предварительно была обработана Hindlll. После трансформации

Е.coli отбирают рекомбинанты и ориентировку встроенных фрагментов определяют путем обработки рестриктазами. pBR322—

AL Hindlll В содержит фрагмент В Hindi!I аденовируса типа 2. Плазмиду pBR322 — AL

Hindlll В обрабатывают Нра I, добавляют линкеры EcoRI и гидролизуют EcoRI. Фрагмент. имеющий липкие концы EcoRI, встраивают в EcoRI-сайт плазмиду PTL, гидролизованной EcoRI. После трансформации штамма Е,coli НВ101 отбирают колонии, устойчивые к тетрациклину, далее на фильтрах колонии подвергают скринингу посредством гибридизации. ДНК получают из положительно гибридизирующих клонов и гидролизуют рестриктазами. Полученную плазмиду обозначают р91023. Плазмиду р91023 гидролизуют рестрактазой EcoRI u получают два фрагмента, один около 7 кВ и другой около 1,3 кВ. Последний фрагмент содержит гены VA. Концы обоих фрагментов заполняют с использованием фрагмента

Кленова Pofl и два фрагмента затем лигируют один к другому. Плазмиду p91023/А/, содержащую гены VA, являющуюся аналогичной плазмиде р91023, однако потерявшую два сайта EcoRI. идентифицируют посредством скрининга фрагментом гена

VA.

Один Pst I-сайт в плазмиде p91023/А/ заменяют на EcoRI-сайт. р91023/A/ гидролизуют рестриктазой Pst I и обрабатывают фрагментом Кленова Poll для восстановления концов. EcoRI-линкеры лигируют с тупым сайтом Pstl плазмиды р91043/А/, Линейную плазмиду p91023/А/ с EcoRIлинкерами. присоединенными к тупым сайтам Pstl. отделяют от несшившихся линкеров и гидролизуют Есор! рестриктазами, после чего повторно лигируют. Идентифицируют плазмиду р91023/В/. которая аналогична p91023/A/, но вместо прежнего сайта Pstl в ней содержится сайт EcoRI.

Плазмида р91023/В/ депонирована и до1801118

55 ступна из American Type Culture Collection, под номером АТСС 39754.

Пример 5. кДНК-клоны (А-EPOF L6 и il -EPOF L13) встраивают в плазмиду

p91023/B/, получают плазмиды pPTF L6 и

pFTF L13, 8 мгк каждой из очищенных ДНК затем используют для трансфекции 5 х 10 клеток COS, используя DEAE-декстран-метод (ниже). Через 12 ч клетки промывают и обрабатывают Хлорохином (0,1 мМ) в течение 2 ч, промывают вновь и выдерживают в течение 24 ч в 10 мл средах, содержащих

10%-ную эмбриональную телячью сыворотку. Среду заменяют на 4 мл среды, свободной от сыворотки, и собирают через 48 ч, Иммунологически активный ЭПО определяют количественно радиоиммунным анализом, Йодированный изотопный индикатор получают из гомогенного Э ПО, Чувствительность пробы составляет приблизительно 1 нгlмл. Результаты приведены ниже в табл.8.

Пример 6. кД Н К Э П О (А -H E FO L13) вставляют в плазмиду р91023/В/, трансфекцируют в клетки COS-1 и собирают, как описано выше. Однако хлорохинную обработку опускают, Биологическую активность ЭПО in vitro измеряют с использованием либо колониеобразующей пробы с клетками фетальной печени мыши в качестве источника CFV-Е, либо пробы поглощения с Н-тимидином, используя клетки селезенки от мышей, инъ екцированных фенилгидразином, Чувствительность этих анализов составляет приблизительно 25 мединиц/мл, Кроме того, биологическую активность ЭПО in vivo измеряют с использованием либо метода гипоксической мыши, либо метода голодающей крысы. Чувствительность этих анализов составляет приблизительно 100 единиц/мл. Никакой активности не обнаружено ни в одной из этих опытов с имитированной средой. Данные об активности ЭПО, экспрессированного клоном EPOF L13, показаны в табл.9, где приведенные активности выражены в единицах/мл, с использованием торгового ЭПО (Toyobo, Inc.) в качестве стандарта.

Пример 7. Гель-анализ полиакриламида SDS ЭПО из клеток COS, 180 нг ЭПО, выделенный из среды клеток COS, трансфекцированных кДНК ЭПО (А-HEPOF L13) в векторе 91023(В), подвергают электрофорезу íà 10%-ом полиакриламидном геле. НПО обнаруживают с антителом анти ЭПО и белком А 1-стаф, Фильтр авторадиографируют в течение двух дней, Гомогенный ЭПО подвергают электрофорезу перед или после йодирования, Ис5

45 пользуемые маркеры включают метионин, меченый S, сывороточный альбумин (68

000 д) и яичный альбумин (45 000 д).

Пример 8. Фрагмент BamHI-Pvull из плазмиды Psv 2DHFR, содержащий ранний промотор SV40, смежный с геном дигидрофолятредуктазы мыши (D HFR), энхансер

SV40, малый интрон с и последовательность полиаденилирования SV40 выделяют (фрагмент А). Оставшиеся фрагменты получают из вектора р91023/А/ (выше) следующим образом, p91023/А/ гидролизуют Pst I в единственном сайте Pst I около промотора аденовируса для линеаризации плазмиды, и либо лигируют с синтетическими линкерами

Pst I-EcoRI и обрабатывают с помощью ДНК лигазы или обрабатывают большим фрагментом ДНК-полимеразы 1 для разрушения сайтов Pst I и сшивают с синтетическим

EcoRI-линкером и замыкают плазмиду. Каждую из двух полученных плазмид 91023/B/ и 91023/В/, обрабатывают Xba u EcoRI для получения двух фрагментов (F и G). Путем соединения фрагмента G из плазмиды р91023/В/ и фрагмента F из плазмиды р91023/В/, а также фрагмента G из плазмиды р91023/В/ и фрагмента F из плазмиды р91023/В/ создают две новые плазмиды, которые содержат либо сайт EcoRI-Pstl, либо сайт Pstl-EcoRI.

Вектор р91023/С/ гидролизуют и полученную с липкими концами затупляют путем заполнения концов с фрагментом Е.coli

ДНК-полимеразы 1. К этой ДНК лигируют с фрагментом Hindlll-EcoRI размером 340 п.о., содержащим энхансер SV40, полученный следующим образом:

Фрагмент Hindlli-Pvull из вируса SV40, который содержит основу SV40, а также энхансер вставляют в плазмиду с lac пролгором, Вектор c lac получают гидролизом ДНК с BamHI эндонуклеазой, заполнением липкого конца с помощью фрагмента ДНК-полимеразы 1 и обработкой ДНК Hindlll, B полученной плазмиде восстанавливают

BamHi-сайт путем лигирования с Pvu u II линкером. Фрагмент EcoRI-Hindlll получают из SV HP lac и сшивают с фрагментом

EcoRI-Hindlll Psv Od, который содержит плазмидную основу репликации. и отбирают полученную плазмиду PsvHPOd. Затем получают фрагмент EcoRI-Hindi ll размером

340 п.о. плазмиды PsvHPOd. содержащий

ЯЧ40/энхансер, затупляют с обоих концов при помощи большого фрагмента Кленова

ДНК-полимеразы и сшивают с вектором р91023/С/, гидролизованным

Xhol/р91023/С//Xho/ и EcoRI/Hindlli SV40 энхансер/, в которой ориентация фрагмента Hindlll-EcoRI такова. что BamHI-сайт

13

1801118

50

55 внутри фрагмента является близлежащим к гену VA, называют pES105. Плазмиду

PES105 обрабатывают BamHI и Pvull, а также Pvull, и выделяют фрагмент BamHIPvull, содержащий основной поздний промотор аденовируса (фрагмент В), и фрагмент Pvull с геном устойчивости к тетрациклину, а также другие последовательности (фрагмент С), Фрагменты А, В и С лигируют и полученную плазмиду выделяют и обозначают RKI-4, Плазмида RKI-4 депонирована

American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, где под номером АТСС 39940, Пример 9. ДНК (20 мкг) из плазмиды

pPTF L13, гидролизуют рестрикционной эндонуклеазой Cia I и лигируют с обработанной C(a I ДН К из плазм иды pALD265S Vp/А/

1 /2 мкг/, которая содержит интактный гендигидрофолятредуктазы (DHF R), под контролем основного позднего промотора аденовируса, Эту ДНК используют для трансфекции DHFR-CHO и после двухдневного выращивания клетки, которые содержат по крайней мере один ген DHF R, отбирают в альфа-средах, не имеющих нуклеотиды, и пополняют 10 / -ой диализированной фетальной эмбриональной бычьей сывороткой. Извлекают колонии из первоначальных чашек, объединяют по группам из 10 — 100 колоний на пул, повторно высевают и выращивают до слияния в альфа-средах, не имеющих нуклеотиды.

