Способ оценки воздействия лекарственных препаратов на водно- солевой и кислотно-щелочной баланс

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СКИХ

РЕСПУБЛИК Ы,„1802318 Al (я)5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕД()МСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

Э тл

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ a,",, .,"- .. -;,:,,„„

/Qр

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ левой и кислотно-щелочной баланс. 6 табл.

Фм м

ЪФ (21) 4827254/14 (22) 21.05.90 (46) 15,03.93. Бюл. М 10 (71) Ташкентский государственный медицинский институт (72) k.Ì.Ãîíòìàxåð, А.А,Хамраев, 3.Т.Исмаилов P.Î.Ìóðaòîâ (56) Цитология, 1988, т, ХХХ, В 9, с. 1078 — 1082. (54): ПОСОБ ОЦЕНКИ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЛЕКАР ТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ВОДНОСО,ЕВОЙ И КИСЛОТНО-ЩЕЛОЧНОЙ

БАЛАНС (57) использование: в области медицины и можфт найти применение при оценке эффективности новых лекарственных препаратов, рекомендуемых для коррекции водно-солевого и кислотно-щелочного баИзобретение относится к медицине, а именно к морфологии и гистологии, может найт применение в нефрологии при оценке эффективности новых лекарственных препаратов, а также к фармакологии при испытан ях лекарственных препаратов, рекомендуемых для применения в коррекции одно-солевого и кислотно-щелочного балаНса организма.

Целью изобретения является повышение точности способа. способ осуществляется следующим об- . разом.

Для того, чтобы продемонстрировать предлагаемый способ и оценить его положительные стороны сравнительно с прототипом в условиях воздействия известных соленых растворов на морфологически интактные почки были выбраны две группы интактных животных для каждого примера. ланса организма. Сущность изобретения: получают срезы ткани почки, готовят окрашенный препарат для микроскопирования.

Дополнительно перед приготовлением препаратов проводят мацерацию части почечной ткани, отделяют собирательную трубку от вершины почечного сосочка до коркового вещества, измеряют длину ее коркового, наружного и внутреннего мозговых сегментов, затем на срезе ткани почки подсчитывают по периметру сечения трубки общее число главных и вставочных клеток, рассчитывают величину базальной части каждой клетки и количество клеток собирательной трубки по формуле, приведенной в описании. Способ позволяет более точно оценивать воэдействиелекарственных препаратов на водно-соМатериалом служили белые беспородные крысы-самцы весом 135 — 145 г. В каждом д примере 1-я группа интактных животных в количестве 10 служила контролем, 2-я группа интактных крыс в количестве 10 в каждом примере служила экспериментальной группой. Они получали на протяжении определенного времени хронического воздействия (в течение 20 сут, ежесуточно 2 раза) различ- 00 ные известные солевые растворы, широко применяемые s клинической практике.

Микродисекцию сегментов собирательных трубок проводили методом Гончаревской О.А. (197о), основанным на мацерации декапсулированноа почечной ткани в 18 ной соляной кислоте при температуре 37 C в термостате. Хорошей мацерации достигали через 2-3 ч, Затем почку тщательно промывали водопроводной водой, оставляли в воде на 2-3 ч при комнатной температуре, 1802318 после чего добавляли 5 — 20 капель 10 -ного раствора формалина на объем чашки Петри.

В этой среде почку сохраняли при 4 С в течение двух суток. Под стереомикроскопом тонкими стеклянными иглами изолировали собирательные трубки от вершины почечного сосочка до коркового вещества. Для оценки и определения длины сегментов и всей собирательной трубки в целом изолированные собирательные трубки переносили на предметные стекла, окрашивали гематоксилином. Фотографировали и зарисовывали при стандартных увеличениях. Длину (I) измеряли курвиметрией. Для каждого случая из одной почки изолировалось по 10 собирательных трубок.

Для морфометрических исследований кусочки почечной ткани, взятые при забое на

21 сутки экспериментального воздействия утром, натощак, фиксировались в забуференном 1,0. -ном растворе глютаральдегида с последующей дофиксацией в 1,0 -ном растворе осмиевой кислоты в фосфатном буфере с сахарозой (рН = 7,4; 0,1 M). После соответствующей проводки в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне их заливали в строгой поперечной ориентации в аралдит. Полутонкие срезы получали на ультратоме 1КВ-8801А, окрашивали 1,0%-ными водными растворами основного фуксина и метиленовой сини. На полученных препаратах морфометрическим методом определяли величину базальной части клетки в мкм (В), визуально подсчитывали количество клеток, полностью умещенных по периметру собирательной трубки в абс.ед, (и) в различных зонах почечной ткани, определяли длину сегмента собирательной трубки в мкм (I), а количество клеток собирательной трубки в абс,ед. по формуле:

А = — и.

