Способ промышленного получения рекомбинантного гранулоцит- макрофаг-колониестимулирующего фактора человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) в промышленном масштабе. Рекомбинантный штамм Escherichia coli SG 20050/р280 GМ выращивают на стандартной LB-среде при температуре 25-37°С. Выращивание ведут в присутствии ампициллина и тетрациклина. Концентрация растворенного кислорода 10-40% от насыщения. Культивирование может быть осуществлено при температуре 29+1°С. Культивирование может быть осуществлено в три стадии с последовательным увеличением объема питательной среды от 50 мл до 100 л. Изобретение позволяет обеспечить максимальное накопление гликопротеина ГМ-КСФ в клетках бактерий. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к производству рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) в промышленном масштабе.

ГМ-КСФ стимулирует рост миелоидных клеток-предшественниц, а также усиливает эффекторную функцию зрелых моноцитов и нейрофилов. Его источниками являются T-лимфоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты.

ГМ-КСФ стимулирует in vitro пролиферацию и дифференциацию стволовых клеток с образованием колоний нейрофильных и эозионофильных лейкоцитов и макрофагов. Он также вовлечен во многие биологические и иммунологические функции, такие как изменение морфологии эффекторных клеток, их подвижности, цитотоксической активности и фагоцитоза. Способность ГМ-КСФ стимулировать рост гранулоцитов и макрофагов делает возможным его клиническое использование для снижения побочных эффектов луче- и химиотерапии, усиления устойчивости к действию инфекций, терапии побочных эффектов при трансплантации костного мозга. Использование рекомбинантного ГМ-КСФ перспективно для ускорения восстановления кроветворения после проведения химиотерапии, оказывающей выраженное повреждающее действие на костный мозг. Также показано, что введение рекомбинантного ГМ-КСФ онкологическим больным приводит к активации эндогенных моноцитов и макрофагов.

Известен способ получения другого полипептида - гранулоцит-колониестимулирующего фактора с использованием штамма E. coli [1]. Способ предусматривает ферментацию прототрофного хозяина в присутствии >1 аминокислоты в количестве, усиливающем накопление полипетида. Возможно добавление в питательную среду треонина и/или лейцина в концентрации 1,25 - 5 г/л. Треонин и/или лейцин в указанных количествах ингибирует рост E. coli, что усиливает накопление полипетида. Возможно введение в питательную среду веществ, стимулирующих рост хозяина - гидролизата козеина или изолейцина. Накопление полипептида составляет 20 - 40 г/л.

Известен способ получения ГМ-КСФ с использованием штамма E. coli SG963 [2, прототип]. Трансформированные клетки E. coli SG963 одностадийно выращивают в объемах приблизительно 3 - 5 л при температуре 28^oC на LB-среде с антибиотиками. Содержание ампициллина в среде 50 мг/мл, канамицина (10%) 200 мг/мл. Клетки выращивают до оптической плотности 30 ед., при длине волны 650 нм. После температурного шока при 42^oC и введения дополнительной среды клетки растут еще три часа.

Анализ на продуктивность по ГМ-КСФ проводится в следующие промежутки времени: в момент засева, 4 ч спустя, через час после индуцирования высокой температурой (42^oC) и через 3 ч после индуцирования. Анализы показывают, что накопление целевого гликополисахарида по данному способу составляет 8-9% от общего белка.

В данной работе не указан объем питательной среды, тип ферментера. Из условий процесса указана только температура, не указан объем среды, подаваемой после термошока.

Недостатками известного способа являются - наличие стадии индуцирования; - наличие дополнительной операции в виде внесения питательной среды после термошока (объем дополнительной среды не указан); - невысокий выход целевого белка: 8-9% против 15% от суммарного белка по предлагаемому способу.

Задачей изобретения является разработка и поиск оптимальных условий промышленного культивирования, позволяющих обеспечить максимальное накопление гликопротеина ГМ-КСФ в клетках бактерий.

Поставленная задача решается тем, что в способе промышленного получения ГМ-КСФ путем глубинного культивирования рекомбинантного штамма-продуцента E. coli на стандартной LB-среде при температуре 25 - 37^oC, согласно изобретению в качестве штамма-продуцента используют рекомбинантный штамм Escherichia coli SG 200500/p280 GM. Культивирование ведут глубинным методом в присутствии ампициллина и тетрациклина на питательной среде, содержащей гидролизат казеина, экстракт пекарских дрожжей и хлористый натрий при исходном значении pH 7,0 - 7,2. Оптимальной температурой культивирования является 29 ± 1^oC и концентрации растворенного кислорода не менее 5,0% и не более 50% от насыщения. Культивирование проводят в три стадии с последовательным увеличением объема питательной среды от 50 мл до 100 л и достижением оптической плотности биомассы на каждой стадии не менее 1 OE при длине волны 540 нм и длине киветы 1 см. Трехстадийное культивирование проводят для получения оптимальной посевной концентрации и выделения максимального количества целевого продукта.

Штамм обуславливает синтез гликопротеина ГМ-КСФ около 15% от суммарного клеточного белка.

При использовании штамма E. coli SG 20050/p280 GM отсутствует необходимость применения термошока для индуцирования гликопротеина ГМ-КСФ.