Отстоявшиеся среды из этих пулов проверяют на ЭПО посредством радиоиммуноанал и за (R IA)..Пул ы, кото р ые эксп рессируют

ЭПО выращивают в присутствии метатрексата (0,02 мкМ) и затем субклонируют и анализируют повторно. Cta 4 4,04-7 экспрессируют 460 мгlмл ЭПО. Он депонирован в American Type Culture Collection под номером ATCC CPI 8695. Этот клон подвергают поэтапному отбору при возрастающих концентрациях MTX.

Ступенчатую селекцию с метотрексатом (MTX) достигают повторными циклами культивирования клеток в присутствии возрастающих концентраций метотраксата и селекции для выживших микроорганизмов.

При каждом цикле ЭПО наличие ЭПО определяют в надосадочном слое культуры посредством RIA и определяют биологическую активность in vitro. Уровень используемого метотрексата в каждой ступенчатой амплификации составляет 0,04. 0,1 и 0,5 мкМ. Как показано в табл, 10, после первого цикла селекции при 0,02 мкМ MTX в культуральные среды высвобождаются значительные уровни ЭПО.

Пример 10. ДНК из клона А -HEPOF

L13 гидролизуют EcoRI и малый фрагмент

RI, содержащий ген ЭПО, субклонируют в

EcoRI-сайт плазмиды RKI-4. Эту ДНК (RKF

L13) затем используют для трансфекции

DHF R-отрицательных клеток СНО, а селекцию и амплификацию осуществляют, как описано в примере 9 выше.

ДНК RKF L13 также трансформируют в клетки СНО путем слияния протопластов и микроинъекции. Плазмида PKF L13 депонирована в American Type Culture Collection

Rockville, Maryland под номером АТСС

39989.

Предпочтительный клон депонирован в

American Type CuIture Collection Rockviile, Maryland под номером ATCC СРГ 8695.

Пример 11. ДНК из pSVOD обрабатывают эндонуклеазой Hindlll и затупляют с помощью большого фрагмента ДНК-полимеразы 1. Клон ЭПО из фага il.-HEPO3, гидролизуют EcoRI u Hindlll. выделяют фрагмент, размером 4,0 кВ, содержащий ген ЭПО, делают тупыми концы. Фрагмент гена ЭПО вставляют в плазмидный фрагмент psVOd. Плазмида CZ 2-1 имеет ген

ЭПО в ориентации "а" (т.е. с 5 — концом ЭПО, который ближе к SV40) и плазмида CZ1 — 3 находится в противоположной ориентации (ориентация "b").

Плазмиды CZ1-3 и CZ2-1 трансфекцируют в клетки COS-1, и среды собирают и анализируют на иммунологически реактивный

Э ПО.

Пример 12, Плазмиду, содержащую кДНК-последовательность ЭПО под контролем металлотеонинового и ромотора MblujMM связанную с полной ДНК вируса бычьей папилломы, получают следующим образом,pEP049f

Эту плазмиду гидролизуют EcoRI, u фрагмент EcoRI длиной 1340 п.о. из А -HEPOF L13 встраивают в нее с помощью ДНКлигазы. Полученную плазмиду. в которой 5

-конец гена ЭПО является ближайшим к промотору SP6, обозначают pEP049F. В этой ориентации сайт BamHI в полилинкере

PS Р6/5 непосредственно примыкает к 5

-концу гена ЭПО.

Плазмиду рММТпео ВPV обрабатывают

BamHI. Получают два фрагмента — большой фрагмент размером - 8 кб, содержащий геном ВРУ, и меньший фрагмент размером

6,5 кб. содержащий начало репликации и ген устойчивости к ампициллину, металлотеиониновый промотор, ген устойчивости и неомицину и сигнала полиаденилирования

SV40 из плазмиды рН 42 ДН К обрабатывают

ДНК-лигазой, и плазмиды. которые содер15

1801118

16 жат фрагмент размером 6,8 кб. Одну такую плазмиду обозначают pMMTheo ВРУ. рЕРО15а

pMMTheoBPY гидролизуют Bgfll. pEP049f обрабатывают BamHI и В901, и выделяют фрагмент размером 700 п.о„ содержащий целую область, кодирующую

ЭПО. Плазмиду pMMTheo BP гидролизуют рестриктазой В901 и выделяют фрагмент

BamHI/Bgfll ЭПО размером 700 п.о., лигируют и полученные плазмиды, содержащие кДНК ЭПО, идентифицируют гибридизацией при помощи олигонуклеотидного

d (GGTCATCTGTCCCCTGTCC) зонда. Отбирают плазмиду рЕР015а, которая содержит кДНК ЭПО, при этом 5 -конец кДНК ЭПО является близлежащим к металлотеоиновому промотору. рВРУ-ЭПО

Плазмиду рЕР015А гидролизуют BamHI для линеаризации плазмиды. Плазмиду рбВРУ-MMTheo (342-12) обрабатывают эндонуклеазой BamHI, получают два фрагмента размером 6,5 и 8 кб. Первый фрагмент содержит целый геном вируса бычьей папилломы, рЕРО15а/BamHI и фрагмент

BamHI размером 8 кб лигируют друг с другом, и плазмиду (рВРУ-ЭПО), содержащую фрагмент ВПУ, идентифицируют гибридизацией с использованием олигонуклеотидного зонда d(P-CCACACCCGGTACACA-OH).

Гидролиз ДНК плазмиды.рВРУ-ЭПО эндонуклеазой подтверждает. что Hindlll транс крипции генома BPY является таким же, как и направление транскрипции металлотеонинового промотора (как в pdBPY-MMTneo

1342/12. Плазмида pdВРУ-MMTneo/34212/ в American Type Culture Collection

Rockville, Marg land под номером АТСС

37224.

Пример 13, Получают ДН К плазмиду рВРУ-ЭПО и приблизительно 25 мкг используют для трансфекции 1х10 клеток С127, СНО. Через 5 ч после трансфекции трансфекционные среды удаляют, клетки обрабатывают глицерином, промывают и прибавляют свежую а-среду, содержащую

10 /-ную сыворотку плода коровы, Через 48 ч клетки трипсинизируют и расщепляют в отношении 1:10 в DME среде, содержащей

500 мкг/мл G418,,и клетки выращивают в течение двух-трех недель. G418 — устойчивые колонии выделяют индивидуально в микротитровальную лунку и выращивают до сублизирования в присутствии 6418. Клетки затем промывают, прибавляют свежие среды, содержащие 10 /-ную сыворотку плода коровы, и среды собирают через 24 ч.

Клетки С127 и 3Т3 трансфецируют 25 мкг рВРУ-ЭПО и 2 мкг pSV2neo, Клетки С127 трансфецируют 30 мкг рВРУ-ЭПО. Вслед за трансфекцией, свежие среды меняют каждые три дня. Приблизительно через 2 недели собирают BPY транс5 формирование клетки в микротитровальные лунки, выращивают и анализируют на активность ЭПО.

Пример 14, Плазмидный вектор plVEY депонирован в American Type Culture

10 Collection, Rockville, Maruland под номером

АТСС 3991. Вектор модифицируют следующим образом:

plYEYN 1 рlУЕУ обрабатывают EcoRI для линеа15 ризации плазмиды, затупляют с использованием большего фрагмента

ДНК-полимеразы I. и лигируют одиночным линкером Not I

20 GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGC

Полученную плазмиду обозначают

plYKYN I, 25 plYEY гидролизуют Smal для линеаризации плазмиды, и сшивают с линкером

GGGCCCCAGGGGCCC

CCCGGGGTCCCCGGG

Полученную плазмиду обозначают plYEYSI.

plYYEYSfBg КрПлазмиду plYEYSI гидролизуют Kpnl для линеаризации плазмиды, и фрагменты размером от 0 до 100 п.о. отщеп35 ляют от каждого конца путем обработки эндонуклеазой Baf31. Полученные концызатупляют с использованием большого фрагмента ДНК-полимеразы 1 и сшивают полилинкером.

