Штамм дрожжей candida ufilis - продуцент белковой биомассы

 

Использование: микробиологическая промышленности: получение биомассы и новый штамм дрожжей для получения биомассы . Сущность изобретения: штамм дрожжей Candida ufills получен в процессе селекции. Штамм имеет продуктивность 4,36 , удельная скорость роста 0,48 ч при непрерывном культивировании в режиме РН-стата. При культивировании на этаноле накопление биомассы на уровне 10,2-13,2 г/л, выход биомассы от заданного эталона 71,8-77% при содержании протеина 58,1 -63,9 %. 11 табл. d 00 Ю

t

ТГ

Is

i-H

00

Формула изобретения

D

tf

Предлагаемое изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой новый штамм дрожжей, который может быть использован для получения кормовых дрожжей на основе этанола. виноматериалов, а также гидролизатов Сёльекохозяйстве нных отходов (древесины, хлопковой шелухи и др.).

Цель .изобретения заключается в селекции высокопродуктивного непатогенного нового штамма дрожжей, по систематическому положению относящегося к Candida uftlis, конкурентоспособного на международном рынке и активно растущего при температуре 32-34°С, которая является регламентной по технологии производства кормовых дрожжей, т.е. штамма, обладающего мезофильными свойствами, но характеризующегося высоким выходом биомассы и высоким содержанием белка в готовом продукте при культивировании при температуре 32-40°С на среде с этанолом и отличающегося относительно крупными размерами клеток, что способствует снижению потерь при выделении биомассы, а также высокой конкурентоспособностью. Постановка данной задачи обусловлена современными ужесточенными требованиями , направленными на обеспечение экологически безопасного производства, одной из гарантий этого служит применение мезофильных штаммов дрожжей, характеризующихся большей стабильностью в сохранении признака отсутствия патогенности в условиях длительных нестерильных процессов непрерывного культивирования .

Истинно термотолерантные штаммы, имеющие оптимальную температуру роста повышенную (37-42°С), обладают большей мутабельностью, что с большей вероятностью может приводить к образованию патогенных форм дрожжей. Кроме того, ведение процесса культивирования при повышенной температуре сопровождается развитием в биоценозе сопутствующей бактериальной микрофлоры санитарно-гигиенической группы, не допустимой по существующим санитарным нормативам и действующим на заводах технологическим регламентам.

Изобретение заключается в том, что предлагаемый штамм получен в процессе селекции при испытании около 100 дрожжевых штаммов музейной коллекции института ВНИЙсинтезбелок в .условиях непрерывного процесса культивирования на среде с этанолом в режиме хемостэта и рН-стата с последующим испытанием штамма в модельных, камерных и опытно-промышленных условиях, имеющих оптимальную температуру роста 32-34°С, но характеризующихся способностью роста в широком диапазоне температур (32-40°С) с

сохранением показателей по скорости роста , накоплению биомассы и содержанию сырого протеина.

Предлагаемый штамм может быть использован для получения белковой биомассы не только на основе этанола, но и на основе гидролизатов древесины и виноматериалов .

В результате проведенных исследований выявлено, что активность роста штамма

5 ВСБ-726, т.е. накопление биомассы в модельных опытах (в качал очных колбах) на минеральной среде с 1 % этанола с добавлением факторов роста - дрожжевого автолизата и без него - при температуре роста

0 32-40°С через 18 ч культивирования, составляла 6,,3 г/л; для штамма-прототипа ВСБ-825 в тех же условиях 4,8-3,5 г/л; для известного мезофильного штамма Candida ufllls ВСБ-651 и термотолерантного

5 штамма Candida krusei ВСБ-896 4,1-5,6 и 3,6-1,9 г/л соответственно (см. табл.1).

Обращаем внимание на то. что новый штамм ВСБ-726 не нуждается в дополнительных факторах роста (дрожжевом авто0 лизате), тогда как рост штамма-прототипа ВСБ-825 зависит от наличия в среде дополнительных факторов роста. Последнее является существенным для условий производства,, поскольку снижает себестои5 моеть продукта за счет меньших затрат на дефицитные реактивы.

Проведены испытания штамма ВСБ-726 в модельных опытах при высоком содержании этанола в среде, т.е. в условиях высокой

0 плотности популяции. Последнее является чрезвычайно важным для условий промышленной ферментации, так как ведение процесса культивирования с высокой концентрацией биомассы в ферментере пс5 эволит обеспечить значительное повышение съема биомассы с единицы объема.

По данным табл.2 новый штамм ВСБ- 726 способен расти при плотности популяции 23-28,8 г/л (по сухому весу дрожжей),

0 обеспечивая наибольший выход биомассы 73,3-84,6% при переработке 2.5-4,5% этанола в среде. Штамм ВСБ-651 в аналогичных условиях (2.5-4.5% этанола) имел плотность популяции 12,9-26,4 г/л (т.е. на

5 2.4-10 г/л Меньше штамма ВСБ-726) при выходе биомассы 66,2-76,2% (т.е. на 6.9- 8.4% меньше штамма ВСБ-726).

Штамм-прототип ВСБ-825 при переработке 4,5-6,5% этанола в среде резко снижает активность роста до 17.7-8,3 г/л (т.е.

на 11,1-17,9 г/л меньше штамма ВСБ-726) при выходе биомассы 56.2-11,8% (т.е. на 25,9-39,7% меньше штамма ВСБ-726).