Штамм разработан Всесоюзным научно-исследовательским институтом молекулярной биологии НПО "Вектор" (ГНЦ ВБ "Вектор") и задепонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером B-6613.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят питательную среду с антибиотиками на водопроводной воде, очищенной от механических и органических примесей методом ультрафильтрации на аппаратах разделительных с диаметром пор 5 микрон (например, ультрафильтрационный аппарат НПО "Химволокно").

Стерилизуют питательную среду известным методом стерилизующей фильтрации (например, используя патронные фильтры фирмы "Millipor" или "Владисарт").

Лабораторный ферментер объемом 5 л со стерильной питательной средой с антибиотиками засевают клетками E.coli SG 20050/p280 GM. Объем питательной среды 3,0 литра. Для засева ферментера используют колонии, выращенные на агаризованной питательной среде, суспендированные в 50 мл питательной среды. Культивирование ведут в течение 16-24 ч при постоянном перемешивании и аэрации, обеспечивающими концентрацию растворенного кислорода не менее 10 и не более 30% от насыщения. Начальное значение pH среды 7,0 - 7,2. В процессе культивирования значение pH не регулируют. Культивирование заканчивают при достижении оптической плотности не менее 1 OE при длине волны 540 нм и длине кюветы 1 см.

Выращенным инокулятом (оптическая плотность которого, измеренная на спектрофотометре, на менее 1 OE при длине волны 540 нм и длине кюветы 1 см) засевают промышленный ферментер вместимостью 250 л и культивируют при следующих условиях: объем питательной среды 100 л; температура 25 - 37^oC; начальное значение pH 7,0 - 7,2; постоянном перемешивании и аэрации, обеспечивающих концентрацию растворенного кислорода не менее 10 и не более 30% от насыщения.

Сразу после засева и далее каждые 4 часа отбирают пробу культуральной жидкости и анализируют по следующим параметрам: величина оптической плотности, стерильность суспензии, pH.

Процесс заканчивают при достижении величины оптической плотности не менее 1 OE, при длине волны 540 нм.

Накопление гликопротеина ГМ-КСФ составляет при этом 20-70 мг на 1 литр питательной среды.

Существенными признаками изобретения являются: - использование концентрации растворенного кислорода в пределах 10 - 40% от насыщения.

Данный промышленный способ получения ГМ-СКФ неизвестен из литературных источников, что свидетельствует о соответствии заявляемого изобретения критерию "новизна" и "изобретательский уровень".

Способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Поиск оптимальной концентрации растворенного кислорода.

Культивирование в ферментере вместимостью 250 л проводят при постоянной температуре и разных значениях концентрации растворенного кислорода.

Объем питательной среды 100 л, температура культивирования 29±1^oC, начальное значение pH 7,0 - 7,2. Результаты экспериментов приведены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что максимальное накопление целевого гликопротеина идет при концентрации растворенного кислорода от 10 до 30% от насыщения.

Выход за рамки указанного диапазона ведет к значительному снижению выхода целевого продукта.

Пример 2. Выбор оптимальной температуры культивирования.

Культивирование в ферментере вместимостью 250 л проводят при различных значениях температуры и при неизменном значении концентрации растворенного кислорода.

Объем питательной среды 100 л, концентрация растворенного кислорода 10 - 40% от насыщения, начальное значение pH 7,0 - 7,2.

Результаты экспериментов указаны в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что максимальное накопление целевого гликопротеина идет при температуре 29 ± 3^oC, снижение температуры культивирования до 25 ± 1^oC ведет к значительному увеличению времени культивирования и к снижению продуктивности, повышение температуры до 37 ± 1^oC ведет к резкому снижению продуктивности культуры по целевому белку.

Из таблицы 3 видно, что промышленный способ получения ГМ-КСФ человека с использованием штамма Escherichia coli SG 20050/p280 GM позволяет получить более высокий выход целевого белка при меньших материальных и энергетических затратах, чем при культивировании рекомбинантных бактерий E.coli SG963.

Список литературы 1. Заявка Великобритании N 2241505 "Ферментационный способ получения полипептидов", C 12 P 21/00, опубликовано РЖ ИСМ N 3, 93.

2. Международная заявка N 87/02060 "Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor-like polypeptides and process for producing them in high yields in microbial cells", C 12 N 15/00, опубликовано РЖ ИСМ N 1, 88.2

Формула изобретения

1. Способ промышленного получения рекомбинантного гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующего фактора человека путем глубинного культивирования рекомбинантного штамма-продуцента Escherichia coli на стандартной LB-среде при температуре 25 - 37^oC, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют рекомбинантный штамм Escherichia coli SG 20050/р280 GM, выращивание ведут в присутствии ампициллина и тетрациклина при концентрации растворенного кислорода в пределах 10 - 40% от насыщения.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование осуществляют при температуре 29 ± 1^oC.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование проводят в три стадии с последовательным увеличением объема питательной среды от 50 мл до 100 л и достижением оптической плотности биомассы на каждой стадии не менее 1 ОЕ при длине волны 540 нм и длине кюветы 1 см.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3