Способ селективного определения биогенных порфиринов

 

Способ селективного определения биогенных порфиринов предусматривает обработку образца и последующее определение отдельных порфиринов или групп порфиринов по люминесценции с использованием стандартов. Образец обрабатывают раствором соли Pd (II) таким образом, чтобы полностью перевести находящиеся в нем порфирины в палладиевые комплексы. Определение ведут путем измерения фосфоресценции полученного после обработки раствора в присутствии сульфита или сульфита натрия в конечной концентрации 5-15 мг/Мл при рН 6,5-7,5 в присутствии добавок поверхностно-активных веществ (ПАВ) и без ПАВ, после чего по результатам нескольких измерений рассчитывают концентрации определяемых порфиринов. 1 з.п.ф-лы, 1 табл. ел с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sl)s G 01 N 21/64

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4869584/25 (22) 28.09.90 (46) 23.03.93. Бюль 11 (71) Институт биохимии им.А.H.Баха, Совместный советско-вьетнамский научно-исследовательский тропический центр при

Институте эволюционной морфологии и экологии животных им.А.Н.Северцова (72) Д.Б.Папковский, А.П.Савицкий, Г.В.Пономарев, С.П.Позняков и В.С.Румак (56) Авторское свидетельство СССР, Ь 1755130, кл. 6 01 И 21/64, 1990.

LIm С. К. High-perfomance liquid

Chromatography of рогйг!пз. Journal of

©hromatography, 1988, v.429, р123. (54) СПОСОБ СЕЛЕКТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОГЕННЫХ ПОРФИРИНОВ (57) Способ селективного определения биогенных порфиринов предусматривает обра.Изобретение относится к способам определения порфиринов и может быть испрльзовано в медицине, биотехнологии, бИохимических исследованиях.

Целью изобретения является упрощенИе способа селективного определения порфиринов, ускорение и повышение чувствительности анализа при определении прото-, копра- и уропорфиринов.

Поставленная цель достигается тем, что анализируемые растворы биологических жидкостей, содержащие данные порфирины или их смеси, обрабатывают солями двух валентного палладия таким образом, чтобы количественно перевести все содержащиеся в них порфирины и их палладиевые ком,, Я „, 1803832 А1 ботку образца и последующее определение отдельных порфиринов или групп порфири- нов по люминесценции с использованием стандартов. Образец обрабатывают раствором соли PcI (П) таким образом, чтобы полностью перевести находящиеся в нем порфирины в палладиевые комплексы, Определение ведут путем измерения фосфоресценции полученного после обработки раствора в присутствии сульфита или сульфита натрия в конечной концентрации 5-15 мг/мл при рН 6,5 — 7,5 в присутствии добавок поверхностно-активных веществ (ПАВ) и без ПАВ, после чего по результатам нескольких измерений рассчитывают концентрации определяемых порфиринов. 1 з.п.ф-лы, 1 табл., QQ плексы, после чего определяют содержание С порфиринов по фосфоресценции их Pd-комплексы в водных растворах с использованием добавок различных поверхностно активных веществ (ПАВ), Сд

Pd-порфирины обладают способностью Я интенсивно фосфоресцировать в водных растворах при комнатной температуре, причем квантовые выходы фосфоресценции Pdпорфиринов (порядка 0,1 — 0,2) выше, чем квантовые выходы флуоресценции соответствующих порфиринов (соответственно порядка 0,05-0,1), Более того, длительная люминесценция Pd-порфиринов (времена свечения порядка 1 мс) и спектральные свойства оптимально подходят для их селек1803832 тивного определения в сложных биологических системах с рекордно высокой чувствительностью методом импульсной флуориметрии с миллисекундным временным разрешением. Эти соединения, в частности, нашли применение для ковалентного маркирования антигенов и антител в фосфоресцентном иммуноанализе.

Добавки ПАВ влияют на фосфоресценцию Pd-порфиринов. Взаимодействие соединений порфириновой природы с различными типами ПАВ различается. Поэтому ПАВ влияют по-разному на фосфоресценцию различных Pd-порфиринов.

