Рекомбинантный гранулоцит-колониестимулирующий фактор (g - csf) без дополнительного остатка метионина на n-конце

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам специфического расщепления полученных биотехнологией протеинов с применением IgA-протеаз и особенно способам получения в прокариотах рекомбинантных протеинов или полипептидов с возможностью последующего удаления N-концевой последовательности. Рекомбинантный гранулоцит-колониестимулирующий фактор (G - CSF) без дополнительного остатка метионина на N-конце получают расщеплением IgA-протеазой слитого протеина, экспрессированного в клетках E.coli, содержащего между N-концевым метионином и аминокислотной последовательностью G - CSF сайт распознавания IgA-протеазой.

Изобретение относится к способам специфического расщепления полученных биотехнологией протеинов с применением IgA-протеаз (называемых также игазами) и особенно к способам получения в прокариотах рекомбинантных протеинов или полипептидов с возможностью последующего удаления N-концевой последовательности.

Получение протеинов методом биотехнологии осуществляют с применением микроорганизмов, которые легко культивируются и позволяют простым путем получать протеин. Подходящими микроорганизмами являются для этого, например, грамотрицательная бактерия Escherichia coli, грамположительная бактерия Streptococcus carnosus и хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Однако, экспрессия аутентичных чужеродных генов в таких микроорганизмах часто имеет недостатки. Например в E. coli условия трансляции приводят к появлению аминоконцевого остатка метионина, который у гомологичных протеинов в большинстве случаев эффективно отщепляется. Однако при получении чужеродных белков это отщепление первого остатка метионина проводится в большинстве случаев дополнительно. Подходящим методом является получение таких протеинов сначала в форме слитых протеинов и затем их расщепление при помощи определенной последовательно-специфической протеазы.

Кроме того, в противоположность аутентичным протеинам такие слитые протеины имеют то преимущество, что они укрупняются в клетке микроорганизма и образуют плотные тела включения ("Inclusion Bodies"), которые легко можно отделить от других частей клетки и тем самым облегчить выделение и очистку желаемого протеина. С другой стороны, протеины-носители, которые при помощи способов генной инженерии прежде всего сливаются с собственно желательным протеином, придают слитому с ними партнеру особую устойчивость против неспецифического протеолитического расщепления; проблема расщепления полипептидов, являющихся чужеродными для клетки, особенно важна при биотехнологическом получении малых пептидов. Некоторые протеины-носители позволяют распределять желательные протеины в определенных участках клеток, из которых их можно особенно легко очищать и где они особенно стабильны и/или где они доступны для испытательных целей. Наконец, протеины-носители могут иметь также специальные свойства, которые позволяют проводить эффективную очистку, например, хроматографией сродства. Для многих целей применения предпочитают слившиеся протеины, которые несут протеин-носитель на аминоконце и желательный протеин на карбоксильном конце. Но в определенных случаях может быть также желательным обратный вариант или связывание желательного протеина с двумя партнерами слияния. Может быть выгодным также обратное повторение желательного протеина в пределах слияния.

Для получения желательного протеина в свободной форме из подобного слияния необходимо отщепление ковалентно связанных партнеров друг от друга. В принципе, этого можно достигнуть при помощи химических или биохимических (ферментативных) способов. Однако при этом в большинстве случаев имеют место ограничения, связанные с тем, что для получения желательного протеина важно, чтобы подобное расщепление происходило в последовательности между партнерами слияния, т. е. в переходной области, но ни в коем случае дополнительно внутри самого желательного протеина. Поэтому расщепление партнеров слияния должно быть высокоспецифичным.

Применяемыми до сих пор химическими способами для специфического в отношении определенной последовательности разделения слившихся протеинов являются, например, расщепление бромцианом по аминокислоте метионину внутри протеина и расщепление между аминокислотами Asp· ! · Pro в кислой среде с применением муравьиной кислоты. Но эти способы пригодны только в том случае, если специфическое место расщепления в желательном протеине имеется только в переходной области и не повторяется второй раз. Однако, в общем, биохимические способы расщепления следует предпочитать химическим способам, так как первые в большинстве случаев можно осуществлять при физиологических или по крайней мере при химически мягких условиях реакции, которые не причиняют ущерба желательному протеину.

Биохимические способы расщепления слитых протеинов основываются на применении по возможности специфических протеаз. Например, трипсин расщепляют следующие за аминокислотами аргинин или лизин пептидные связи внутри протеинов. Повышение специфичности может быть достигнуто предшествующей химической модификацией аминокислоты Lys, в результате чего специфическое распознавание можно ограничить аминокислотой аргинин. Другой примененной в биотехнологии протеазой является Клострипаин; этот фермент расщепляет пептидные связи между аминокислотой аргинин и любой следующей за ним аминокислотой. Обзор о применяемых до сих пор ферментативных способах для расщепления слитых протеинов был составлен F. A. O. Marston (В [D.M. Glover, E.]: DNA cloning III, IRL PRESS Оксфорд и Вашингтон DC, 1987). Ферментативные способы расщепления ограничены тем, что специфическая для точки расщепления аминокислота (аминокислоты) могут встречаться одновременно также в самом желательном протеине. Поэтому для биохимического расщепления слияний протеинов пригодны особенно ферменты, которые при расщеплении распознают не только аминокислоту, но и последовательность аминокислот; при этом вероятность того, что определенная последовательность аминокислот кроме нахождения в точке расщепления между партнерами слияния встречается еще раз в самом желательном протеине тем незначительнее, чем больше число аминокислот, необходимых для распознавания и расщепления.