40 ХИоТ ХЬоТ

Г 1 I 1

1 I I

И 1П ЕcoIRI I сРаТ RPnI !

AGATCTCGAGAATTCTAGATCGATGGTACC

TCTAGAG CTCTTAACATCTAGCTACCATGG

Полилинкер встраивают в.обеих ориентациях, Плазмиду, в которой полилинкер ориен50 тирован таким образом, что сайт Bgfll внутри полилинкера является близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют plYEYS IBgKp, Плазмиду, в которой сайт Крп 1 внутри полилинкера является

55 близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют plYEYSIKpBg.

pl УЕ /Sl BgKp депонирована в American

Туре Culture Collection, Rockville, Maryland. под номером АТСС 39988.

p l E YS I B g Kp NL

17

1801118

5

40

55

plYEY NI переваривают эндонуклеазами Kpnl u Pstl. Получают больший фрагмент, который содержит начало репликации и 3

-конец полиэдрального гена, plYEYSIBgKp гидролизуют эндонуклеазами Pstl и Крп для получения двух фрагментов, Причем меньший фрагмент содержит полиэдральный промотор и полилинкер (фрагмент В). Фрагменты А и В объединяют ДНК-лигазой и получают плаэмиду plYEYSI BgKp NI. р!УЕ PO р! УЕУ Sl BG Kp Nl гидролизуют рестриктазой EcoRI для линеаризации плазмиды, и вс авляют фрагмент EcoRI размером 1340 п.о. иэ А-HEPOF 1 13. Плазмиды, содержащие 5-конец гена ЭПО в непосредственной близости к полиэдральному промотору и 3

-концу полиэдрального гена, идентифицируют путем переваривания Bgtll. Одну из этих плазмид в ориентации, описанной выше, обозначают как plYEPO.

Экспрессия ЭПО в клетках насекомых

Плазмидную ДНК выделяют из Е.coli ! М101-1фи подвергают дальнейшей очистке

CSCI-центрифугированием. ДНК щтамма L1 вируса полиэдроза Autographa californica дикого типа (AcN PY) получают фенольной экстракцией вирусных частиц и последующей очисткой вирусной ДНК.

Эти две ДНК контрасфецируют в клетки

IPI В-SF-21 Spodoptего frugiperda, используя методикутрансфекции с фосфатом кальция. Для каждой чашки контрасфецируемых клеток используют ДН К AcNPY дикого типа и 10 мкг pIVEPO, Чашки инкубируют при

27 С в течение 5 дней. Затем собирают надосадочную жидкость, экспрессию ЭПО в надосадочном слое подтверждают радиоиммунным анализом и биологической пробой in vitro.

Пример 15. Среды клеток COS (121) с концентрациями ЭПО до 200 мкг/л концентрируют до 600 мл с использованием ультрафильтрационных мембран с молекулярным весом 10000. Концентрированные и диафильтрованные кондиционированные среды содержит 2,5 мг ЭПО в 380 мг общего белка, Раствор ЭПО дополнительно концентрируют до 186 мл, и осажденные белки извлекают центрифугированием при 110000g в течение ЗО мин.

Надосадочный слой, который содержит

ЭПО (2 мг), доводят до рН 5,5 50%-ой уксусной кислотой, перемешивают при 4 С в течение ЗО мин, осадок извлекают центрифугированием при 13000g в течение 30 мин, Хроматография на карбонилметильной сефа розе.

Отстоявшийся слой, содержащий 200 мкг (24 мг общего белка). помещают колонку, с СМ-Сефарозой (20 мл), уравновешенную в 10 мМ ацетатом натрия, рН 5,5, промывают 40 мл того же буферного раствора. ЭПО, связанный с СМ-Сефарозой, элюируют 100 мл градиента Nav (Π— 1) в 10 MM растворе фосфата натрия, рН 5,5. Фракции, содержащие ЭПО (общее количество 50 мкг в 2 мг общих белков), объединяют по группам и концентрируют до 2 мл с использованием ультрафильтрационной мембраны.

ВЭЖХ с обращенной фазой, Концентрированные фракции, содержащие ЭПО, подвергают дальнейшей очистке

ВЭЖХ с обращенной фазой, используя ко- . лонку Vydac С-4. ЭПО подают на колонку, уравновешенную в 10%-ом растворителе В (Растворитель А представляет собой 0,1%

СРзСО2Н в воде; растворитель В представляет собой 0.1% CFsCOzH в CFsCI 1), с низкой степенью подачи 1 мл/мин. Колонку промывают 10% в в течение 10 мин и ЭПО элюируют линейным градиентом В (10 — 70% в течение 60 мин), Фракции. содержащие

ЭПО, объединяют по группам (-40 мкг ЭПО в 120 мкг общих белков) и лиофилизируют.

Лиофилизованный ЭПО повторно структурируют в 0,1М растворе Tris-HCI при рН 7,5, содержащем 0,15М NaCI, и повторно хроматографируют ВЭЖХ с обращенной фазой.

Фракции. содержащие ЭПО. объединяют по группам и анализируют электрофорезом в

SDS-полиакриламидном (10%) геле. Объединенные фракции ЭПО содержат 15,5 мкг

ЭПО в 25 мкг общего протеина.

Формула изобретения

1.Способ получения человеческого эритропоэтина, предусматривающий культивирование штаммов эукариатических клеток, выделение и очистку целевого продукта путем концентрирования. осаждения, центрифугирования и афинной хроматографии, отличающийся тем. что, с целью повышения активности эритропоэтина. предварительно конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК. обеспечивающие синтез эритропоэтина, путем клонирования фрагмента ДН К. кодирующего эритропоэтин

1801118

-27

Ие4 СИ 1А1 HIS CLU СГБ

Q QQ C7С САС C AA

РИС

ССТ

g8tcacccgg egegccecog gtcgctgagg gaccccggcc aggc8cggag

ТЛР LEU TRP LEU LELU 1,$0 SEII LEU 1.$0 SEE LEU РЕО ЬЕЦ GLY LEU PEO VAL ЬЕО CLY

GCC TCC CTC TCQ CTT CTC СТО ТСС СТО СТО Тсс Сбс СОТ СТО ССС СТС ССЛ

20 заец Clu Лlа L s

5И

Р """ Ll CAâr Р

ССА ССЛ ССС СТС АТС TCT САС ЛСС

Лг" Ча1 ахеи

Clu Лгс х т Lcu

Тлс Chc ССС ААС

CCC

CCA GTC CTG СЛС AGC ТАС СТС

* 5И

Л! 1 Clu hgll II e у 1 ц Сл р C. а

ССС САС АЛТ ЛТС ACC ЛСС СС„= -CT

Leu Лап Сlц Лап 11с Thr

TTG hAT САС At Т АТС ЛСТ

30 $И

Ala Giu И!а Суа

ССТ GAA СЛС ТСС

cIu

$ал

hGC

ChC

017 С1п Cln Ala

CCG CAG САС CCC )

GIAy CIn А!а Lou

hIn 7m

I1e t

Ллс

vA1 yrv лрр vl Lyv ц„ц л, Р;ц т . GTC CCA GhC ЛСС AAA СТТ ЛЛТ ТТ

C1u VaI

СЛС, СТС

1 е .hrg

AAG ACG

ССС TCG

ТгР 01п Cly Leu Лlа Leu Leu 5ег Ciu Лlа Чаl

GTA ChA СТС TCC CAC ccc сТС ссс сто с70 сс слл QQT CTc с

Leu *с-8

CTG ССС

GCC CAG ССС CTG!

0О

1 ° s Ala Val Ser

AhA ССС СТС ЛОТ

Ц.! Л ЛЛ Л т Ц1„Рт„т, 90

Leu

ГЕ .Е1 С ац

TTG CTC ЛАС ТСл цСС СЛС ССС ТСС СЛС ССС С С С10 С С СЛ С С СЛТ

110 тл 1.1 Лтц Л Л.!

CIu Лле Пе Ser

СЛА CCC ЛТС ТСС-!