Для подтверждения полученных результатов предлагаемым способом и сравнительной оценки со способом-прототипом был проведен дополнительный метод исследования. Для этого у животных всех групп за день до забоя в обменных клетках собирали суточную мочу для количественной оценки диуреза, показателя рН мочи, титруемой кислотности с помощью известного способа ацидометрического титрования и злектрометрической рН-метрии иономером универсальным Э В-74 с помощью 0,1 н. раствора NaOH до рН=7,4, Все полученные цифровые данные обрабатывали по методу вариационной статистики Фишера-Стьюдента. Различие опытных цифр с контролем считали достоверным, удовлетворяющие значения

Р<О,С5, Пример 1. 10-ти животным экспериментальной группы на протяжении 20 суток перорально дважды в сутки вводили в дозе

0,73 мл/100 r веса тела 7,47-ный водный раствор хлористого калия (KCI), применяемый в качестве диуретика и при коррекции

10 калиевого баланса в клинической практике.

В результате проведенного экспериментального воздействия в собирательных трубках почек, в корковых ее сегментах произошло достоверное уменьшение относи"5 тельной численности вставочных клеток (30.8 «-1,1 против 33,8 й0,8 в контроле, Р<0,05) и не менее достоверное увеличение относительной численности главных клеток (69,2+ 1 1 f п рpо тTи в 6666,2 + 0,7 в контроле).

В наружномозговых сегментах собирательных трубок обнаружено опять же достоверное уменьшение вставочных клеток (21,5 0,5 против 28,6 0.8 в контроле, Р<0,05) и достоверное увеличение главных клеток (78,5 +. 0,5% против 71,4 + 0,8о в контроле, Р<0,05).

B результате применения предлагаемого нового способа установлено, что на протяжении 20-дневного введения раствора

KCI произошло достоверное увеличение общей абсолютной численности клеток, выстилающих корковые и наружномозговые сегменты. Эти результаты дают основание того, что в результате проводимого воздей35 ствия солевой раствор увеличивает абсолютное количество клеток сегментов, В корковом сегменте количество клеток увеличивается достоверно (929,9 и 49,0 a6c,ед. клеток против 548,0 +. 14,0 абс.ед. в контро40 ле, Р < 0,05), что составляет прирост количества клеток примерно на 70 от исходного количества. В наружномозговых сегментах абсолютная численность клеток также возросла (475,0 + 20,0 абс.ед. клеток против

45 446,0 + 26,0 абс.ед. в контроле), что составляет прирост примерно на 7 от исходного количества, Из этих данных можно сделать вывод, что применяемый в данном случае

7,4 -ный раствор KCI известной дозы способствует адаптивной реакции собирательной трубки в виде абсолютной численности клеток.

Количество главных клеток корковых сегментов возрастает достоверно (643,0 +-28,0

55 абс.ед. против 363,0 + 11,0 абс,ед, в контроле, P < 0,05), что составляет прирост количества главных клеток примерно на 77 от исходного их количества. Это свидетельствует о том, что к 20 суткам эксперимента восполнив весь де1802318 фицит ионов К и CI в организме, избыточ+ ное количество К эффективно удаляется через главные клетки. Такая адаптивная реакция проявляется увеличением не только функциональных свойств главных клеток, но и увеличением их абсолютного количества.