Список последовательно-специфических протеаз, которые применяются в настоящее время для расщепления слитых протеинов, содержит в настоящее время фактор Ха. Эта протеаза расщепляет специфически последовательность Ile-Glu-Gly-Arg· ! ·X, где · ! · показывает точку расщепления, а Х обозначает любую аминокислоту. Однако оказывается, что и эту протеазу нельзя применять универсально для расщепления слитых протеинов, которые несут соответствующую последовательность расщепления в своей переходной области;часто такие субстраты (т. е. слитые протеины, которые содержат желательный протеин, ковалентно связанный с протеином-носителем) либо вообще не расщепляются, либо гидролизуются только в очень небольшой степени, либо только в растворимой форме.

Особенно важным является эффективное расщепление слитых протеинов при получении рекомбинантных протеинов в прокариотах, поскольку там требуется введение ДНК-последовательности, которая содержит AUG в качестве начального кодона перед началом собственной ДНК- последовательности. Как результат этого в прокариотах, как например E. coli, экспрессируется рекомбинантный протеин, который содержит дополнительный остаток метионина на N-конце.

Однако во многих случаях требуется получение не содержащих метионина 1 рекомбинантных протеинов. Получение таких протеинов из прокариотов можно осуществлять например через метионин-специфическую пептидазу, которая отщепляет N-концевой метионин. Однако этот способ связан с очень большими затратами, так как отщепление можно проверить только путем анализа последовательности протеинов. Кроме того, разделение содержащего и не содержащего метионин протеина по причине почти идентичного молекулярного веса является очень трудным и тем самым может быть достигнуто только частично.

РСТ-заявка W084/02351 раскрывает отщепление N-концевых аминокислот от слитого протеина. При этом аминокислоты протеина от N- конца, благодаря постепенному отщеплению экзопептидазой, предпочтительно лейцинпептидазой, могут быть удалены вплоть до последовательности X-Pro. Последовательность X-Pro отщепляют из этого продукта или в две стадии, или в 1 стадию с применением постпролин- дипептидил-аминопептидазы (ЕС 3.4.14.). Этот способ имеет тот недостаток, что вследствие постепенного отщепления аминокислот от N- конца протеина, должен образовываться не единый продукт, а всегда смесь продуктов, которая, наряду с желательным продуктом, содержит и не полностью освобожденные конечные продукты.

Другой способ для ферментативного расщепления слитого протеина известен из европейского патента N 0020290. При этом способе для отщепления желательного протеина применяют фермент Коллагеназу с определенной последовательностью распознавания.

Однако было установлено, что Коллагеназа, как и другие эндопептидазы, имеет лишь небольшую специфичность (см. Biochim. Biophys. Acta 271 (1972), 133-144). Кроме того Коллагеназы активны только в отношении протеинов, которые имеют специфическую пространственную структуру.

Применение уже упомянутого фактора Ха для отщепления N-концевой части слияния протеинов известно. Однако этот способ наряду с уже упомянутыми проблемами эффективности расщепления имеет другие недостатки, а именно то, что, по всей вероятности, распознаются и расщепляются также внутренние последовательности целевого протеина. Кроме того, фактор Ха выделяют из сыворотки крови крупного рогатого скота, вследствие чего требуется связанная с большими затратами очистка и аналитика, чтобы обнаруживать возможные имеющиеся факторы патогенности или вирусы.

Различные виды патогенных бактерий (например рода Neisseria, в частности Neisseria gonorrhoea и Neisseria meningititis, или рода Haemophilus, в частности Haemophilus influenzae и Haemophilus aegyptious), которые развиваются на слизистой оболочке человека, выделяют протеазы, по расщепляемой последовательности близкие родственным протеазам, которые специфичны для IgAI человека, и поэтому, обозначаются как IgA-протеазы или игазы. Иммуноглобулин IgAI является важной компонентой секреторного иммунного ответа, который должен защищать против инфекций таких патогенных организмов (Обзор: Korfeld и Plaut, Rev, Infect. Dis. 3 (1981), 521-534). Наряду c этим lgA-протеаза расщепляет также свой собственный протеин-предшественник в результате аутопротеолиза. Получение IgA-протеазы из Neisseria gonorrhoea MSll в аутентичном штамме бактерий и в грамотрицательных клетках хозяина уже было подробно описано ранее (патент ФРГ N 3622221.6).