7hr Pbe Ar 17а

Cly Leu hrg Sor Lou п,г

ССС CTT CCC ACC CTC АСС

his Lc u Cly Ala

ССТ СТО CQA ССС

Сlп Lys

СЛС AAG

Л1: hs

ЛСТ Слс СТТ CCC

130

hi a A ILL Pro cec

Pro Pro Аа Лlе his Sor

А —. Thr Iic .hr

ССТ ССЛ СЛТ ССС ССС ТОЛ ССТ ССТ, ССЛ СТС ССЛ АСЛ АТС ЛСТ ССТ

САС ЛСТ ТТС ССС ААА

Cly Lyr 1лц Läл. L

CGG GGA AAG СТС ЛЛС СТО

160

7ег 7hr Cl Clu h a ллц Рлл A д V l y r " Л Ðh

ТЛС ACA CGG GAG CCC

CTC ТТС ССЛ СТС TAC ТСС ЛЛТ TTC СТС

5И 166

ЦР 1 р yhr Cly Л р Лрr

TCC ЛСС ЛСА GCC СЛС АСА

tgtccacctg

ТСЛ ccsggtg

cgccactcct

ggcatatcca

ccacctccct esccaacstc

gsaccccgtc gaggggccct

cagctcageg ccsgcctgtc

caccctcccc

cccagtgcca

agaggaactg

ctcaggggcc

gcsatgacat

cccagagagc aactctgagа

gagogcaget ctaaaeteag

cccaga8са8

tcacsgggec aacttgnggg

gaagcattca

accctgeaaa

acccgatgcc aggscsegcc.atgctgggsa gscgcctgag

cccactcggc

tttacetgtc с8ьа8аассс aggtggcasg

geecectcgs ° caeeggggtg

ccasgtcctg tgtacccctc

eeatcaggga

ctegcaeeta

csggatgacc

gcaccccccc ggtggcaaga

teeaggtccc

scgggeatgg

gcctctggcc cccacggggt

tgaagacagg stgggggccg аааааааааааа ааассассаа

acasgsactg в вектор р91023, или pALD 265 SVp, или

RR1-4, или pd В РУ-М МТпео, или рИЕУЯВОКрй1, трансформацию полученными ДНК штаммов клеток млекопитающих и насекомых, после афинной хроматографии проводят обращенно фазовую хромаl ссс 88аса, ecgccerctc сс е

gcttgtgcca

ccatggacac

tctaaggatg

ggacagagcc

ttggaggcga

ctgtgaettc

gtgggaacea

ascctcactg тографию и элюцию 10-70% градиентом

0,1% CF3C02H в СЕзС.

2. Способ по п.1, отличающийся

5 тем, что фрагмент ДНК, кодирующий эритропоэтин клонируют в вектор р91023, а трансформации подвергают клетки cos 1.

ccctgcaccg ccgagcctcc с888асва888 cccccggtgt

1801118

22, СЦССЦДс са аЦССсасРСССаСаагсссаДсС ааа Дссса аСgggagaattgcttgagccctgg

agtCtcagaccaacctaggcagcatagtgagatcccccatctctacaаacatttaaaaaaattagtcaggtpaag 1950

tggtgcaCgptggtagtcccagatacttggaaggctgaggcgggaggatcgcttgagcccaggaatttgaggctg

caDtgagctgtgctcacaccactgcactccagcc tea„"tgacagagt a gccctgtcccaaaaaagaaaagàaa .2100 ааagaaaaocaatgagggсtgсatgpaataсgttсattattса«сасссасссас сactсасссattcattca, ttcattcaacaagtcttattgcataccttctgtttgctcagctCggtgсttggggctgctgaggpgcaggaggga 2250

gagggtgacatcccCcaдctgactcccagaglccactccctgtagGTCCCGChGCACGCCC7hGAAC7C7GCCAG

ЧаIGIyGlnGInhiaVa1C«цЧзl?rpGln

PCCC7CCCCCTCCTCTCGGAAGCTG7CC7CCGGGGCCAGGCCC7«G77CG7ChAC7CT7CCCAGCCGTCGGACCCC 2400

С1уЬецЛ1аЬецЬецЯегС1цЛ1аЧа1ЬецЛг С1уС1пЛ1аЬецЬеuVaiAanSerSerGlnPro?rpGIuPro

СТССЛССТССЛТСТССЛТЛАЛССССТСЛСТССССТТССС/ CCC?CAССЛСТСТСС77СССССТ«Г«СССЛССССАС

LeuGlnLeuIl1sVaIAspLysAIaVaISerG1yLeuhrgSeгLeu7hr7hrLeuLeuhrgAiaLeuGIyAlaGIa

gtgagtapgagcggacacttctgcttgcccttcctgcaagaaggggagaappgtcctgctaaggagtacaggaac 2550

tgtccgtattccttccctttctgtggcactgcagcgacctcctgtttСcCccttggcagAACCAACCCATCTCCC C7CChGATGCGGCCi

GCCiChCCTGCTCCACTCCGAhChhTChC7GC7«СЛСЛС«« iССССЛЛЛС7С««СССЛC7C7AC7 2700

roProAs hIahlaSerAIaI 1 Р L - -: 7 т A „, ц ecirg ai yr гЛ" ahlaProLeuhrg«nr?lе« аг. 1аЫр «гРЬеЛг„"LysLeuPhehrgVai?yrЯ

CCAA«iiCCTCCCGGGAhhGC7GAACCTG7AChCACGGGAGCCC7GCAGGh CAССССЛСЛСЛ«СЛССЛССТСТСТ

erAsnPheLeuhrpGiyLysLeuLysLeu Tyr7hrCiyGluAIaCysЛги?!пС1уАврЛг 3 CChCC?GCGCATATCCACChCCTCCCTChCCAhCATTGC««G7CCCAСЛССС7ССССССССЛС7СС7СЛЛССССС 2850

TCCACGGCCTC7CAGCTCAGCGCCAGCCTGTCCCATGGACAC7CCЛС7СССЛССЛЛ7СЛСЛ7С7СЛСС СССАСА

GvAACTGTCChGhGAGChhCTCTGAGhTCThhGGhTG7«CACAGGGCCJu АСЛССЛССЛЛССЛ«« 3000

СЛСЛСЛССЛССТ?« «ACTCAGGGACAGACCCA?GC?GGGA СЛСССС?СЛСС?СЛСТССССЛСССТССААААТТ

ТСАТСССЛССЛСЛСССТТТССЛССССЛТТ«ЛССТС«?ТТСССЛССТЛССЛТСЛСССЛСЛССЛТСЛССТССЛСАЛС 3150

В

ТТЛ GTGGCAAGCTGT«CAC?ÒCTCCÀGCTCTCACGGGCÀ?GCGCACTCCC?7GG7GGCAAGAGCCCCCi«СЛСАС

СССССТССТ«СССЛЛССАТСЛАСЛСЛССАТССССССТССССТСТСССТГ«САТССССТССЛЛС?ТТТСТСТА?ТСТ 3300

TChACCiCATTCACAAGhACTGAAACCÀCCaaCàсдасСсссддссссСсС СсССсСдщаассСссаааСссс

ctggctctgtcccactcctggcagca

3400

55

ccccgggctgtgtgcattссадЛССССС7С7СС7СЛЛСЛС7ССЛСС««СЛЛ7СЛСЛЛ7Л7СЛСТ«С7СССЛСЛСЛС 1650

7hrGIyCysAIaGiuii1sCysSeгLe«uhnGiuAsn7ie7hrVaiProAspTh

CAAAGiiAAiiiCTATCCCTCCAAGAGGh7GCACgtgagttcctttttttttttttttcctttcttttpgagaat гЬувЧа«АьиР1 еТугЛ1а?грЬуиАг etClu

ctcatttgcgagcctgatttCggatgaaagggagaatgatcgаgpgaaaggtaaaatggagcagcagapatpagg IS00

1801118

23

24

Та бли ца1 а сси!патассе!1gcclccccpgg t61а!а а

ЛСТ GTC ССЛ GAC ЛСС ЛАЛ СТА ЛЛТ 77С TAT GCC TGG AAG

Thr Val Pro Asp 7hr Lys Val Лз!! Р;е Туа Ala Тгр Lys

AGG ATG ОЛС рдйсс1ИС1 tttttttttcctttcttttgiagaatctcatt асраассф

Ar ИЕТ Glu d а а1Шрра1gaààä; a aatgatc

Таблица 2

-27

ИТ GLY YAL HIS GLU CYS PRO

ALA TRP LEU TRP. LEU LEU LEU SEP. LEU LEU SER LEU PRO LEU GLY LEU PRO ЧА!. LEU GLY

1 !О 60

Ala Pro Pro Аг Lcu Ие С а Л" Scr Лг Vai Leu G1u Лг Т r Leu Leu Glu Ala Lys

60 50

Clu Аlа Glu Aen Ие Thr Тп Gl Cys Ala Giu his Cys Бег Leu. Лап Clu Лап Ilc Thr

6О

С1п Л!а

Asn Phc Т г Лlп Tro

Ьче Лгб lie! Giu Val Gly Gin

Ча! Pro Лар Thr Lys Ча!