Аналогичные результаты получены при испытании культур в режиме хемостата при концентрации этанола 4 и 6% (см. табл.3).

Штамм дрожжей ВСБ-726 испытан в камеральных условиях стерильного процесса непрерывного культивирования в режиме рН-стата в сравнении с прототипом и известными мезофильными и термотолерантными штаммами дрожжей при оптимальной для каждого штамма температуре роста 34 ±0,5 и 39± 0.5°С) и концентрации этанола в минеральной среде 10-1-2 г/л.

Согласно полученным результатам, представленным в табл.4, новый штамм ВСБ-726 имел наибольшие продуктивность (4,36 г/л) и выход биомассы (56%) по сравнению со штаммом ВСБ-825, для которого данные показатели составили 2,93-3,1 г/л ч и 50-52% соответственно. В сравнении с термотолерантными штаммами, в том числе прототипом, новый штамм ВСБ-726 характеризовался сохранением практически такой же высокой удельной скорости роста (0,48 ), что и штаммы ВСБ-825 (0,52 ) и ВСБ-896 (0,5 ). Известный мезофильный штамм ВСБ-651 имел меньшую удельную скорость роста (0.43 ).

Штамм дрожжей ВСБ-726 испытан в камеральных условиях периодического культивирования при температуре 32-40°С. При этом выявлено (табл.4), что новый штамм ВСБ-726 активно растет в широком диапазоне температур (32-40°С), обеспечивая накопление биомассы на уровне 10.2-13,2 г/л, выход биомассы от заданного этанола 71,8- 77,0% при содержании сырого протеина в биомассе 58.1-63,9%; удельная скорость роста штамма составила 0,33-0,38 . Мезофильный штамм ВСБ-651 в данных условиях культивирования имел следующие показатели: накопление биомассы 1.5-9,1 г/л, выход биомассы 40-74%, содержание сьТрого протеина 56-60%. удельная скорость роста 0.13-0,33 , т.е. даже при оптимальной температуре роста штамм ВСБ-651 имел худшие показатели по сравнению со штаммом ВСБ-726. При повышении температуры процесса культивирования до 37- 39°С штамм ВСБ-651 резко снижает перечисленные показатели при температуре роста 40°С штамм ВСБ-651 практически не растет.

Известный термотолерантный штамм C.krusel ВСБ-896 в данных условиях процесса культивирования также имел более низкие показатели по сравнению с новым штаммом ВСБ-726 (см. табл.5).

Проведены сравнительные испытания в 3-кратной биологической повторности в камеральных и стерильных условиях непрерывного процесса культивирования в режиме хемостата при температуре 32- 34°С, рН среды 4,2, скорости потока 0,25 , концентрации этанола 2%. Как видно из табл.6, предлагаемый штамм ВСБ-726 обеспечивал выход биомассы от заданного этанола в среднем 73% при содержании протеина (сырого) в биомассе 62,3%. Мезофильный штамм ВСБ-651 в данных условиях культивирования имел выход биомассы 70,3%, содержание сырого протеина в биомассе 58.3%. Штамм ВСБ-726 также испытан на других источниках углерода - виноматериалах и гидролизате древесины.

Согласно данным табл.7 новый штамм ВСБ-726 в модельных опытах в качалочных колбах при температуре роста 32-34°С на минеральной среде с виноматериалами через 24 ч и 36 ч выращивания обеспечивал накопление биомассы 8.1-9,1 отн.ед. опт.пл. Мезофильный штамм ВСБ-651 в этих условиях имел 6,8-6,9 отн.ед.опт.пл., i звестный термотолерантный штамм ВСБ-896 6,1 и 6,6 отн.ед.опт.пл.

Штамм ВСБ-726 далее был испытан в камеральных условиях нестерильного непрерывного процесса культивирования в режимах хемостата в аппарате Абитекс при температуре 34 ±0,5°С. скорости роста 0, на минеральной среде с виноматериалами , этаноле и смеси виноматериэлов и этанола, сбалансированных в пересчете на абсолютный алкоголь, составивший 24,0%. Было показано, что наибольший выход биомассы (83,5%) достигался в процессах культивирования на виноматериалах, наименьший (61.2%) на этзноле - ректификате . На субстрате, представляющем смесь виноматериалов и зтанола. выход биомассы составляет 63-68,0% в зависимости от количества добавляемого этанояа (75-90%) (см. табл.8).

Накопление биомассы нового штамма ВСБ-726 ка гидролизате древесины при испытании в модельных опытах в качалочных колбах при температуре 37°С и содержании в минеральной среде редуцирующих веществ (РВ) 1,45% составило 7,7 г/л; штамма ВСБ-651 3,1 г/л (см.табл.9).