IgA-протеаза согласно данных Pohlner и др. расщепляет следующие последовательности распознавания (Nature 325 (1987), 458-462): 1. Pro-Ala-Pro· ! · Ser-Pro 2. Pro-Pro· ! · Ser-Pro 3. Pro-Pro· ! · Ala-Pro 4. Pro-Pro· ! · Thr-Pro Символ · ! · обозначает точку разрыва IgA-протеазой. Клонирование последовательности, кодирующей IgA-протеазу описано у Pohlner и др., 1987.

Задачей настоящего изобретения была разработка усовершенствованного способа для биохимического (ферментативного) расщепления слитых протеинов, чтобы полученные методом генной технологии слитые протеины, состоящие из любых партнеров слияния и специфической последовательности расщепления в переходной области, можно было применять как субстрат для получения полезных протеинов, например G- CSF, по возможности с высоким выходом и в оптимальное для последующего использования форме, в частности без дополнительного Met.

Эту задачу решали методом генной технологии путем введения точки распознавания или последовательности расщепления Pro· ! · X-Pro в переходную область слитого белка и путем специфического расщепления этой последовательности IgA-протеазой в обозначенной символом · !· точке расщепления, Х обозначает преимущественно аминокислоты Ser, Thr и Ala, и особенно предпочтительно Ser и Thr, но может обозначать также другие аминокислоты.

Под понятие "IgA-протеазы" по настоящему изобретению подпадают протеазы, которые специфически расщепляют IgA, которые описаны, например, в Rev. Infekt. Dis 3 (1981) 521-534. Но пригодны также и рекомбинантные IgA-протеазы, которые описаны, например, в заявке на патент ФРГ N 3622221 Proc. Natl. Acad. Sci. США 79 (1982) 7881-7885, Proc. Natl. Acad. Sci. США 80 (1983) 2681-2685, Nature 325 (1987) 458-462 и EMBO Jour. 3 (1984) 1595-1601.

После расщепления IgA-протеазой аминоконец протеина содержит последовательность X-Pro. Эта последовательность как часть желательного протеина может быть выгодной, невыгодной или же незначительной. Выгодна эта последовательность, в общем, тогда, когда полученный методом генной технологии желательный протеин и в своей природной форме содержит на своем аминоконце обе соответствующие аминокислоты X-Pro. Охарактеризованные аминоконцевыми X-Pro протеины, которые имеют важное значение в биотехнологии, встречаются в природе.

Способ по изобретению, в противоположность всем другим известным способам для расщепления слияний протеинов, имеет те преимущества, что его оказалось возможным применять универсально к слившимся протеинам, которые в своей переходной области несут указанную последовательность расщепления и что его можно применять также к нерастворимым, растворимым, соединенным с мембраной и связанным с клеткой слитым белкам. Кроме того, в качестве особого преимущества способ дает возможность расщеплять слитые протеины в форме тел включения, какими они получаются в микроорганизмах. Другое преимущество способа состоит в том, что примененный расщепляющий фермент, игазу, можно получать с небольшими затратами из питательных сред непатогенных бактерий.

Встраивание последовательности расщепления для IgA в переходную область слияния протеинов осуществляют средствами генной технологии. Так, последовательность нуклеотидов, которая кодирует последовательность расщепления или часть его, можно синтезировать химическим путем и встраивать при помощи известных средств генной технологии между ДНК-отрезками для протеина-носителя и желательного протеина. Соответственно можно встраивать также природную последовательность нуклеотидов, которая кодирует подходящую последовательность расщепления или часть ее. Кодирующий слияние протеинов ген ставится преимущественно под контроль надлежащих (преимущественно индуцируемых) сигналов экспрессии, так что становится возможным продуцирование клеткой слитых протеинов. В качестве клеток- хозяев для производства слияний протеинов можно применять прокариотические и эукариотические (как растительные, так и животные) клетки. Примененные при этом протеины-носители могут иметь любые функции, в зависимости от того, какие свойства они должны придавать слиянию протеинов, как определенные функции переноса, функции, которые улучшают очистку слияния протеинов или их устойчивость и многое другое. Предпочтительные протеины-носители объяснены ниже.

Особенно предпочтительным применением способа по изобретению является получение рекомбинантных протеинов или пептидов без N- концевого остатка метионина из слившихся протеинов или пептидов с последовательностью аминокислот Met-Y-Pro· ! ·X-Pro-A, где Х обозначает любую аминокислоту, преимущественно Thr, Ala или Ser, Y обозначает одну или несколько любых аминокислот, которая преимущественно, если Х обозначает Thr или Ala, оканчивается Pro или, если Х обозначает Ser, оканчивается последовательностью Pro-Ala или Pro-Pro, и A обозначает любую последовательность аминокислот. При этом расщепляют слившийся протеин или пептид при помощи IgA-протеазы и получают продукт расщепления с последовательностью аминокислот X-Pro-A. Например, этот способ для получения рекомбинантных протеинов из прокариотных клеток без N- концевого остатка метионина включает следующие стадии: (1) трансформация прокариотической клетки геном, который кодирует протеин или пептид с последовательностью аминокислот Met-Y-Pro· ! ·X-Pro-A, где X, Y и A имеют вышеназванные значения, (2) культивирование трансформированной клетки в подходящей среде и экспрессию трансформированного гена, (3) расщепление продукта экспрессии из трансформированной клетки с последовательностью аминокислот Met-Y-Pro· ! ·X-Pro-A IgA- протеазой и (4) выделение получающегося продукта расщепления с последовательностью аминокислот X-Pro-A без N-концевого остатка метионина.