01 C la

Л 1 а Ье и

Lcu А!а Ьеи Ьеи Sei

Vsl Clu Val Тгр

G1n G1y

Glu Ala Val Lau Лгр 100

Val 6er

Pro Tr Glu Рго Leu

Gin Lcu 1Па Val As L s Ala

Ьеи Че! Asn Ser Ser С1п

I-"О

Ие Sc!

1l0

Лгп Ala

Gly Leu Лгб Зег Leu Thr Thr Leu Leu

Leu С!у Ala Gln Lys С!и Л!а

Thr I1o Thr A!a As Thr Phc

16!

Лг Ьу

Lcu Аг

Pro Pro As Лlп Л1с Scr Ala Л!п Pro

150 т оа Л ph L A Cl Ly Ы а а т ha CI

GIu Лl

Яд 4а т сс

ЯИ 606

Лар Лге.

ACQ GGC TGT ОСТ GAA СЛС TGC AGC 77 G AA7 GAG AAT ATC

Thr Gly Cys Л1а Giu Н1з Суя Ser Leu Asn Ец Лвп Пе

1801118

u с3 3не

Н a 03Î

О -34 С о

v и

О 3

3«3 С3

«сп ь

34 ю-3

АЯ

ОО

v о

О о о

О о н а О ан

-с.3 а о

-1 и о о о ю с

М С.3

gv о о

О м о

Ел

« ° о

0D О оу со о ню о оЛ О, <3

3 С

>о э о и О о с н

О

«3 а (-3 о н

3« О а О

r4 С ао

С О и О

О 3л

« °

CVЬfA ! с и и

O fi а о

33е V ао

C4 O (-3 (л о

О и 04

04 U

04 U

04 а а

О О

3» С. ) а о са Е.а

v не

О о а Г-е

o v

33 С О

О н о с

3« с а м о о о о

««

° «

О о

v ь

° «

3« и а f-e ъ О

oн

3« сл са о о сп Е-е

С3 О

i= Н3

О

Е-л о с

3«

Р» м н ан

«> о ооо с

С3 м н о о с о

j-e о о о

ЕJ

« о о о

3 V .а о н.с н о ню

3 о

Cf, M o ш не до а.о а с и о

3 и со

° ( о с о о о о о а м

32Н

С3 Н« v м а о о

О.-3 С.1 а о

f (П

Щ

=т

CJ о

04 и

С4 и о а и а

b4 о о и и

04

tJ н и

04 и и

П3

04 и а и

U

34 а

0Ф

h4 и

Cl и

04 и

0D 04

Cl

U и

04

04

04 а

04 а

04

b4

04

CJ и и

04 а

04 и

0ф и и и и и

Щ

04 а и и

4J

CJ и и

V и

CJ

Cl

04

04

С33

U а

t4

04 и и

Cl и и

34

Щ h4 а и и

04

04

CJ и

U а

С4

04

00 а

04

CJ

04

Cl

b4 а и и 4

04

04

04

CJ и

333

CJ и

04

ЗлН ао о о о-»о йс есо

3è ,Ъ о

u3О

33О .а3 и е- с

1 о

О о

О с о

=) 28

1801118

7Е о щ и СсО

СС0 ф

Щ и и и о о

Щ) и о

v ф

Щ

Щ

ы сО

Щ о и и и

v ф 44 з v и и

U

U о

С3 н

Cl

° ( м

С и

<СЕ (Э

СО

СО

СО

СО

М и

Щ о

V ф о

v о

И о

CJ н

СЭ о

44 (ч

Щ ъ и

СО

М

Ctt

60 4.4 и CJ ф СсО о ео

ЬО СсО сО

b0

44 ф

С7

CJ о о

Ri и не и о

R с"эю щ с

Сй

I3

Х 4 х

СО с о Г в а р.

О 7

СЪ О

1,„2 о фи о с о

v o

f-4 СO и

44 ф о ф

t0 о о ф

Q и о

v и и о

Щ о и сО

CJ и ф

4l

Щ

ЬО с0

СО

U ф о о и.

h3 и

ЬО

С.О

Щ

U

ЬО

tC|

CJ и

ЬО

Щ

СО

Щ

Ц) v

СО о о

v ф ф

Щ и

Q и

Щ

v

Щ

CJ

CJ о и о и

Щ

v ф о о ссО

ы

СсО

ы

44 о

СО

00 и о

Щ

ЬО

00 Щ сО а

С3 о

tl

СО

Щ

Щ о

С4

Щ о

C O

ОО

Щ

fJ и о

Щ

v сО

СсО

Ct0

4.4 ф

U о

Щ о

44 ф и

СО

Щ

СО

С0

Щ

СО

Щ

СО

С5

Q о

b0

ы

Щ

СО

СО

Щ

tg

ы о и и

Щ и

Щ

CJ

Щ

Ct0

М

Щ и и

СС0 и

Щ

СО и и и

Щ

СО

ы

v о о ф

Щ

СО

Щ сО

СО о

Щ и

СО

v о сО

СД

СО

Щ о

Ct0

00 ф ф и сс0

ы

tt0

С3 и о и

Щ о

СО о и. и

43 и

00 и

CJ

CJ

С3 и и и

Щ

СО

СО

Щ 9

С0

СО

ы и

СО

4.4

ЬО

СО

Ct0 о

Щ

Q и

v о и ф

CJ сО

CJ и

U сО

Щ о

4J о о ф

° Ф

С.О

4 В

CJ и и

44 и ф и

00 и

CQ

ЬО и

v

00

00 и

CJ ф

Щ

Щ

CJ ф

Сс0 и и ф

Q и

CJ о

Щ

29

1801118

С) с/Ъ

Ю ь

Щ с ъ М ь

C)

Ю

С)

Ос

C)

Ю

4»Ъ ь

-Т ь

Ю О ь с/Ъ

° 4

О

v и

ЬО

С»

Ь)

СС и

О и о

О а

ЬО и

t0

ЬО

4.4 о

ЬО

v а

v и и

CO

td

tO и е (5 () и и сс

O td

u ta и

С0 с4 са и

td Ьо э о и

V 4

O Cc

Ьо СО о с»

U а о

v О и. 0

СО CJ ° а ьО

С4 и

U o и со

v u

v (0 и

О О

ЬО с.) °

ЬО сс»

° а о

ЬО

0 е н

Cj со о

Со (0 О °

v и

О и сд м о сО

0 а

v и ч и

О сс

СО

» °

С0 Оо

u u

О ЬО и

ЬО СО о со и сС

>. u

С4 v

ЬО О

ЬО о

О Со и,, а

v t0 со

t0 tO

v o и о с4 о

44

o o

СО v

v o

c0 о

О-ЬО (0 Ьо

И ЬО

И Со а

t0 V и а и

v u

0 ° и ЬО

О и о о

СО CJ

С0 и

О С4

Ьо ы

Cd

СО

СО ° и и и и» о и

Со и

td и

О СО

V „со .(J td о со и и о

СО с»

V C0

О CJ и и

° О со

О cd

И со

4J tO о о

t» О о и

СО и со ,U ° t0

t0 О

ЬО ° н

V СО

V 0

Cd и

cd u о с

v. o

СО O

ЬО O

o o

v o о

v с) О () cj u

ЬО Cg

v u и с, и

v u

СО (4

Cj () О (-С и а и а и и

U о

4J (И а

С» (р о а с) О

О И и с) (° и (.) v U

CJ о

О U

О о о и и ао и

О и и и

ы со со

CÎ

О и и

СО U и

О 4 а

О с3 С4

o o

o o

Ел С

o u (З и и с и с3 (» Ел о

o° - o

o u и с3 ь

o o с с и и о и и и

u„o (4 и

Ел (.ф и с) с) и

0 и (3 и, й

Ел и с д

С3 о

Ео ц

Е-4

O u

o .u и ° o о

o и и и о и 0 с о и о с и (-« ь

O U и и и (-С Е 4 (-) .o

Q (.) и и ц

u u

Я о и и с

uÄo

С и и

v и и о с4 и

4J а

U CO о со и и а ьо .o

С4

ЬО ° со

О о и о о

СО со

О CO

u u и

Со о о

V . 0

О 4

44

v с4

ЬО с3 о сО

Со И

СО и и

О

СО С4

Со

tO о

ЬО )