Количество вставочных клеток в корковых сегментах увеличивается также достоверно по сравнению с контролем (286,0 и 23,0 абс.ед, клеток против 185,0 + 5,0 абс.ед. в контроле, P < 0,05). Увеличение абсолютной численности вставочных клеток в корковых сегментах связано с вытеснением ионов

НСОэ из крови избыточно поступающими онами СГ, что является адаптивной реакцией вставочных клеток корковых сегментов, 1

Направленной на сохранение кислотно-щелочного баланса. Это объяснение подтверждается далее анализом данных рН мочи и титруемой кислотности, Сравнение результатов, полученных с помощью способа-прототипа и предлагаемым способом, показывает, что оба способа ают прямо противоположные результаты в орковом сегменте собирательных трубок. =сли прототип обнаружил достоверное меньшение относительного числа вставочых клеток, то предложенный нами способ выявляет достоверное увеличение их абсолютной численности, Большая точность результатов, полченных предложенным нами способом, равнительно с прототипом, подтверждается результатами, полученными при определеНии суточного диуреза, рН мочи и титруемой кислотности, На 20 сутки эффективно проявляется диуретический эффект солевого раствора (19,5 1,0 мл мочи против 13,0 +. 0,5

Мл в контроле, Р<0,05). Показатель рН мочи тановится нейтральным (7,01 + 0,05 против ,86 +. 0,05 в контроле, P 0,05). Это свидетельствует о секреции НСОэ -ионов вставочйыми клетками корковых сегментов.

1итруемая кислотность резко падает сравниТельно с контролем (0,042 0,004 моль/сутки против 0,320 + 0,007 ммоль/сутки в контроле, при расчете на 1,0 мл мочи 0,0022 = - 0,0002 смоль/мл против 0,025 - 0,001 ммоль/MR в контроле, P<0,05). Понижениетитруемой кислотности отражается понижением абсолютной численности вставочных клеток наружномозговых сегментов, Следовательно, предлагаемый способ оценки воздействия является более точным сравнительно с и рототипом.

Таким образом, водный раствор КС! проявляет максимальную функциональную активность собирательных трубок в корковых ее сегментах, где общее количество клеток возрастает достоверно. В отличие от корковых сегментов, в наружномоэговых сегментах солевой раствор способствует

5 подавлению подкисляющей способности вставочных клеток, что дает основание для более корректного выбора способа лечения при различных нарушениях кислотно-щелочного баланса.

10 Пример 2, Раствор гидрокарбоната калия (КН СОз) также используется в клинике для коррекции водно-солевого и кислотнощелочного баланса при различных заболеваниях.

15 Проведем сравнительный анализ влияния раствора КНСОэ на клетки собирательных трубок способом-прототипом и предложенным нами способом. 10-ти животным экспериментальной группы на протя20 жении 20-ти дней перорально дважды в день вводили 10%-ный раствор КНСОэ в дозе 0,73 мл/100 грамм веса тела. Через 20 дней от начала опыта животных забивали и в их почках проводили исследования, 25 В связи с проведенным экспериментом в корковых сегментах собирательных трубок достоверно увеличивалась относительная численность вставочных клеток (38,7 + 0,6 против 33,8 + 0,7% в контроле, Р<0,05), и

30 достоверно уменьшение относительной численности главных (61,3 +. 0,6% против

66,2 +.0,7% в контроле, Р<0,05). В наружномозговых сегментах собирательных трубок произошло уменьшение относительной чис35 ленности вставочных клеток (26,0 + 0,6% против 28,6 +. 0,8 в контроле, Р<0,05) и увеличение главных (74,0 + 0,6% против

71,4 0,8 в контроле, Р<0,05), В результате применения предлагаемо40 го способа установлено, что на протяжении

20-дневного введения раствора КНСОз произошло достоверное увеличение общей абсолютной численности клеток, выстилающих корковые и наружномозговые сегмен45 ты. Эти данные свидетельствуют о том, что солевые растворы, содержащие ионы К, способствуют проявлению адаптивной ре4 акции собирательных трубок с увеличением их функциональной активности и абсолют50 ного количества клеток, ее выстилающих. С помощью разработанной формулы подсчитано, что в корковых сегментах общее абсолютное количество клеток увеличивается достоверно (867,0 546,0 абс.ед, клеток против 548,0 14,0 абс.ед. в контроле, Р 0,, 05),,что составляет прирост количества клеток примерно на 60 от исход-ного количества. В наружномозговых сегментах общее абсолютное количество клеток по

1802318

А= — n, B

Таблица 1

Показатели относительной численности (e ) главных клеток и вставочных клеток собирательных трубок почек в контроле и при введении раствора КС! сроком 20 дней (по прототипу) (и = 10) сравнению как с контролем, так и с предыдущим примером возрастает больше. Этот показатель по сравнению с контролем составляет прирост 447, а по сравнению с аналогичным показателем предыдущего примера в 6 раз больше.