Благодаря способу по изобретению неожиданно можно получать с высоким выходом и хорошей специфичностью в одной стадии протеины без N-концевого остатка метионина, которые имеют N-концевую последовательность Х-Рго, причем Х обозначает преимущественно Thr, Ala или Ser.

Часть носителя Y слившегося протеина обозначает последовательность аминокислот по меньшей мере l, преимущественно до 100, особенно преимущественно от 1 до 50 аминокислот, которая оканчивается распознаваемой IgA-протеазой последовательностью расщепления. Если Х обозначает аминокислоту серин,то Y оканчивается преимущественно последовательностью Pro-Ala или Pro. Если Х обозначает Thr или Ala, то Y оканчивается преимущественно Pro, особенно преимущественно Arg-Pro, Pro-Arg-Pro или Ala-Pro-Arg-Pro.

В особенно предпочтительном варианте осуществления Y обозначает по меньшей мере 5 аминокислот, которые оканчиваются последовательностью Pro-Ala-Pro-Arg-Pro. Однако для способа по изобретению применяются все распознаваемые IgA-протеазой точки расщепления.

Часть носителя Y может содержать еще другие любые аминокислоты, преимущественно до 100, особенно преимущественно до 50 аминокислот. Однако для этого применяют преимущественно такие последовательности аминокислот, которые на уровне ДНК улучшают экспрессию протеина Met-Y- Pro· ! ·Х-Pro-A и/или на уровне аминокислот облегчают ее очистку из клетки.

Экспрессию протеина Met-Y-Pro· ! ·X-Pro-A на уровне ДНК можно улучшить, например, слиянием с фрагментами гена β -галактозидазы, тогда Y включает часть протеина β -галактозидазы. Известны специалисту и другие возможности, чтобы повышать экспрессию протеина Met-Y-Pro· ! ·X-Pro-A. Слиянием с другими полипептидами, особенно с высокозаряженными (например поли-Lys, Arg) или со связывающими определенные вещества с высоким сродством (например стрептавидин), можно облегчать очистку и отделение продукта экспрессии (см. например европейский патент А 0089626, европейский патент А 0 306 610).

Рекомбинантную ДНК, кодирующую слитый протеин, можно получать известным специалисту в области молекулярной биологии способом. Обычно для этого носитель, который содержит кодирующую последовательность аминокислот А ДНК-последовательность, расщепляют ограничительными эндонуклеазами в области 5¹-конца этого гена и повторно связывают с олигонуклеотидами, которые содержат желательную последовательность. При этом олигонуклеотид должен содержать последовательность, которая кодирует точку расщепления IgA-протеазы или часть ее.

Подходящие для экспрессии протеина в прокариотических организмах основные носители известны специалисту. Целесообразным носителем является такой носитель, который обеспечивает высокую экспрессию рекомбинантной ДНК по изобретению. Рекомбинантная ДНК находится преимущественно под контролем индуцируемого сигнала экспрессии (например, λ, tac, lac или trp просмотр).

Носитель по изобретению может быть как внехромосомным (например плазмид), так и интегрированным (например бактериофаг ламбда) в геноме организма-хозяина. Преимущественно носитель по изобретению представляет плазму. Примерами носителей, пригодных для экспрессий ДНК по изобретению в прокариотах, являются имеющиеся в продаже pUC- и pUR- носители.

Примерами протеинов, которые имеют N-концевую последовательность X-Pro, причем X обозначает Thr, Ala или Ser, и которые можно получать по способу изобретения в одной стадии, являются эритропоэтин человека, β - цепь Т-клеточного рецептора человека и особенно гранулоцит стимулирующий фактор человека (G-CSF).

G-CSF синтезируют как лимфокин активированных моноцитов, макрофагов, а также ряда других клеточных линий. Лимфокины участвуют в созревании клеток иммунной системы или системы клеток крови. Они стимулируют созревание основных клеток костного мозга до раздифференцированных клеток. Так, например, G-CSF индуцирует образование нейтрофилов и гранулоцитов.

Так как G-CSF может значительно повышать популяцию нейтрофильных клеток в течение короткого срока, для G-CSF получаются широкие возможности применения в области терапии. Так G-CSF можно было бы применять, например, после химиотерапии при раке, при которой разрушаются клетки иммунной системы. Далее, G-CSF можно было бы применять при пересадках костного мозга, при тяжелых ожоговых ранах, при обусловленных слабым иммунитетом врожденных инфекциях и при лейкемии.