СО (J СО

С4 о ь

И Сс и

С-4 и

u = он о

С ) СО

:>» ЬО и

o o o с.с И О

Ел и U

Х ЬО

О

С .Со и а

o u и ы

o u и

Ь СО

O СО сй и о

td а со а

С, 1

С4

bO со

Г)

С0

СО

t0

4J

Q и и

C) а» со со со Со

Ьо и и

4 с»

С)

С4

Со

С» и и

Со и

Со и

Cg и и

ы о и

ЬО со о

t0

СО

СО

Со и

Со

СО

Со

СЗ

СО со

С»

С4

С4

СО со со

Г» а

СС

СО (J

Ьо сс

t0 а

h4

ЬО

4-С

ЬО

Cj (J

О

Со и

СО

4J

О

Ь) и

0 и и

Со

СО

b0

Ьо

ЬО

ЬО и и

С0 с.о

4 а

Ьо а

Cd

СО

Со

Со

Г4 с0

Со и

Со

tO .

СО

tO

С4

44

4.4

ЬО с0 и

Сф

CJ

td со, С0

Со

Со а (0

СО и

Со и о о

td

СО и

CD

ЬО

О о а и

О и

Ьо

tJ и и

О и с -)

С, td

С-) с4

Ьс

СО а

Я с0 о

О

Ьо и и и

Cj и

О а о. и

СО

Cj

ЬО

° 4

ы и

Со и

Со

ЬО

t0 и и

4 а и

td

С4

4-4

СО

CJ

Cj и а

С4

4-С и

С5

td а

Со

Cj

td

С4

td с0

С4 и и

aj

Со

СО

С0 и

СО с0

Ьо

ЬО и

4 и

С0 о

СО

t0

СО

С4

С4 и со

Со

СО с0

ЬО

О

О

СО а и

ЬО

С4 и и

Со а со с4

ы

t4

40 а

С4

Гф ьо

СО

О . u

СО

СО и

44 и

СО г а

Со и

44 (0 со

ы сф с4

С л

СО с4

С4

О а

С. )

Г0 с.о а и с)

ЬО

t0

Со г> и

С4 а

СО

О с»

t0

Со

40 а

С.)

) со о а

»л

tO

ЬО

СО и и

Со

С4 с5

v со

4J и

О со

44

t0 а

t4

4J

О и а

СО а о

СО

t0

Г»

С )

СО

t0 а» о

СО с4 (си и н ии

: . о с.о со

tJ (3 о о и о и (J с4 И и и и и

4.4 () со и Е-» о

t0 И (4.4 (.) и

v U и а u

И - (4 и

v u и

0 O

C) (4 о и о (л и

О

4J и

О с о и» и (» и и

О а

v

) () в и (-ю и Н и ( и

v и

° u и и

О O и а а с.о со с« а Ь и

cdo и о и

-с о и

О са Я

h Ьо U

Рб 4 ЬО

ЬО и н

Р4 ьо O

tJ O j4 U

40 4

СС(лб о e ttj а-4 (л t g Ct) (.) С j-с 4 (» (U ,0."4. и

-

С5 СЗ 4 оо а о

Сби -4

Рб () С U () g u

qr -4 Ч 4 () () О

:-.И сс и

>и а 4

О С>,4 Ьо

-1 оO,C) t0

4 (лс () О

= o

5 -4 (л д О

"o С0

0(CJ C0, (ъ 1 С0

>Oс 4 с

° (С И

CJ C) j Ьо

44 () -с td

С4Сн И

cnoo н д ч

Сб td иа 4

=> u ° -4 со

CJ сл с0 4 Ер..» o

Л< С)4

С4 ) 44

- о=о ju и (лссо а

go а.и ис сс а ,.)ИС О

Р- с-4 Cj СО

t.O C

Е» (-4 о и Q

< Е-с н

Ссл 0

Q o д и

j4 (» СС 4> (oa u

СЪ

Ю и

- Ю

С«3

СЪ

Ю

СС3

Cl л

С«4

b0

С0 и

U и

С0 ф М с0 с3

CO и

Са

Са ф

v и

О и

t0

СО ф

U юл и

О

О

С0 с3

С0

Cj

О

° с:5

С0

С5 с»

О, с:0 и н

55 с и

ttj

I»

Ф и

S т о с;3 о О

О с0 с

С:0

Сл и

tJ

С0

Ф ф ф с;3

С0

Ф ф и

С3

С3

U

V и, U и

С0

О с3 и

С3

С0

С3 и

С0

СФ ф

С0

Сл

С0 и

С0

Г3

С0

00 и

С0

С0

С0

СС3 и и и

С0

С0 с0

С0

CJ

О и

С5

U г3 и

О г3

С0

t3

С0 ф ° и

С0 ф . ф ф

О с0

ttj

СО, С0 ф ф

О

CO

С0 с3

° u

О

Cj ° ф с3.

С0

С0

СЗ с(O С5. C

О 3

О Рл

o - с3

,м (<

О CJ (з-

»-

И (,Ъ (с

3 с (3 д

1-Л

o, а

И

О З (0 (-«И ,Ч

u =О г0 (л с» с0 (-» o и р (7 т-с (0 (.2

h с

С0 ф ф

С0 и

С0

С0 и

О г4

b0

С0

U

U и ф с5

С0 ф

С0

С0

ы

v о. и и и и

О и

С0

f3

С0

С0

С5 г-4

Ю С.0 и (-а с Ь и и сс (0 tQ

«д»Ъ

С5» и 3

E (»

О ф

С.Р

3» ъ (-» (-с

O Cj (с с и

О С С5

С0 О ф С5 и и .и и

РJ ф

«» 3 с0

С„0 С0 ф и С0 ф

С0 г3 ф С0 С3 и

4J. и и г3 и

С0 ф

c u

C0 ф

C C5 U г«5 ° и и

С0 ц С3 U сд ь5 и и с.3 и . -"0 и ф С3 ° u и ф О д и

c0 и с0

С5 и ф и С3

О, и г»

С0 С0 V с0 и и С3 С3 и U U и и с0 и U e0

С0 с0 и ф °

С3 С3

U ф

С0

С0 U U

С0 С0 С0 и С0 ф и и о и Оь и

О аз с4 и и

b0

С0

СО

t0

С0 и и с

С5

ЬО г3

v

О

С0 сб

С0

4J и

С0 и и ф с0

С0

С3

С0 ь0

С0

С0

С0

С3

С0 и

С0

С0 ф ф

СО

CO

44 и и с0 ф

С0

С3 и и

С0

Щ и

С0

С0 и

С0

С0

М г3

О

С0 и

С0

С0 и

1801118 ф ф О

t3.. W С0 с0 и с с3 с3 О С0

С3 и С0 с3 м ф

С0 ф О

С3 О г3 и и с0 с3 ф с3 И с3 и С0 и

- ° ф о о о и tJ о

С0 и О с0 и

tJ О

С0 ф

С0 О и о с0 v и ф и с0 и С,0 ф и и и о с.3 и с0 и

v м и и

С3 и О и и и

U и и

С0 С0 С0.