Количество главных клеток в корковых сегментах в отличие от показателей их относительной численности достоверно увеличивается (532,0 «+ 33,0 абс.ед. клеток против 363,0 +é 11,0 абс.ед. в контроле, Р<0,05), прирост которого по сравнению с исходным уровнем составляет примерно

50 . Эти показатели объективно разъясняют тот факт, что избыточное содержание ионов К эффективно удаляется не только увеличением функциональной активности, нр и соответствующим абсолютным количество главных клеток корковых сегментов.

Количество вставочных клеток корковых сегментов также достоверно увеличивается (335,0 22,0 абс.ед, клеток против 185,0 и 5,0 абс.ед. в контроле, Р<0,05), и прирост составляет примерно 81 по сравнению с исходным уровнем. Этот прирост отражает повышение функциональной активности вставочных клеток в наружномозговых сегментах (166,0 +. 7,0 абс.ед. клеток против

128,0 + 6,0 абс.ед. в контроле, Р<0,05) дает прирост количества клеток примерно на

30 . Это увеличение является адаптивной реакцией вставочных клеток на бикарбонат+ ный диурез, проявляющейся секрецией Нионов этими клетками с целью понижения концентрации избыточного НСОз в нижележащих отделах мочевыводящих путей и выделением его в виде СО и Н20. Эти данные подтверждаются результатами, полученными прй определении суточного диуреза, рН мочи и титруемой кислотности. Суточный диурез к 20 дню эксперимента увеличивается (1 6,9 + 0 5 мл против 13 0 и 0,5 мл в контроле, P<0,05). Показатель рН мочи характеризуется защелачиванием (8,59 + 0,08 против

5,86 0,05 в контроле, Р<0,05), титруемая кислотность полностью отсутствует.

Таким образом, из примеров, приведенных для объективного обоснования полученных данных новым предлагаемым способом оценки воздействия лекарствен5 ного препарата на водно-солевой и кислотно-щелочной баланс, можно сделать вывод, что предлагаемый способ оценки является наиболее точным (см.табл.1 — 6).

Способ отвечает цели изобретения и

10 способствует получению наиболее информативной характеристики о функциональном состоянии собирательных трубок.

Формула изобретения

Способ оценки воздействия лекарст15 венных препаратов на водно-солевой и кислотно-щелочной баланс, включающий получение срезов ткани почки, приготовление окрашенного препарата для микроскопирования с последующим подсчетом числа

20 клеток и оценкой воздействия лекарственных препаратов по количеству главных и вставочных клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, перед приготовлением препаратов допол25 нительно проводят мацерацию части почечной ткани, отделяют собирательную трубку от вершины почечного сосочка до коркового вещества, измеряют длину ее коркового, наружного и внутреннего мозговых сегментов, 30 затем на срезе ткани почки подсчитывают по периметру сечения трубки общее число главных и вставочнь|х клеток, рассчитывают величину базальной части каждой клетки и количество клеток собирательной трубки по

35 формуле

40 где А — абсолютное количество клеток; ! — длина сегмента собирательной трубки, мкм;

n — количество клеток на поперечном сечении собирательной трубки;

45  — величина базальной части клетки, мкм.

1802318

Таблица 2

Показатели абсолютной численности (в абс. ед,) клеток сегментов собирательных трубок почек в контроле и при введении раствора KCI сроком 20 дней (по предлагаемому способу) (n = 10) Таблица 3

Показатели диуреза, рН мочи и титруемой кислотности в контроле и при введении раствора KCI сроком 20 дней (аналог, биохимический метод исследования), (n = 10) — достоверные различия по сравнению с контролем, P 0,05

Таблица 4

Показатели относительной численности (в 7) главных и вставочных клеток собирательных

i трубок почек в контроле и при введении раствора КНСОз сроком 20 дней (по прототипу) (n = 10) Таблица 5

Показатели абсолютной численности (в абс. ед.) клеток сегментов собирательных трубок почек в контроле и при введении раствора KHCOj сроком 20 дней (по предлагаемому способу) (n = 10) 1802318

Таблица 6

Показатели диуреза, рН мочи и титруемой кислотности в контроле и при введении раствора КНСОз сроком 20 дней (аналог, биохимический метод исследования) (n = 10) Составитель P.O.ÌóðàòîâРедактор В.Трубченко Техред М.Моргентал Корректор fl.Геp

Заказ 847 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. ужгород, ул.Гагарина, 101