G-CSF представляет молекулу секреторного протеина. Поэтому первичный продукт трансляции содержит N-концевую сигнальную последовательность, которая при секреции отщепляется, так что последовательность зрелого G-CSF начинается с аминокислот Thr(+l)- Pro(+2) (положения аминокислот +1 и +2). При продуцировании G-CSF в прокариотах этот сигнальный пептид отщепляется либо плохо, либо совсем не отщепляется, так что для получения G-CSF без сигнальной последовательности из прокариотов необходимо клонировать AUC(Met) в качестве инициирующего кодона перед началом кодирующей зрелый G-CSF последовательности ДНК, которая начинается на уровне протеина Thr(+1)- Pro(+2). В результате этого в прокариотах, например E.coli, экспрессируют G-CSF, который содержит метионин в первом положении аминокислотной последовательности.

По способу изобретения можно простым путем получать не содержащий метионина 1-положении G-CSF из прокариотов, который начинается с аминокислот Thr(+l)-Pro(+2).

Это происходит в результате того, что получают производное G-CSF из прокариотов, которое в положении +1 и +2 последовательности аминокислот содержит аминокислоты Thr(+l)-Pro(+2) и перед этим, начиная с положения -l последовательности аминокислот, содержит такую последовательность аминокислот, которая распознается IgA-протеазой, которая начинается с Thr(+l)-Pro(+2).

В предпочтительном варианте осуществления производное содержит в положении -l и-2 по Pro, в положении от -3 до -l последовательность аминокислот Arg-Pro-Pro, в положении от -4 до -l последовательность аминокислот Pro-Arg-Pro-Pro или в положении от -5 до -l последовательность аминокислот Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.

В особенно предпочтительном варианте осуществления производное содержит в положении от -6 до -l последовательность аминокислот

Под G-CSF в смысле предмета изобретения понимают рекомбинантный G-CSF, из прокариотических хозяев последовательность которого раскрыта, например, в Science 232 (1986) 61, а также образованные от него производные со стимулирующей гранулоциты активностью, у которых последовательности аминокислот начинаются с X(+1)-Pro(+2). X обозначает Thr, Ser или Ala, особенно предпочтительно Thr.

G-CSF-производное по изобретению после экспрессии в прокариотах можно расщеплять обработкой IgA-протеазой между положением +1 и -1 (между Thr(+1) и Pro(-1)). Тем самым в результате единственной стадии гидролиза получают не содержащий метионина в положении -1 G-CSF, последовательность аминокислот которого на N-конце начинается с аминокислот Thr(+1)-Pro(+2) встречающегося в природе G-CSF.

При экспрессии G-CSF в прокариотах образуются труднорастворимые агрегаты (refractile bodies), которые неактивны. Прежде чем применять протеин, например для терапевтических целей, его следует перевести в его активную форму. При известных специалисту способах (ср. например европейский патент А 0219874; европейский патент А 0114506; WO 84/03711) сначала осуществляют растворение добавкой денатурирующих средств, к которому присоединяют затем ренатурирование и, в случае необходимости, дальнейшие стадии очистки. Обработку протеина по изобретению IgA- протеазой можно проводить перед растворением, после растворения или лишь после ренатурирования. В случае, если обработка IgA-протеазой должна проводиться непосредственно после растворения, следует перед добавкой IgA-протеазы отделять растворитель (например гидрохлорид гуанидина или мочевину) диализом. Однако обработку IgA-протеазой проводят преимущественно после ренатурирования, так как в этом случае выходы G-CSF особенно высокие.

Условия для обработки G-CSF IgA-протеазой сами по себе не являются критическими. Однако предпочтительно применять при этом G-CSF (или другой протеин) относительно IgA-протеазы в весовом отношении 1:1 до 100:1. Превращение происходит предпочтительно в буферном водном растворе с pH от 6,5 до 8,5. Концентрация буферного раствора лежит преимущественно в области между 50 и 300 ммол/л, в случае необходимости при добавке 20 - 100 ммол/л хлористого натрия. Преимущественно расщепление происходит при комнатной температуре свыше 20 - 60 мин.

После растворения, ренатурирования и расщепления IgA-протеазой полученный таким путем продукт расщепления очищают преимущественно с использованием ионообменника и фракционирования. Загрязнение полученного таким путем и не содержащего метионина в положении -l G- CSF другими протеинами составляет менее 0,1%, преимущественно менее 10^-3%.

Следовательно, не содержащий метионина в положении -l G-CSF расщеплением IgA-протеазой можно отделять или очищать практически количественно от содержащего метионин слитого протеина.

По способу изобретения из прокариотов можно получать рекомбинантный G-CSF, который менее чем на 0,1%, преимущественно менее чем на 10^-3% загрязнен другими протеинами и количественно не содержит G-CSF из прокариотов, который в положении -1 содержит метионин.

Предметом изобретения является также лекарственное средство на основе полученного по способу изобретения G-CSF из прокариотов в качестве активного вещества, в случае необходимости вместе с обычными фармацевтическими веществами-носителями, наполнителями и вспомогательными веществами. Такое лекарственное средство особенно пригодно для лечения заболеваний, при которых следует стимулировать образование гранулоцитов, особенно нейтрофилов.