С3 ц ц и ы и ф ы

О

С0 и

ы и г3 и и .ц

С3 С0 Сф и и и и о и са С0

И с0 и ф с0 и

С3 ° u и с0 и ф и с0 ф и ф о и С3 ф ф ф с0 ф. ы ф, "3 и ц .ф и

33

34

1801118 ь

Щ

»Г (ч ь

CI

Ю

Р ь

Ю

CV ь .Ю ь

Ю с 4

C)

С)

»"Ъ

»»Ъ

Ю

»/

° М

4 Ъ о

Щ

«Î

« 4

1Ф

Z о

С( о а с

О с и и и и и о (» и (-м и

o o о и и

О С с (o u и и

О.С о о с

c u

o.u с е и с (-» и

U U

U С

О и

C o

1й

o u с с о ° и и и с и и о (0 (5

° и с (3 (» (и

D и

° и и и с и с о (» и (ч

Е» о

1 (-» (-» и с и) и (-» и с о с (р и

Е» и (ч и

° и (» Е-» с о с ° и и о о

O U и с иэ (-» и

c-o и и и и с с о с и с и и с и и с и с о и с с и и с ° о и и

О и с и (-»

Е»

О

o u и ° с и с и с с и (< и (-» и

О (» и ° o

И (0О ОИ

Снo й< оииро

uй и

Е-» (-» и И O

О ° -» и р. (.» rO O u (» ("» u = o ои т ° »О Н(ч

DOODADÈ сни (-(ч (. .- o

u iouuuU о фини они Qè с.» у и и Й(, н(-»

С» О-0(о и (» (о

И (: и „ О с н > ц (-»

ИO)сo о ли (-» ин,, фи с

ОНй QO

ra«Qr> (» Д и eн

Q о,. о

О о и и си ф и (» ф (™ Q о О.ОО ц о н (-» и и и („, о

Q o U

c5 o o

0. и й и

Q Е <,1 (-»

V U O и ОРс

U g4 (-Э ф

O& U

», uKu

") 00 О оеи ио „, (-»

O0 uoO (0 и ф нч с л и и

Д

Q °

il ф с 0

Н с

И

Ф

+ ю а

Ф в-1

Н

Г и

t о0

Н

Q (Л

t0 й» с

О е ф-1, >ъ

° и и

0J

И н» с0 ф

Ф-» с ф

Р

»4

Л

О -Е

C и

Р

Q в-Е

0 ф ф

00 ф

rd и ф с0

Ь0 ф ф

М

r0

М м

О

r 0

CQ

М ф ф

М

td

С0

CO 0

Щ ф ф сО ф ф

IJ

IJ

0 о

0 е0 и

И1 м о

44

Щ

О ф

М

CO

00 ф

CQ с0

Г» и

CO

Я

ЬО

bQ и Ф Н ul(-» ийoru о a >

Е-» (л (-» Е-» И (сн ири о ф о и pî ъо Qw с 4 е-ч, и

О u (» rp (-»

И rOOЛС

N(w Qu o ñ

О Ой

00 и ни оси о вс

V

u . йй о о «и

О с(с и ru

ы и с ( (фи ар «и йси

v r,u

v СЕ»и

o ao ф н»и о м й-й с

V g c0O и йс о

О .. и

Е-» Q (-» оаэи

О0 ИНС о "ч с

00 (» ц О

О ч (- и ",.;ф

Q o+ o е-».u) и о фи о+u

v ufo

О ч Е-»

4э ИСО

Е (о исс » о со(»

v o (co оно и о о о о

1 и (ч

° o с4 0 си с о

С» (р с и

- ° o и

Н "(» о

00 () и с с U

»0 с и

U ..o ф и т-» и и о и (-» с

Е-»

1 и и с з-4 о о и

° o (ч

3 о о

0 С и с и о

И-U

G0 (»

Q и и

f4 ° o

v) о с о

Ф и с

° (-» (< °

О о и(- v

ИИ (» IO

o e и с (О

° - ° ц}

Д Оо

o o и и (v. (.8

u u u и 44 (t (» C4.й o° - v

U . Qw IJ

Е< с и Q о и со

u (-» c0

u o и (ч»4

° Е-» U а 0 (.р и

И И 0 (0 rd

u-o 4

o u а и

O u cd и

° o u-О (-» О и с с

u u o

u o с с-o co и,о с v о сО

ouU и О 0

Я.g й

О С CO (-» и и (..o

1801118

1«(.»

V О со с о е о

cn f» н (» нс

О с7 (-» о

v «» еu о ч и

ЮС О и о

О е о с (-» н с е о с (» с еи

° » и

K О

» о

c0 f»

) О

bD О с ° со сй Е

»с vi

° л и сн

W О с- О

° -» с

ОИ сз О

-» o

С О î и и

a u

»

° »

Г« f» ос v

Сн V

"". Â

О О н f» и с н

Q и

qj

О

С4 с4

4J

О

О (» и

С4

С4

»4

О

Щ см

С4

Q с6

С4

7 О а-»

О О

ci u

0С

Е- (с О

Лс

ОО

ccf Е-» и

СО н о е О ас с0 (» с о

cq D

-» о

С О н f» нс сл и

WО

v (» о,(cc o и (» о

С0 О ню О сс е о

° с «м с»С0 с0 и

Q и

»0

С4

ce u

» с и н ."- v

fi C аО н О (» и

С0 С и с ю со а О

ы о и Е» е f» с О

СО

О

О

С4

Q

Q

Q ео о-»о

1С О о с4О

° н О со о 7и сзаН . v о

7 Е.

e f»

au о с н

0- V

7 О с

ОИ

СС и

С4 О

cn (» г

- u с и е о .с= н .0<н

7 О о н

au о

44

° J и

О

Q

»0

Q н Е-»

Q Е» сс н О

=- u

t K с0 Е

+ u

О лv е с

c o аи нс н. с

a o

n f» еи

«-» (с с»

C О

-с с

О О ео

» (-» с» С."э Е»

Ц до

О с

7О

V Е-»

A o н и а о со н аи

-с о

С О

b0 с0

Q с0

О

44

Q н f-» ео и н

»0 Ю .» и си

c u

"u нс но е U

СО K

ЬОО н О со

- =u ос н и а и

7 О с

О О а.o

CD си сд о

s u со

О и

С0

М

О

b0 с0 с0

С4

bCC ос

c» u сн и ос но с4 о ос

c v

0. О

c0 и

-» v

« О

7 О

» с«

ОО ео

»о СО

go. о( ни

0 V

»0 е

С4

4с ш »0

t4 щ С4

С4

С4 и

LO О с0

»0 н

»0 с4 о (b: V

Сс«И ю Е»

W О

o f

b0 и со С »0 (» нО о-»И

С И с 1 с О

7О ou о е(» оно

aV спи,О

7О. ОО ен cî

«-1 И Сс«u

1801118

37

В4 .ф О (-< а

4 О ъ < (-е (ч о и ф

b0 и ф

Щ и

Щ

Щ

bO

Щ и ф и

Щ î ф

ii o ио фи

Clj ЕЧ v

Cjj

i0 И х (, (а и р офо ц ° 4. 4 Q

lф а о

Е < с5 о

K с

О >,СО у о

О bOÑÝ. Ъ jc С5 <о и ф

U ф ф

О

U ф

О и и

О

U о о ф

v м

О

U ф о

CJ и

b0 и

ОО и

b0

С4

U

° о (.«

О ОО< О j«СО

«g»

Cb. O аС (:1 СО

i-1 о о о

00 и о

О

b0

С4

b0 о

ОО (4 и и о

00 ф

U м о

О

b0

М

Щ

00 ф

Щ и

Щ и

v о ф ф

60 и и

U ф

U о

ОР

Q и

Q и и

U и

С4

v ф о

b0 и

М и и о

bO и ф о ф

b0 и с4

С4 о

bO ф и

О

b0 и

00 ф

v и и с4 и ф

00 м ф

v о

b0 ф

U и

О ф (4 (4 и ф о и ф о

Щ ф ф

ЬО ф

Щ

С4

b0 ф и

v и

v о

b0 (4

b0 ф

v ф и и

bO и ф

ОО

Clj

С4 и

U и

CJ

О

b0 и ф

ЬО и и и ф ф ф ф

О

Ц) и

Cj о ф

О

ОО

ОО

U и ф

CJ и

Clj

ЬО и о о

Щ

С4

ОО

Clj

Clj (4

b0

00 и и

00 и ф

v о

00 ф

00 ф

b0

С4 ф ф

ЬО

00 и.