Изучены культурально-морфологические и физиолого-бсюхимические свойства штамма ВСБ-726. Морфологические признаки: клетки в односуточной культуре на глюкозопептонной среде одиночные, овальные или удлиненно-овальные и образуют веточки и короткие цепочки. Размер клеток в

односуточной культуре в жидком сусле 3,5- 7.0 х 7,0-13 мкм. Почкование полярное. В промышленных непрерывных условиях культивирования на минеральной среде с этанолом размер клеток в среднем 5,0-9,0 мкм. Аскоспоры не образует. На кукурузном агаре образует слаборазвитый примитивный псевдомицелий, состоящий из ветвящихся цепочек, коротких псевдогиф и овальных клеток. В солодовом сусле (3-30 сут) кольца и и пленки не образует. Осадок мутный кремового цвета. Культуральные признаки: колонии на солодовом сусле-агаре (7 сут) крупные, слабовозвышающиеся с гладкой поверхностью, ровным краем, сероватые . Центр колонии часто приподнят в виде бугорка, могут появляться колонии с мелкоморщинистой поверхностью. Штрих на солодовом сусле-агаре гладкий, сероватый со временем до кремового, слабо блестящий , может быть и слабо складчатым. Физиологические признаки: ассимилирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, раффинозу, мелмцмтозу. инулин, ксилозу, глицерин, маннит, салицин, метмл- D-глюкозу (слабо), уксусную, молочную, янтарную и лимонную кислоты. Сбраживает: глюкозу, сахарозу, раффинозу. Не сбраживает: мальтозу, галактозу, лактозу, мелеци- -озу, целлобиозу. В качестве азота использует нитратные и аммонийные соли (например, азотнокислый натрий сернокислый аммоний и др.). Хорошо растет на стандартных синтетических питательных средах без добавления факторов роста (среда Ридер, Миллера, Сабуро и др.). В качестве нетрадиционных источников углерода и энергии использует этанол, водно-спиртовой конденсат, виноматериалы, послеспиртовую бзрду, уксусную кислоту, гидролизаты сельскохозяйственных отходов , а также продукты метаболизма углеводородокисляющих дрожжей.

Штамм хранят в лиофилизированном состоянии или на сусле-агаре под слоем вазелинового масла при комнатной температуре . Периодичность пересевов в последнем случае 3-4 раза в год. Рабочие культуры штамма дрожжей поддерживают путем посева в пробирках (косяках) на сусле-агаре , культивированных при температуре 32-34°С в течение двух суток с последующим хранением при комнатной температуре.

Биохимический состав дрожжевой биомассы штамма ВСБ-726: содержание сырого протеина 59-63%. липидов 7,1-7.4%, золы 8.7-9.2. нуклеиновых кислот 7,4-9,9%. влаги 2,4-4,3. Аминокислотный состав истинного белка представлен в табл.10.,

Сумма насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в составе липидов составляет 18.9 и 72,2 отн.% соответственно (в том числе С16 и Cis 18,9 и 72.2%).

П р и м е р 1. Дрожжи Candida ufllls ВСБ-726 выращивали в аппарате интенсивного массообмена емкостью 5 л на минеральной среде без ростовых факторов при температуре 32-23°С и рН 4,0-4.3 в непре0 рывном режиме. В качестве источника углерода использовали этанол в количестве 3 об.%: скорость протока составляла 0,20 . Состав питательной среды, г на 1 л: Калий хлористый0.7

5 Фосфорная кислота (70%)0,7 Сернокислый аммоний 1,0 Сернокислый магний 0,4 Сернокислое железо 0,04 Сернокислый цинк 0,02

0 Сернокислый марганец0,02

Выход абсолютно сухой биомассы от заданного этанола 75%, содержание сырого протеина в биомассе 62%. продуктивность 3.51 г/л-ч.

5 П р и м е р 2. Дрожжи Candida ufllls ВСБ-726 выращивали в аппарате емкостью 30 л в условиях, описанных в примере 1. В качестве источника углерода использовали этанол в количестве 2-2,5 об.%; скорость

0 протока составляла 0,33 ч 1; рН среды 5.5 Выход абсолютно сухой биомассы от заданного этанола составил 73%, содержание сырого протеина в биомассе 62%, продуктивность 3,76 г/л-ч.

5 П р и м е р 3. Дрожжи Candida ufllis ВСБ-726 выращивали в условиях, описанных в примере 1. в аппарате емкостью 5 л. В качестве источника углерода использовали виномзтериалы в количестве 3 об.% (в

0 пересчете на этанол). Скорость протока составляла 0,3 . Выход биомассы от заданного этанола составил 75%, содержание сырого протеина в биомассе 63%. продуктивность 5,27 г/л ч.

5 П р и м е р 4. Дрожжи Candida ufllls ВСБ-726 выращивали в аппарате колонного типа емкостью 145 л на минеральной среде по примеру 1 с удвоенной концентрацией солей при температуре 37°С и рН среды

0 4,2-4,5. В качестве источника углерода использовали этанол в количестве4 об.%. Скорость протока составила 0,25 выход биомассы от заданного этанола 74%, содержание сырого протеина в биомассе 62%,

5 продуктивность 5,77 г/л-ч.

П р и м е р 5. Дрожжи Candida ufllls ВСБ-726 выращивали в условиях, описанных в примере 4. В качестве источника углерода использовали виноматериалы в количестве 6 об.% (в пересчете на этанол).

Скорость протока составила 0,35 ч , выход биомассы от заданного этанола 75%, содержание сырого протеина в биомассе 61 %.

Примерб. Дрожжи Candida ufilis ВСБ-726 выращивали в колбах на качалке на минеральной среде придемпературе 34°С и значении рН среды 5.5-4,2 в течение 30 ч. В качестве источника углерода использовали 2 об.% (в пересчете на этанол) водно-спиртового конденсата. При этом выход сухой биомассы от заданного субстрата составил 71%, содержание сырого протеина в биомассе 60%.