Фармацевтические препараты по изобретению применяются преимущественно как растворы для инъекций и вливаний. Это можно осуществлять в результате того, что имеется в распоряжении уже готовый для впрыскивания раствор, который содержит состав по изобретению. Однако возможно также использование фармацевтических препаратов в форме лиофилизатов. Последние образуются при помощи известных, подходящих для целей инъекций средств или растворов. В качестве среды для инъекций применяют преимущественно воду, которая содержит обычные в растворах для инъекций добавки, как стабилизаторы, агенты растворения, буферные растворы и изотонические добавки, например, физиологический раствор хлористого натрия. Подобными добавками являются, например, маннит, буферный раствор тартрата или цитрата, этанол, комплексообразователь, как например этилендиаминтетрауксусная кислота и ее нетоксичные соли, а также высокомолекулярные полимеры, такие как жидкая окись полиэтилена для регулирования вязкости. Жидкие вещества-носители для инъекционных растворов должны быть стерильными и разливаются преимущественно в ампулы.

Наконец, настоящее изобретение включает также применение не содержащего метионина в положении -1 G-CSF из прокариотов для получения фармацевтических препаратов по изобретению.

Способ по изобретению включает биотехнологическое получение желательных протеинов. Под биотехнологией подразумевают в этой связи, что желательный протеин или его промежуточный продукт получают с применением геннотехнологических средств и других биотехнологических способов (например ферментация микроорганизмов).

Желательный протеин представляет промежуточный продукт или конечный продукт, который может найти применение например в области медицины, исследования, в защите окружающей среды или в промышленных процессах или продуктах.

Способ по изобретению подразумевает, что желательный протеин образуется из слитого протеина (обозначенного также как слияние протеинов), причем слитый протеин или слияние протеинов составляется из несколько ковалентно связанных друг с другом партнеров слияния. При этом по меньшей мере, один из партнеров слияния представляет желательный протеин. Последовательность партнеров слияния и степень их повторения в слитом протеине любая; однако преимущественно она состоит из аминоконцевого протеина-носителя и карбоксиконцевого желательного протеина.

Протеин-носитель или часть носителя служит для того, чтобы придавать желательному протеину в форме слитого протеина особенные свойства. Подобные свойства могут выражаться, например, в повышенной устойчивости слитых протеинов, которая основывается на структурных особенностях и тем самым в значительной степени на более высокой резистентности в противоположность клеточным протеазам или же на переносе слитых протеинов в окружающую среду с небольшой протеолитической активностью. Кроме того, в протеине-носителе могут содержаться свойства, которые обеспечивают эффективную очистку слитых протеинов. Сюда относятся например связывание определенных лигандов для метода афинной хроматографии, отложение слитых протеинов в отделяемых с небольшими затратами осажденных телах и перенос протеинов в легко доступные места.

Области внутри слитого протеина, в которых компоненты (протеины- носители и желательные протеины) слитого протеина соединяются друг с другом, называют переходными областями.

Каждая переходная область может быть определена одной или несколькими последовательностями аминокислот. Последовательности аминокислот (как и все прочие последовательности аминокислот и протеинов) изображают в направлении от аминоконцевой (слева) к карбоксиконцевой (справа).

В пределах способа изобретения все те последовательности аминокислот в переходных областях, которые должны быть расщеплены IgA- протеазами, содержат последовательность расщепления или последовательность распознавания по способу изобретения.

То место между двумя аминокислотами последовательности аминокислот, в котором происходит расщепление слитых протеинов или слияний протеинов, называют точкой расщепления.

Способ по изобретению включает ферментативное расщепление слитого протеина в переходных областях IgA-протеазой. Под IgA-протеазой или игазой в пределах способа изобретения понимают IgA-протеазу штамма Neisseria gonorrhoeae MS 11 и все другие ферменты, родственные с этой протеазой на уровне нуклеотида и по процессу ее образования. Сюда причисляют также особенно IgA-протеазы рода Neisseria и Haemophilus.

Микроорганизм E.coli ED 8654 был депонирован под номером DSM 2102 в Немецком Центре микроорганизмов, Гризебахштрассе 8,3400 Геттинген.

Пример 1. Конструирование плазмиды для экспрессии не содержащего метионина G-CSF.

Конструирование производят при изменении носителя экспрессии pPZ07-mgllac (WO. 88/09373). Для этого носитель экспрессии pPZ07- mgllac расщепляют с Nco I и удаляют выступающие концы с Mung bean- нуклеазой. Затем расщепляют носитель Bam H1. Последовательность распознавания IgA на уровне ДНК получают через следующие олигонуклеотиды.

Олигонуклеотид A:
5' AAT TCG GAG GAA AAA TTA ATG ACA CCA CTG CGA CCT CCT ACA
CCA CTG GGC CCT G 3¹
Олигонуклеотид B:
5' GAT CC AGG GCC CAG TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG TGT CAT
TAA TTT TTC CTC CGA ATT 3'
Оба олигонуклеотида добавляют в эквимолярных количествах и вводят приблизительно в 100-кратном избытке в расщепленный, как описано выше, носитель pPZ07-mgllac. После повторного перекрестного связывания трансформируют обычным образом компетентные клетки E.coli К12. Известными методами выделяют ДНК из клеток и расщепляют ApaI и Bam HI. Фрагмент G-CSF длиной приблизительно 520 п. о. выделяют при применении ограничительных эндонуклеаз ApaI и BamHI из G-CSF- последовательности (Science 232 (1986), 61-65). Этот фрагмент вводят в расщепленный так же ApaI и BamHI носитель.