Используя эти различия, можно подобрать

ПАВ таким образом, что, измерив интенсивности или времени жизни фосфоресценции растворов, содержащих смеси Pd-порфиринов, в присутствии добавок различных ПАВ и без ПАВ, можно рассчитать содержание отдельных компонентов (индивидуальные порфирины или группы порфиринов). Для определения, например, трех различных порфиринов (или групп порфиринов) достаточно провести измерения фосфоресценции в трех различных системах. В данном случае это были буфер без ПАВ, буфер с добавкой 0,5,, Тритона X-100 (неионогенный ПАВ) и буфер с добавкой 1 MM цетилтриметиламмоний бромида (катионный

ПАВ), При этом, что метод не универсален и применим лишь к определенным образцам, содержащим не очень сложные смеси порфиринов (2 — 4 компонента). Однако он хорошо подходит для первичного анализа образцов мочи, крови, экстрактов тканей, кала. Он позволяет существенно ускорить процесс первичного скрининга большого числа образцов (более 100 анализов в час), сделать его технологичным и автоматизированным. Выявленные образцы с аномальным распределением порфиринов далее могут исследоваться более подробно другими методами, в частности, хроматографическими (ВЭЖХ, ТСХ), Способ иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Получение палладиевых комплексов порфиринов. К 1 мл растворов копропорфиринаl,копропорфиринаill,уропорфирина Н! или протопорфирина 1Х (концентрация 1 — 100 нМоль/л) в 0,05 M ацетатном буфере, рН 5,0, добавляли 0,01 мл раствора РоС6 в 0,01 M HCI, и инкубировали на водяной бане при 80 С 5 мин. Затем растворы охлаждали и добавляли 0,1 мл водного раствора сульфита натрия (100 мг/мл), при этом рН системе устанавливался в районе 6.5 — 7,5. Записывали спектры люминесценции растворов на спектрофлуориметре

LS--50 (Perkin Elmer) в диапазоне длин волн

550 — 750 нм при возбуждении на длине волны 395 нм, Исчезновение полос флуоресценции порфиринов (в области 620 нм) и появление полос фосфоресценции Pd-rtopфиринов (в области 670 нм) в спектрах люминесценции свидетельствует о том, что ! порфирины полностью переходили в форму

10 палладиевых комплексов.

Процесс имеет оптимум по концентрации соли палладия в области 20-500 мкМ

Pd . Эта концентрация является предпочтительной.

Скорость включения палладия в порфирины зависит от температуры инкубации,Снижение температуры требует увеличения времени инкубации. Например, для температуры 37 С для полного перехо20 да порфиринов в палладиевые комплексы составляет более 2 часов. Предпочтительные условия — 2 — 15-минутная инкубация при

60 — 8 С, В ацетатном буфере включения палла25 дия в порфирины проходит лучше, чем в цитратном. Изменение рН буферного раствора в диапазоне 3 — 6 не имеет существенного влияния на процесс.

Измерение высокотемпературной фос30. форесценции Pd-порфиринов в различных буферных системах, содержащих ПАВ. После превращения порфиринов в палладиевые комплексы и добавления сульфита натрия (см.пример 1) измеряли интенсив35 ность фосфоресценции растворов без ПАВ и в присутствии добавок ПАВ, Спектры возбуждения и эмиссии, а также кинетики затухания фосфоресценции растворов

Pd-производных различных порфиринов в

40 присутствии различных ПАВ и без ПАВ записывали на люминесцентном спектрометре LS-50 (Perkln Elmer, Англия).

Измерение, интенсивности люминесценции проводили в режиме "Фосфорес45 ценция" в условиях оптимума свечения

Pd-порфиринов. Оптимальные условия измерения следующие: возбуждение при 395 нм, регистрация при 667 нм время задержки после вспышки — 10-300 мкс; время счета—

50 500 — 5000 мкс; время накопления сигнала—

1-10 сек.. Измерения проводили в трех буферных системах: 1) система без добавок ПАВ; 2) то

55 же с добавкой 0,57ь Тритона Х-100 (ТХ-100, неионогенный ПАВ); 3) то же с добавкой 1 мМ цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ, катионный ПАВ).