Пример. Дрожжи Candida ufilis ВСБ-726 выращивали в колбах на качалке (220 об/мин) на минеральной среде по примеру 1 при температуре 32°С, рН среды 5,5, при высокой плотности популяции, достигаемой переработкой высокой концентрации этанола (4,5 об.%). подаваемого дробно (1,5 об.% при засеве и 1 об.% ежесуточно). Выход от заданного этанола составил 82,1 %.

ПримерВ. Дрожжи Candida ufilis ВСБ-726 выращивали в стерильных условиях непрерывного процесса культивирования в режиме рН-ауксостата при температуре роста 34 ±0,5°СО рН 4,0. концентрации этанола 10-12 г/л. Параметры процесса поддерживались автоматически. Получены следующие показатели роста: выход от заданного и потребленного этанола 56 и 78% соответственно, удельная скорость роста 0,48 ч , продуктивность по биомассе 4.36 г/л ч, продуктивность по белку 2.35 г/л ч.

Штамм-прототип ВСБ-825 имел следующие характеристики: выход от заданного и потребленного этанола 52 и 90% соответственно , удельная скорость роста 0.52 , продуктивность по биомассе 3,1 г/л ч, продуктивность по белку 1.64 г/л ч.

Таким образом, предлагаемый новый штамм дрожжей Candida ufilis ВСБ-726 имеет следующие отличительные признаки от известного термотолерантного этанолассимилирующего штамма дрожжей Candida vallda ВСБ-825:

штамм ВСБ-726 отличается от штамма ВСБ-825 способностью роста на смеси этанола и виноматериалов (иной субстрат), причем в пересчете на этанол данная питательная среда характеризуется высокой концентрацией;

штамм ВСБ-726 отличается от штамма АВСБ-825 способностью роста на гидролизате древесины - альтернативный субстрат для получения кормовых дрожжей; рост штамма ЁСБ-825 на гидролизате древесины практически отсутствует;

штамм ВСБ-726 более конкурентоспособен по сравнению со штаммом ВСБ-825 в температурном режиме культивирования 32-38°С, что было выявлено в испытаниях на Башкирском БХК (см. табл.11);

характеризуется стабильным содержанием сырого протеина в основном 60-62 % (штамм-прототип ВСБ-825 48-62%);

штамм ВСБ-726 растет на среде с высокой концентрацией этанола (при 4,5% с выходом биомассы 82,1%), штамм прототип ВСБ-825 в этих же условия:; им ,ет выход биомассы 56,2%, т.е. на 25,9% м ныие;

штамм ВСБ-726 имеет кру ный размер клеток (4.1-7,0 х 6,3-10,4 мкм): размер клеток штамма ВСБ-825: 2,0-6.2 х 3.0-2,0 мкм (данный признак имеет большое промышленно-важное значение, так как крупноклеточные дрожжи лучше сепарируются, что значительно снижает потери биомассы на стадии сепарации, приводит к уменьшению расходного коэффициента по подаваемому субстрату, т.е. экономически более выгодно ):

штамм ВСБ-726 отличается от штамма ВСБ-825 по ряду фи ,иолого-биохимических свойс в: штамм ВСБ 726 ассимилирует ряд углеводов (мальтозу, целлобиозу и т.д.), азотн кислый калий сбраживает сахарозу, рафф: нозу, что може г служить тест-признаком при разработке микробиологического контр ля произведет а для оценки доминирова ия штамма в биоценозе промышленных ерментеров.

Активность роста штамма дрожжей ВСБ-726 на минеральной среде с 1 % этанола в колбах на качалке при температуре 32-40°С

(модельные опыты)

Характер роста штаммаВСБ-726 при высокой плотности популяции

(модельные опыты)

Таблица 2

Таблица 3

151817471 16

Таблица 5

Характеристика роста штамма ВСБ-726 в периодическом режиме культивирования при температуре 32-40°С (камеральные опыты)

кца fi Е:.хзд биомассы и содержание о ней сырого протеина при культивировании е режиме хемостата дрожжей ВСБ-726 и 8СБ-65)

Характеристика роста штамма ВСБ-726 в режиме рН-акустостата

Т а б л и ц а 7

Активность роста штаммаВСБ-726 на минеральной среде, содержащей виноматериалы в качестве источника углеродного питания

Таблица 4

Показатели непрерывного процесса выращивания дрожжей ВСВ-726 в режиме хемостата

Таблица 9

Активность роста ВСБ-726 на гидролизате древесины при температуре 37°С (модельные опыты)

Штамм

С. ufllls ВСБ-651 (штамм мезофильный)

С. scottll КС-2

(производственный штамм Волжского гидролизного завода)

С. vallda

ВСБ-825 (термотолерантный штамм-прототип)

С. krusel

.С-Б-896 (известный термотолерантный штамм) С. ufllls ВСБ-8261 новый штамм)

Таблица В

Накопление биомассы,г/л

3,1 3.3

3,8 1.5 7.7

ТаблицаЮ Аминокислотный состав белка дрожжевой биомассы штамма Candida ufllts ВСБ-726

Таблица 11

(51) б С 12 Х 1/1б (u) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к патенту Российской Федерации с4

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4890020/13 (46) 10.01.96 Бюл. № 1 (72) Градова Н.Б., Робышева 3.Н., Рогачева

P.À., Заикина А.И., Бузург-заде Д.Л., Сатрутдинов А.Д., Бравичева P.Н., Шерова

Т.Л., Мурзаков Б.Г., Ерошин В.K., Сычев

А.Е., Низамов P.À. (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (73) Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (56) Авторское свидетельство СССР N