Пример 2. Дополнительно к последовательности распознавания IgAI слитый протеин может содержать дополнительно пептиды, обеспечивающие облегчение очистки, например, стрептавидин. Для этого стрептавидин-ген (WO 89/03422) клонируют в правильную трансляционную решетку перед последовательностью распознавания IgA-протеазы.

Пример 3. При помощи описанной в примере 1 плазмиды трансформируют E. coli К12-клетки (ED 8654, DSM 2102), трансформанты отбирают на среде с ампициллином и характеризуют плазмиды ограничительным анализом. Положительный клон применяют для культивирования и экспрессии G-CSF. Клетки культивируют в полной среде. Эта среда содержит на 1 л 16 г бактотриптона (Дифко), 10 г дрожжевого экстракта (Дифко) и 5 r хлористого натрия. Клетки оставляют для роста до ОД 546=2,0 и затем индуцируют 10^-3 мол/л IPTG. Еще через 4 ч клетки собирают центрифугированием, растворяют при помощи лизозима/ЕДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и выделяют G-CSF как включенные тела (IB's, ср. европейский патент A 0219874).

Динатурирование или ренатурирование выделенных нерастворимых частиц слияния G-CSF осуществляют, как описано в европейском патенте A 0 219 874. Динатурирование производят диализом относительно 6 мол/л гуанидингидрохлорида. Здесь можно отбирать уже делящуюся без остатка часть и после диализа относительно 5 ммол/л буферного раствора фосфата калия с pH 7 применять для расщепления с IgA-протеазой (пример 4).

В качестве альтернативы после денатурирования в гуанидингидрохлориде осуществляют диализ относительно 5 ммол/л буферного раствора фосфата калия с pH 7, который содержит 1 ммол/л GSH и 3 ммол/л GSSG. После ренатурирования здесь также происходит диализ относительно 3 ммол/л буферного раствора фосфата калия с pH 7.

Пример 4. Расщепление слитого протеина IgA1-протеазой для получения нативного G-CSF без метионина, в положении - 1.

IgAI-протеазу выделяют как описано в EMBO Jour. 3 (1984), 1595- 1601. K 10 μг ренатурированного или денатурированного по примеру 3 G-CSF добавляют 2-5 μг IgA-протеазы и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Через различные ионообменные колонки, такие как Mоно-Q или Моно-S, можно выделять не содержащий метионина G-CSF. Последовательность протеинов аминоконца показывает, что очищенный G-CSF начинается с правильной последовательности аминокислот Thr(+l)-Pro(+2).

Пример 9. Очистка активной игазы из надосадочных жидкостей культуры рекомбинантных E.coli-клеток.

Рекомбинантные E.coli С6ОО-клетки, которые содержат плазмиду pEX1070 патент ФРГ 36 22 221.6) с модифицированным геном IgA-протеазы, выделяют активную игазу в надосадочную жидкость культуры. Фильтрованием через мембрану можно было накапливать фермент в надосадочной жидкости культуры и затем осаждать из раствора сульфатом аммония (0,42 г/мл). После центрифугирования осадок растворяли в Биорекс-буферном растворе (50 ммол фосфата калия, pH 7,0, 8,6% глицерина) (l мл буферного раствора на 1 л надосадочной жидкости культуры), уравновешивали диализом относительно 2 л буферного раствора и затем подвергали катионообменной хроматографии (Биорекс 70). Связанную IgA-протеазу в одной стадии элюировали отмывающим буферным раствором (500 ммол фосфата калия, pH 7,0 8,6% глицерина) с колонки и фракционировали. Затем содержащие IgA-протеазу фракции анализировали электрофорезом на SDS-полиакриламидном-геле (12,5%). В этой точке очистки получали среднюю степень чистоты > 90%. Для получения игазы в чистой форме осуществляли гельфильтрацию с Сефакрилом HR300 в Биорекс-буферном растворе, сопровождаемую последующей катионообменной хроматографией (см. выше). Активность игазы проверяли инкубированием с IgA 1- антителами и разделением образующихся продуктов расщепления в SDS- полиакриламидном геле.

Пример 10. Конструирование плазмиды для экспрессии не содержащего метионина интерлейкина 3.

Конструирование осуществляют с применением носителя экспрессии pPZ07-mglac (WO. 88/09373). Для этого носитель экспрессии pPZ07-mgllac расщепляют при помощи NCOI и выступающие концы удаляют с Mung bean- нуклеазой. Затем дополнительно расщепляют носитель Bam H1. Оптимированную аминоконцевую область слитого протеина получают на уровне ДНК через следующие олигонуклеиды.