Анионные ПАВ (типа додецилсульфата . натрия) как правило слабо вэаимодеиствуют

1803832 с поликарбоксильными биогенными порфиринами из-за электростатических затруднений и поэтому слабо влияют на фосфоресцентные свойства, Параметры фосфоресценции различных 5

Pd-порфиринов в присутствии различных типов ПАВ, а также "удельные" интенсивности фосфоренсценции различных порфиринов в различных ПАВ приведены в таблице.

Видно что, в отличие от свободных пор- 10 фиринов, спектры возбуждения и эмиссии

Pd-порфиринов практически идентичны. В то >ке время интенсивности и время фосфоресценции порфиринов в различных буферных системах значительно различаются {для 15 одного и того же порфирина и между различными порфиринами или группами порфиринов, Такая особенность дает возможность, измеряя в одних и тех же условиях интенсивности и/или времена жиз- 20 ни фосфоресценции растворов, содер>кащих смесь порфиринов, в присутствии добавок различных ПАВ, рассчитать концентрации и/или соотношение отдельных компонентов. 25

В описанных условиях чувствительность детекции Pd-порфиринов составляет порядка 0,1 пикомоль/л, Максимальная чувствительность достигается в растворе с

0,5% Тритона Х-100, поскольку в этом рас- 30 творе порфирины фосфоресцируют наиболее интенсивно. Для способа-прототипа чувствительность составляет !О пмоль/л.

Пример 2. Селективное определение порфири нов в их смесях, В и робирки, содер- 35 жащие 1 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН

5,0, 0,1 мМ PdClz, добавляют по 0,05 мл исследуемых образцов, содержащих известные концентрации копропорфиринов и уропорфиринов, и обрабатывают, как опи- 40 сано в примере 1, При этом порфирины переходят в форму Pd-комплексов, Из каждой пробирки отбирают 2 пробы по 0,3 мл и переносят в полистирольные пробирки на 0,5 мл (СПп!соп), В первые про- 45 бы добавляют 0,02 мл 10 мМ раствора ЦТАБ, а во вторые — по 0,02 мл 5 раствора Тритона X — 100. После этого измеряют интенсивности фосфоресценции всех проб в условиях, описанных в примере 2, и по ре- 50 эультатам двух измерений рассчитывают концентрации порфиринов в образцах. Для этого решается система линейных уравнений с двумя неизвестными — определяемые концентрации копропорфиринов и уропор- 55 фиринов: (КП) Ь2 — а1*Ь2 а1 Ьг — а2*Ьг 1* 1 — а2*11 а1 Ь2 — az*b1

Коэффициентами уравнений служат

"удельные" интенсивности фосфоресценции копропорфиринов (а1 и а2) и уропорфиринов (b! и b2) в растворах TX — 100 и ЦТАБ, соответственно (см.Таблицу 1), определенные ранее в примере 2. Результаты селективного определения порфиринов соответствуют заданным значениям.

Аналогичным образом могут быть определены порфирины в тройных смесях (копро-, уро- и протопорфирин), проводя для этого измерения фосфоресценции в трех буферных системах: без добавок измерения фосфоресценции в трех буферных системах: без добавок ПАВ, с добавкой 0,5 ТХ вЂ” 100 и . с добавкой 1мМ ЦТАБ. Расчет концентраций компонентов осуществляют известным матричным методом решения систем линейных уравнений. Расчеты легко автоматизируются использованием ЭВМ.

Производительность способа — около

100 образцов в час.

Пример 3. Определение порфиринов в моче, Способ осуществляют аналогично .примеру 2, используя в качестве образцов

0,05 мл мочи, По результатам измерения в трех буферных системах рассчитывают концентрации порфиринов в пробах.