1609134, кл. С 12N 1/16, 1990. (19) RU (11) 1817471 (13) С (54) ШТАММ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA

UFILIS - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКОВОЙ БИОМАССЫ (57) Использование: микробиологическая промышленности: получение биомассы и новый штамм дрожжей для получения биомассы. Сущность изобретения: штамм дрожжей Candida ufilh получен в процессе селекции. Штамм имеет продуктивность

4,36 г/л ч, удельная скорость роста 0,48 ч при непрерывном культивировании в режиме PH-стата. При культивировании на этаноле накопление биомассы на уровне

10,2-13,2 г/л, выход биомассы от заданного эталона 71,8-77% при содержании протеина 58,1-63,97,. 11 табл.

1817471

Предлагаемое изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой новый штамм дрожжей, который может быть использован для получения кормовых дрожжей на основе этанола, виноматериалов, а также гидролизатов сельскохозяйственных о ходов (древесины, хлопковой шелухи и др.), Цель изобретения заключается в селекции высокопродуктивного непатогенного нового штамма дрожжей, по систематическому положению относящегося к Candida

ufflis, конкурентоспособного на международном рынке и активно растущего при температуре 32 — 34 С, которая является регламентной по технологии производства кормовых дрожжей, т.е. штамма. обладающего мезофильными свойствами, но характеризующегося высоким выходом биомассы и высоким содержанием белка в готовом продукте при культивировании при температуре 32 — 40 С на среде с этанолом и отличающегося относительно крупными размерами клеток, что способствует снижению потерь при выделении биомассы, а также высокой конкурентоспособностью.

Постановка данной задачи обусловлена современными ужесточенными требованиями, направленными на обеспечение экологически безопасного производства, одной из гарантий этого служит применение мезофильных штаммов дрожжей, характеризующихся большей стабильностью в сохранении признака отсутствия патогенности в условиях длительных нестерильных процессов непрерывного культивирования.

Истинно термотолерантные штаммы, имеющие оптимальную температуру роста повышенную (37-42 С), обладают большей мутабельностью, что с большей вероятностью может приводить к образованию патогенных форм дрожжей. Кроме того, ведение процесса культивирования при повышенной температуре сопровождается развитием в . биоценозе сопутствующей бактериальной микрофлоры санитарно-ги. гиенической группы. не допустимой по.существующим санитарным нормативам и действующим на заводах технологическим регламентам..

Изобретение заключается в том, что предлагаемый штамм получен в процессе селекции при испытании около 100 дрожжевых штаммов музейной коллекции института ВНИИсинтезбелок в .условиях непрерывного процесса культивирования на среде с этанолом в режиме хемостата и рН-стата с последующим испытанием штамма в модельных, камерных и опытно-промышленных условиях, имеющих оптимальную температуру рос а 32-34 С, но характеризующихся способностью роста в широком диапазоне температур (32-40 С) с сохранением показателей по скорости роста, накоплению биомассы и содержаниюсырого протеина.

Предлагаемый штамм может быть использован для получения белковой биомас10 сы не только на основе этанола, но и на основе гидролиэатов древесины и виноматериалов.

В результате проведенных исследований выявлено, что активность роста штамма

"5 ВСБ-726, т.е. накопление биомассы в.модельных опытах (в качалочных колбах) на минеральной среде с 1 этанола с добавлением факторов роста — дрожжевого автолизата и без него — при температуре роста

20 32-400С через 18 ч культивирования, составляла 6,0-6.3 г/л; для штамма-прототипа ВСБ-825 в тех же условиях 4,8-3,5 г/л; для известного мезофильного штамма

Сапйба uf ills ВСБ-651 и термотолерантного штамма Candida krusei BC6-896 4,1-5,6 и

3,6-1,9 г/л соответственно (см. табл,1).

Обращаем внимание на то, что новый штамм ВСБ-726 не нуждается в дополнительных факторах роста (дрожжевом авто30 лизате), тогда как рост штамма-прототипа

ВСБ-825 зависит от наличия в среде дополнительных факторов роста. Последнее является существенным для условий и роизводства, поскольку снижает себестои35 мость продукта за счет. меньших затрат на дефицитные реактивы.

Проведены испытания штамма ВСБ-726 в модельных опытах при высоком содержании этанола в среде, т.е. в условиях высокой

40 плотности популяции. Последнее является черезвычайно важным для условий промышленной ферментации, так как ведение процесса культивирования с высокой койцентрацией биомассы в ферментере по45 эволит обеспечить значительное повышение съема биомассы с единицы объема.

По данным табл.2 новый штамм ВСБ726 способен расти при плотности популяции 23-28,8 г/л (по сухому весу. дрожжей), 50 обеспечивая наибольший выход биомассы

73,3-84,6 j при переработке 2.5-4,5ф этанола в среде. Штамм ВСБ-651 в аналогичных условиях (2.5-4.5 ) этанола) имел плотность популяции 12,9-26,4 г/л (т.е. на

55 2,4-10 г/л меньше штамма ВСБ-726) при выходе биомассы 66,2-76,2 (т.е. на 6,98,47; меньше штамма ВСБ-726).

Штамм-прототип ВСБ-825 при переработке 4,5-6,5 эганола в среде резко снижает активность роста до 17,7-8,3 г/л (т.е.