Первичный 1A:
5' AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAAACGTTTTAAAAAACATGT
CGACCATGGAG 3'
Первичный 1B:
5' GGATCCTCCATGGTCGACATGTTTTTTAAAACGTTTGGCTTTCATTAA
TTTTTCCTCCGAATT 3'
Оба олигонуклеотида добавляют вместе в эквимолярных количествах и вводят приблизительно в 100-кратном избытке в расщепленный, как описано выше, носитель pPZ07-mgllac. После лигирования сделанные обычным путем компетентными клетки E. coli К12 трансформируют. Известными методами выделяют из клеток ДНК, расщепляют при помощи Sa1I/Bam H1 и перевязывают с ДНК-фрагментом, который содержит кодирующую область интерлейкина 3 без сигнальной последовательности (описано ниже).

Получение кодирующей области интерлейкина 3 с областью распознавания для IgA-протеазы на уровне ДНК осуществляют через известную технику PCR, причем проводят PCR-реакцию с к-ДНК интерлейкина 3 и с нижеописанными первичными олигонуклеотидами.

Первичный 2A:
5'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCC 3'
Первичный 2B:
5'TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGCTCAAAGT 3'
Получающийся PCR-фрагмент дополнительно разрезают ферментами Sal 1 и Bam H1, после чего его можно вставлять непосредственно в вышеописанный носитель ДНК и связывать ковалентно при помощи лигазы.

После трансформации рекомбинантной ДНК соответствующего хозяина, например E.coli K12 C600, можно синтезировать Il 3 в E.coli в форме Rb's и затем выделять. Как описано для G-CSF, осуществляют денатурирование и ренатурирование протеина и расщепляют ренатурированный протеин при помощи IgA-протеазы. Полученный таким путем не содержащий метионина Il 3 после дальнейших стадий очистки можно применять для терапии.

Пример 11. Конструирование плазмиды для экспрессии не содержащего метионина интерлейкина 2.

Конструирование можно осуществлять с применением носителя экспрессии pPZ07-mgllac (W088/09373), который после включения первичных 1A и 1B олигонуклеотидов, как описано в примере 10, расщепляли с Sal1/Bam H1. Получение кодирующей области интерлейкина 2 с областью распознавания lgA-протеазы на уровне ДНК осуществляют методом PCR, причем проводят PCR-реакцию с к-ДНК интерлейкина 2 и первичными последовательностями ЗA и 3B, которые так же кодируют область распознавания для IgA-протеазы.

Первичный 3A:
5'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG 3'
Первичный ЗB:
5'TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTT 3'
Полученный таким путем PCR-фрагмент дополнительно разрезают ферментами Sal1 и Bam H1, после чего его можно непосредственно вставлять в вышеописанный носитель ДНК. Дальнейшее происходит, как описано для IL 3. В предыдущем примере было описано, как соответствующим применением точки распознавания IgA-протеазы и последующим способом можно получать не содержащие метионина терапевтические протеины, которые начинаются с последовательности кислот AIa-Pro. Другие протеины, которые аналогично вышеописанным примерам можно получать без метионина, а именно при применении олигонуклеотидов, которые содержат область распознавания для IgA- протеазы и область, которая по аналогии соответствует 5' или 3' концу опубликованной последовательности и может быть получена через PCR- увеличение. Ниже приведены другие соответствующие терапевтические протеины, которые в зрелой встречающейся в природе форме начинаются с AIa-Pro и поэтому могут быть получены аналогичным образом по способу изобретения:
Cathepsin L (ЕС 3.4.22.15), Mason, R.W. et al. Biochem. J. 240,373-377, 1986.

Эритропойетин, Lai,P.H.et al. J. Biol. Chem. 261, 3116-3121, 1986.

Интерлейкин-1 бета, Zsebo, K.M. et al. Blood 71, 962-968, 1988.

Остеонектин Fisher, L.W. et al. J. Biol. Chem. 262, 9702-9708, 1987.

Тип IV коллагеназы, Collier I.E. et al., J. Biol. Chem. 263, 6579-6587, 1988.

Далее таким путем можно получать протеины, которые в зрелой форме начинаются последовательностью аминокислот Ser, Pro. В качестве примера здесь следует назвать:
Альфа-1 антитрипсин, Hill, R.E. et al., Nature 311, 175-177, 1984.

Atrial natriuretic factor, Kambayashi, Y. et al., FEBS Lett. 259, 341-345, 1990.

Другими примерами для протеинов, которые в своей зрелой форме начинаются с Thr-Pro и могут быть соответственно терапевтическими, являются например:
Complement factor B, Campell.R.D. et al., Proc.Nat.Acad.Sci. 80, 4464-4468, 1983.

Аполипопротеин A, Eaton, D.L. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84, 3224-3228. 1987.

Формула изобретения

Рекомбинантный гранулоцит-колониестимулирующий фактор (G-CSF), имеющий N-концевую последовательность Thr - Pro и по существу свободный от формы G-CSF с метионином на N-конце, полученный путем расщепления IgA-протеазой слитого протеина, экспрессированного в клетках E.coli и содержащего между N-концевым метионином и аминокислотной последовательностью G-CSF сайт распознавания IgA-протеазой.