Пример 4. Способ проводят аналогично примеру 1, но вместо хлорида палладия используют.ацетат палладия в той же концентрации. Результаты не изменяются.

Пример 5. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубируют 10 мин при.

60 С, Результаты не изменяются.

Пример 6. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубируют с солью палладия 2 часа при 37 С. Результаты не изменяются.

Пример 7. Способ проводят аналогичного примеру 1, но вместо сульфита натрия используют бисульфит натрия в той же концентрации 100 мг/мл, контролируя, чтобы после его добавления рН раствора был в районе 6,5 — 7,5. Результаты не изменяются.

Пример 8. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо 1 мМ рас- . твора ЦТАБ используют 1 мМ цетилпиридиний бромид (катионный ПАВ), Результаты аналогичны.

Пример 9, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо 0,5 раствора Тритона X — 100 используют 0,5 раствора Твина — 20. Результаты аналогичны.

1803832

Люминесцентные свойство некоторых Pd — порфиринов. макс. фосф.

/нм/! ад /ед/

Т> /мс/

ПСРФИРИН Буферная сисмакс, возб.

/нм/ тема

0,16

АБ прото IX

0,40

0,74

0,49

АБ-TX

2,40

0,63

АВ-ЦТАБ

АБ

0,29

1,20 копро!

14,10

1,01

АБ-TX

АВ-ЦТАБ

0,48

7,0

1,30 копро ill

0,28

АБ

13,00

1,19

АБ-ТХ

0,46

АВ-ЦТАБ

АБ

4,0 уро 1, III

8,10

0,51

0,56

15,10

АБ-TX

АВ- ТАБ

19,5

0,71

Тр-время жизни фосфоресценции; !ад — удельная интенсивность фосфоресценции 1 нМ раствора порфирина.

АБ-ацетатный буфер (0,05 M ацетат, 10 мг/мл сульфита натрия рН 7,0); АБ — ТХ-буфер АБ, содержщий 0,5 7;. Тритона Х-100; АБ — ЦТАБ — буфер АБ содержащий 1 мМ цетилтоиметиламмоний бромида.

Пример 10. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо I мМ раствора ЦТАБ используют 0,1 мМ ЦТАБ. Результаты не изменяются, Таким образом, способ позволяет быст- 5 ро и с высокой производительностью проводить анализ на содержание порфиринов в биологических образцах (моча, экстракты крови, тканей, кала и т,п.) с целью выявления нарушений порфиринового обмена. 10

Ф о р мул а из обрете н и я

1. Способ селективного определения биогенных порфиринов, включающий обработку образца химическим реактивом в растворе, возбуждение и регистрацию 15 люминесценции порфиринов, по которой проводят определение их концентраций, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности, упрощения и ускорения, анализа, образец обрабатывают в буфере с 20 рН 3-6.избытком растворимой соли палладия Pd (И) при 37-100 С до полного превращения. порфиринов в их палладиевые

392

392

393

392

393

392

392

295 комплексы, проводят измерение фосфоресценции полученного раствора в присутствии сульфита или бисульфита натрия в конечной концентрации последнего 5 — 15 мг/мл при рН 6,5 — 7,5 при последовательном введении в раствор неионогенного поверхностно-активного вещества и катионного поверхностно-активного вещества и беэ введения в раствор поверхностно-активного вещества и по результатам измерений рассчитывают концентрации порфиринов матричным методом решения систем линейных уравнений, 2. Способ поп1, отл ича ющийся тем, что обработку образца, содержащего смесь протопорфирина, копропорфиринов и уропорфиринов ведут в ацетатном буфере в присутствии 20-500 мкмоль Pd (ll) в течение 2 — 15 мин при 60 — 80 С, а в качестве поверхностно-активных веществ используют Тритон X-100 в конечной концентрации

0,2-1% и цетилтриметиламмоний бромид в конечной концентрации 0,1 — 10 ммоль, 667

667

667

667

667

667

667

667

667

667

667

667