1817471 на 11,1 — 17,9 г/л меньше штамма ВСБ-726) при выходе биомассы 56.2-11,8, (т.е. на

25,9 — 39,7 меньше штамма ВСБ-726).

Аналогичные результаты получены при испытании культур в режиме хемостата при концентрации этанолз 4 и 6 (см. табл.3).

Штамм дрожжей ВСБ-726 испытан в камеральных условиях стерильного процесса непрерывно-о культивирования в режиме рН-стата в сравнении с прототипом и известными мезофильными и термотолерантными штаммами дрожжей при оптимальной для каждого штамма температуре роста

34 0,5 и 39 0,5 С) и концентрации этанола в минеральной среде 10 — 12 г/л.

Согласно полученным результатам, представленным в табл.4, новый штамм

ВСБ-726 имел наибольшие продуктивность (4,36 г/л) и выход биомассы (56 ) по сравнению со штаммом ВСБ-825, для которого данные показатели составили.2,93-3,1 г/л ч и 50-52ф соответственно. B сравнении с термотолерантными штаммзми, в том числе прототипом, новый штамм ВСБ-726 характеризовался сохранением практически такой же высокой удельной скорости роста (0,48 ч 1), что и штаммы ВСБ-825 (0,52 ч ) и

ВСБ-896 (0,5 ч ); Известный меэофильный штамм ВСБ-651 имел меньшую удельную скорость роста {0,43 ч ).

Штамм дрожжей ВСБ-726 испытан в ка.меральных условиях периодического культивирования при температуре 32-40 С. При этом выявлено {табл.4), что новый штамм

ВСБ-726 активно растет в широком диапазоне температур (32-40 С), обеспечивая накопление биомассы на уровне 10,2 — 13,2 г/л, выход биомассы от заданного этанола 71,8—

77,0 при содержании сырого протеина s биомассе 58,1-63,97;; удельная скорость роста штамма составила 0,33-0,38 ч 1. Мезофильный штамм ВСБ-651 в данных условиях культивирования имел следующие показатели: накопление биомассы 1.5-9,", г/л. выход биомассы 40-74, содержание сырого протеина 56-60, удельная скорость роста 0,13-0.33 ч, т.е. даже при оптимальной температуре роста штамм ВСБ-651 имел худшие показатели по сравнению со штаммом ВСБ-726. При повышении температуры процесса культивирования до 3739 С штамм ВСБ-651 резко снижает перечисленные показатели при температуре роста 40 С штамм ВСБ-651 практически не растет.

Известный термотолерантный штамм

С.krusei ВСБ-896 в данных условиях процесса культивирования также имел более низкие показатели по сравнению с новым штаммом В СБ-726 (см. табл.5).

50 тивирования на виномзтериалах, наименьший (61,2 (,) на этзноле — ректифи-. кате. На субстрате, представляющем смесь виноматериалов и этанола, выход биомассы составляет 63-68,0 в зависимости от количества добавляемого этаноаа (75-90 ) (см. табл.8).

Накопление биомассы нового штамма

ВСБ-726 на гидролизате древесины при испытании в модельных опытах в качалочных колбах при температуре 37 С и содержании в минеральной среде редуцируюших веществ(РВ) 1,45 составило 7,7 г/л; штамма

В СБ-651 3,1 г/л (см.табл.9).

Изучены культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма ВСБ-726. Морфологические признаки: клетки в односуточной культуре на глюкозопептонной среде одиночные, овзльные или удлиненно-овальные и образуют веточки и короткие цепочки. Размер клеток в

Проведены сравнительные испытания в

3-кратной биологической повторности в камеральных и стерильных условиях непрерывного процесса культивирования в

5 режиме хемостата при температуре 3234 С, рН среды 4,2, скорости потока 0,25 ч, концентрации этанола 2ф>. Как видно из табл.6, предлагаемый штамм ВСБ-726 обеспечивал выход биомассы от заданного эта10 нола в среднем 73 при содержании протеина (сырого) в биомассе 62,3, Мезофильный штамм ВСБ-651 в данных условиях культивирования имел выход биомассы

70,3, содержание сырого протеина в био15 мзссе58.3 .Штамм ВСБ-726 также испытан на других источниках углерода — виноматериалах и гидролизате древесины.

Согласно данным табл.7 новый штамм

20 ВСБ-726 в модельных опытах в качалочных колбах при температуре роста 32-34 С на минеральной среде с виноматериалами через 24 ч и 36 ч выращивания обеспечивал накопление биомассы 8,1-9,1 отн.ед.

25 опт.пл. Мезофильный штамм ВСБ-651 в этих условиях имел 6,8-6,9 отн.ед.опт,пл., -звеcTHblA термотолерантный штамм ВСБ-896

6,1 и 6,6 отн.ед.опт.пл.

Штамм ВСБ-726 далее был испытан в

30 камеральных условиях нестерильного непрерывного процесса культивирования в режимах хемостата в аппарате "Абитекс" при температуре 34 0,5 С, скорости роста

0,2ч на минеральной среде с виноматери35 злами, этзноле и смеси виноматериалов и этанола, сбалансированных в пересчете на, абсолютный алкоголь, составивший 24,0 .