ЬО

00 ф

\Д м

О

Clj ф (0

l4

00 и ф

b0

b0

00 ф

U ф

CJ о ф и и о

С4

О

b0 о и и и и

60 и

CJ и ф

LI и и

ОО и

bO

ОО

bO иО ф и

С4

ОО и

CJ

О

О о с0 и о

CJ

v о ф

О

b9 с0 и ф

М

b0

b0 и

С4

CJ и

U и

СО

b0

С4

О и и и и и ф

Щ и

60 и и о и и о и и ф и

b0 и

ОО и и и

ОО ф ф

Q о и

ОО

b0 и и и

О и

М и и

ЬО

b0 оО

М

60 и ф ф и и ф ф

Щ

bÎ

ОО

ОО ф ф и и ф и

v ф ф ф

bO и

U ф ф (ф с4

Clj

CJ ф с4 и и ф

О

v ф ф

1801118

40

i) C4

v я v

:Г С4

S и с

LD и и с4

Q ф

v ф н «»

o=o йс юо чэ с с5

2 СР о а« сод о фо о с (э во т.» н с

v и о с4 и и и

00 ос

ыo

ai o

"3 С5

Ф о-1 (» и и

Ш f», o ло

Ol «» î

+u ф (»

> и о и и

С4

Щ

U ф о и () ф «»

»»« <ф

e u ф «»

» Ю.

wu

М (5 с0 С

Оъ о «»

o ( о

0. Î

М (3

w u сс

«э о (4 (» до ф о ч с ми

U) (0

r Q

+u ф (»

W CD сС (3

ы и

ca «» аu и и (» «» н и .и о (0 о

Щ ф

00 с4

Q

Q и

С4 с4 и о

Щ

С0

С0

00 о й4 (»

A o ф «»

О»О «» и но

0l и с0 С ео

«» «»

Ck «» ао ф « »

c u о о и

00 и

Щ

U с4

v о с4 ф о ф «»

Й» Ръ (Л са о «» н (0 .а и

«» еи »-4 «» и „ с4 ф

v и

Q о с4 с4

Q о ф и

00 о

v с0 и с4 и

v и о

v о

С4

v фи

w «» н « но .с о

«» с ос

w o

0».аи со с

Q с4 о

Щ} и

00 и и

00 ф о ф с0 C4 и о и о фо, 1 О

«; и ос

wo аu ос н

0 Î фо

° «

«си

« о с й

N CD

° g c и и

1 1 и с4 О «» и мo

С4 0 О (4 и о

v сп «»

V >. CD

С4 «Э

cD u с4 и ф (0И с4 н «„ м м о и й

v и л и и lou

v uu м с(-« и

U с Йс фи и оно о р«ч

«» (D с ф.4 О

42 жомн

„O OQ д) ° щ с се о

4 Q со

> О

° -1 «, v o

10 м .с и нс

15 ао с. сР

Л с

20 а Е» т4 жо

O Ю

6 н ао

25 4 v е-4 -с

30 и <Э

co ао

Q н о

35 оО

s o

Рм о

40 мо о йс мо

« с н н î е о

p v

cn < ио ми м о со

co мс м о со

50 о: v

Рч Р ео.1 не н о

cl н v он мо а v

S

X о 2 о с оо .о мо сп С4 О о мо сч еи л ур Н-в а о с) j-s .1 и о мо и мсэ

- со

1801118

1801113

44 он CD

0» О

«и е О °

О О

< u

О ..o О 1О т &» С О С О

=> О

Ю O fe о" -а о

Ю о

Ю га о

О н

СЛ f-e

«О он î и

a u-. о О н н с о и

С3

О

CD

Щ

° -4 с

4 О

a f»

О о н с аи сн

W CD

C о ео u си о

ОФ и ос с о а» о д О

-» с

ОИ о с о

О с н

C,: . (О

-» с оо

wo

СЭ

VJ

»-4

el О

WО он ог ко

Ое о

eII Н о . О

2 С5 я f-e ао

:з о

ы на

«л о

О

С» о

5» CD о о са Еа3 н л о со ч

Еч

2 О

OOf» CD с не cg а- О Ю-» LCD 1С з О

ы н

1 О с

О о о о

С2 о

О о

О г р о з Р и

Ф о

3» о

О с

f-e н» о

J о о

С0 Н

О с .р

a CD ч о

С CD

О н о

-:) И

° «% ао

С.»

Ь н и и с

Л О о f а о

С у о с

О о

CD эо

ы н

»4 о о

»

r, о о с

C О «

ОО о с о нн

О ао

1» О» н f»

О

О с

СЗО с1 с

О о а

C ао п с сз

О э н

° О мо

О со й» О а О н н о о

О CD г н о о f о

CD о

С О

-i CD

С О

О с

CD о о

«» о ф О

C= O

44

4Л

bO

Щ и

v и

v о

U

v

eI3

60 и о и

4J о

U

4Л о

6, CI0 о о

v

U с0

C4)

v о сЦ

00 и и

Щ о

ЬО

4J и

v

J и

М

Щ 0

v и

М 0. и

v

Щ

° C$

U о

U л

C$ о

63

Ie0

CQ о

v о

1 с

«»

CD л н

И

l И

60 с3

Щ

Щ о

ЬС

CO

00 г с0

v с0

4J

CO

eg

U и

С0 и

Я и

00 с0

v и

С»

lJ с0 о0

«»

О

1 рч

CDi

3» ( î п3 на

° -4

О О

1801118

A An r

I о о

С0

О0

fQ и и

CQ

С0

r»

« и

Q о

О0

О0

О0

О0

«0

V и

LI о о

CQ

v и

v и

U

Сл» ф о

Еч о

v и

v о и

CJ

«0 ф

CJ

f„

CQ и и r»

О0 и

Q ° О0 с с с

° Ц

С-а

«» о о

&e с

О о

С0 и и

С0

4J

CO

4J

С0 о н

«4

Ф

Р»

CQ

Le с о

Г о

И о

С4 (0 со

Ф о .С (-4 (С4 С С<

34 Е-Е .с о ч с

a o

С ч н с с и О0 со

oc

° o

Р. ° ф М о

СО ис

CI O

CJJ ф о

w(o

c Q

f3 О о с и о с

L u с. о о г

С.» а о

-с с

Ю (.Р

»»Ъ (Л ч ц о (ъ и — о

С-4 С о л с ч о

Ф о

С3

Ф -3 (1 и и ф и

CQ

f»»

U и

cQ

CJ и

О

v и

v и ф

CJ о с3 о о ф

4.4 ф о

4J

CJ и

СД

U

С0

44

С0

С0 ф о

«. o

m C

c o

О

«О

34 С о с

О

4J

С0 и и и

CO

«0 и

Q

CJ и

4J о

U ф

v ф

CQ

Г

С0

4J и

LI .

v ф

«0 и

Сл

«Q

Г0

Я

О0

«Q и и

44 ф

CJ

О0

LI

О0

fg и

4.4 и

ГД и

CQ . CC, О:. н ф и о

С -)

f»»

LI о ф

Щ, ф

44 и и о

О0 ф

О0 с3

Сл

Щ

С0

О0

CQ

bQ

CQ

4J

4J

cQ ф

О

С0

С0

С0 ч и ф

v и

Г0

4 3 г .4«

GQ

4J

tJ н

О0

С0

CJ

CQ

CQ

О0 ф

О и

CO

4.4 ф

О0 н и ф ф ф ф

CQ и и

U ф о

CQ

О0 и

4J и ф и о

С0

Щ

С5 и о

С0 и ф

С0

С0 ф

CO

О0

С0

4J и

С0

4J ф о

CJ

ОО

rI

О

r»» и

ГД

ОО

ОО

Щ

rJ и

СО

С0 и

С0

О0 ф

4J и и а

cQ

С0 ф

CQ и

v ф

С0 н

Щ

С0

CQ

rJ

ГД

С0

С0

CQ ф

V н ф

cJ и ф н и

v ф и

О0 и и

44

С0

44 и

rJ и н н ф

CQ

ОО

Г4

СЬ

CO н

С0 и

CO

О0

О0

-v

CJ ф о

С0

О0 и и

v о и

О и

О0 и

LI

v о и

4J о ф

С0

CQ

С0 н

CI3

С0

CQ ОО

С3

U и и

4J

С0

ОО

rJ и и и и и н и

cg

О,р н

СО и и

О

44 и

v и и

Щ и

° О0 и

О0 и и и

О0

«0

CJ и

С0

С0

О0

С0 и ф

4J и и

CQ

С0 и о и

С0

С0

4J и

СЪ

С0

CQ

О0

С0

44 ф

О0

С0 ф и с»»

С««

rI

Г»

С3 (1 и

rJ

Щ

О0

CO

О0 н

С0

Щ ф сф ф ф ф

rJ

CI5 ф с» ф ф ф

f0

О и

С4 и

О ф

Г0

Сф

О0 о

Щ ф

b0

cQ

rJ (4

Г\

4J и ф и

44 о

v ф ф

47

1801118

48

Таблица 8

Таблица 9

ЭПО, выделенный из клеток COS, трансфекцированных кДНК ЭПО, тип 1

Таблица 10

Уровень высвобождаемого в среды ЭПО

Таблица 11

Уровень высвобождаемого в среды ЭПО