Было показано„что наибольший выход биомассы (83,5 ) достигался в процессах куль1817471

20 односуточной культуре в жидком сусле 3,57.0 х 7,0 — 13 мкм. Почкование полярное. В промышленных непрерывных условиях культивирования на минеральной среде с этанолом размер клеток в среднем 5.0 — 9,0 мкм. Аскоспоры не образует. На кукурузном агаре образует слаборазвитый примитивный псевдомицелий, состоящий из ветвящихся цепочек, коротких псевдогиф и овальных клеток. В солодовом сусле (3-30 сут) кольца и и пленки не образует. Осадок мутный кремового цвета. Культуральные признаки: колонии на солодовом сусле-агаре (7 сут) крупные. слабовозвышающиеся с гладкой поверхностью, ровным краем, сероватые. Центр колонии часто приподнят в виде бугорка, могут появляться колонии с мелкоморщинистой поверхностью. Штрих на солодовом сусле-агаре гладкий. сероватый со временем до кремового, слабо блестящий, может быть и слабо складчатым.

Физиологические признаки: ассимилирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, раффинозу, мелицитозу. инулин, ксилозу. глицерин, маннит, салицин, метилО-глюкозу (слабо), уксусную, молочную, янтарную и лимонную кислоты. Сбраживает: глюкозу. сахарозу, раффинозу. Не сбраживает; мальтозу, галактозу, лактозу, челеци.озу, целлобиозу. В качестве азота использует нитратные и аммонийные соли (например, азотнокислый натрий сернокислый аммоний и др.). Хорошо растет на стандартных синтетических питательных средах без добавления факторов роста (среда Ридер, Миллера, Сабуро и др.). В качестве нетрадиционны", источников углерода и энергии испо1 ьзует этанол, водно-спиртовой конденсат, виноматериалы, послеспиртовую б"..рqy, уксусную кислоту, гидролизаты сельскохозяйственных отходов. а также продукты метаболизма углеводородокисляющих дрожжей.

Штамм хранят в лиофилизированном состоянии или на сусле-arape под слоем вазелинового масла при комнатной температуре. Периодичность пересевов в последнем случае 3-4 раза в год. Рабочие культуры штамма дрожжей поддерживают путем посева в пробирках (косяках) на сусле-arape, культивированных при температуре 32-34 C в течение двух суток с последующим:;ранением при комнатной температуре.

Биохимический состав дрожжевой биомассы штамма ВСБ-726: содержание сырого протеина 59 — 63, липидов 7,1-7,47 золы 8,7-9,2. нуклеиновых кислот 7,4-9,9, влаги 2,4-4,3. Аминокислотный состав истинного белка представлен в табл.10., 5

Сумма насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в составе липидов составляет 18.9 и 72,2 отн. соответственно (в том чиСлЕ С16 и С1З 18,9 и 72,2 ).

Пример 1. Дрожжи Candlda uf ills

ВСБ-726 выращивали в аппарате интенсивного массообмена емкостью 5 л на минеральной среде без ростовых факторов при температуре 32-23 С и рН 4,0-4,3 в непрерывном режиме. В качестве источника углерода использовали этанол в количестве 3 об. ; скорость протока составляла 0,20 ч 1.

Состав питательной среды, г на 1 л:

Калий хлористый 0.7

Фосфорная кислота (70;(,) 0,7

Сернокислый аммоний 1,0

Сернокислый магний 0,4

Сернокислое железо 0,04

Сернокислый цинк 0,02

Сернокислый марганец 0,02

В ыход абсолютно сухой биомассы от заданного этанола 75, содержание сырого протеина в биомассе 62 (», продуктивноСть

3,51 г/л ч.

Пример 2. Дрожжи Candida uf ills

ВСБ-726 выращивали в аппарате емкостью

30 л в условиях, описанных в примере 1. В качестве источника углерода испольэовали этанол в количестве 2 — 2,5 об.7ь; скорость протока составляла 0,33 ч, рН среды 5,5

Выход абсолютно сухой биомассы от заданного этанола составил 737„содержание сырого протеина в биомассе 62, продуктивность 3,76 r/ë ч.

Пример 3. Дрожжи Candida ийИз

ВСБ-726 выращивали в условиях, описанных в примере 1, в аппарате емкостью 5 л.

В качестве источника углерода использовали виноматериалы в количестве 3 об. (в пересчете на зтанол). Скорость протока составляла 0,3 ч . Выход биомассы от заданного этанола составил 75, содержание сырого протеина в биомассе 63, продуктивность 5,27 г/л ч.

Пример 4. Дрожжи СапсИба цйИз

ВСБ-726 выращивали в аппарате колонного типа. емкостью 145 л на минеральной среде по примеру 1 с удвоенной концентрацией солей при температуре 37 С и рН среды

4,2-4,5. В качестве источника углерода использовали этанол в количестве4об. Ско- рость протока составила 0,25 ч ; выход биомассы от заданного этанола 747, содержание сырого протеина в биомассе 62, продуктивность 5,77 г/л ч.

Пример 5. Дрожжи Candlda ufills

ВСБ-726 выращивали в условиях, описанных в примере 4. В качестве источника углерода испольэовали виноматериалы в количестве 6 об.7 (в пересчете на этанол).

1817471

Скорость протока составила 0,35 ч, выход биомассы от заданного эта нала 757,, содержание сырого протеина в биомассе 61 .

Пример 6. Дрожжи Candlda ufilis

ВСБ-726 выращивали в колбах на качалке на минеральной среде при температуре 34 С и значении рН среды 5,5-4,2 в течение 30 ч. В качестве источника углерода использовали

2 об. (в пересчете на этанол) водно-спиртового конденсата. При этом выход сухой биомассы от заданного субстрата составил

71, содержание сырого протеина в биомассе 607;.

Пример 7. Дрожжи Candida ufills

ВСБ-726 выращивали в колбах на качалке (220 об/мин) на минеральной среде по примеру 1 при температуре 32 С, рН среды 5,5, при высокой плотности популяции, достигаемой переработкой высокой концентрации этанола (4,5 об, %,), подаваемого дробно (1,5 об. при засеве и 1 об. ежесуточно). Выход от заданного этанола составил 82,1 .

Пример 8. Дрожжи Candida uf ills

ВСБ-726 выращивали в стерильных условиях непрерывного процесса культивирования в режиме рН-ауксостата при температуре роста 34 +0,5 СО рН 4,0, концентрации зтанола 10 — 12 г/л. Параметры процесса поддврживались автоматически.

Получены следующие показатели роста: выход от заданного и потребленного этанола 56 и 787 соответственно, удельная скорость роста 0,48 ч, продуктивность по

-1 биомассе 4,36 г/л ч, продуктивность по белку 2,35 г/л ч.

Штамм-прототип ВСБ-825 имел следующие характеристики; выход от заданного и потребленного этанола 52 и 90 соответственно, удельная скорость роста 0,52 ч, продуктивность flo биомассе 3,1 г/л ч, продуктивность по белку 1,64 г/л ч.

Таким образом, предлагаемый новый штамм дрожжей Candlda uf ills ВСБ-726 имеет следующие отличительные признаки от известного термотолерантного зтанолассимилирующего штамма дрожжей Candida чаИба ВСБ-825; штамм ВСБ-726 отличается от штамма

ВСБ-825 способностью роста на смеси этанола и виноматериалов (иной субстрат), причем в пересчете на этанол данная

5 питательная среда характеризуется высокой концентрацией; штамм ВСБ-726 отличается от штамма

АВСБ-825 способностью роста на гидролизате древесины — альтернативный субстрат

10 для получения кормовых дрожжей; рост штамма ВСБ-825 на гидролизате древесины практически отсутствует; штамм ВСБ-726 более конкурентноспособен по сравнению со штаммом ВСБ-825 в

15 температурном режиме культивирования

32 — 38 С, что было выявлено в испытаниях на Башкирском БХК (см. табл.11}; характеризуется стабильным содер;-хэнием сырого протеина в основном 60 — 62".

20 (штамм-прототип ВСБ-825 48 — 62ф); штамм ВСБ-726 растет на среде с высокой концентрацией этанола (при 4,5, с выходом биомассы 82,1 ), штамм прототип

ВСБ-825 в этих же условиях им.ет выход

25 биомассы 56,2ф,, т.е. на 25,9,„ м ныне; штамм ВСБ-726 имеет кру. ный размер клеток (4,1 — 7,0 х 6,3-10,4 мкм}: размер клеток штамма ВСБ-825: 2,0 — 6,2 х 3,0-2,0 мкм (данный признак имее большое промыш30 ленно-важное значение, так как крупноклеточные дрожж лучше сепарируются, что значительно сни.кает потери биомассы на стадии сепарации., приводит к уменьшению расходного коэффициента по подаваемому

35 субстрату, т,е. экономически более выгодно): ш:.амм ВСБ-726 отличается от штамма

ВСБ-Ы5 по ряду фи,иолого-биохимических ,свойс..в: штамм ВСБ-726 ассимилирует ряд

40 углев. дов (мальтоз., целлобиозу и т.д.), азотн кислый калий сбраживает сахарозу, раиф. нозу, что може г служить тест-и ризнаком п и разработке микробиологического контр .ля производст а для оценки домини45 рова ия штамма в биоценозе промышленных ерментеров.

1817471

СЭ о

C) !Ъ

СЪЪ

С Ъ

CQ Г CO

С

С Ъ с

С Ъ

С Ъ

СЪ

С) С.Ъ CD O!

С Ъ - CD

IA о о

СО

С9

С Ъ

СО

CD

С Ъ

С Ъ

О>

<О Г=

С Ъ СЪЭ CD

CD

СО

С Ъ

Е о

lS с о

IЩ о о

CD

С Ъ

ID

С Ъ

CD

CD СО

ОЪ

СО

С) л

dl

СЧ

I»

С>

ОЪ

LA C0 С Ъ

С Ъ О) CD (»

2 о о

Е о

ОЪ

О о 3 С Ъ

С

С"Ъ (О

СО

LA ID (CD

СО

С» л

CV л

LA

ОЪ

О) Ф

° - CD

СО

Z

Ф с о х

CII

z о о

C)

СЬ

С"Ъ

ID

С Ъ

С)

С Ъ

ОЪ

СО а О о сс

2 о

2 с о

Ф

X с

Ф ч о

Е и о

СО

С Ъ

С Ъ л

C: CD

С> (О

С)

CD

ОЪ

С Ъ

С> :2

С!Ъ CD

С Ъ

С)

СО С СЧ

ОЪ CD

«D

Щ

1»

6)

S о и о

CD

С9

ID

С Ъ

CF>

l С"Ъ

CO CD

Г с Ф (»

CD

СО

М о Ф

С )

CV

С Ъ

СЪ 4 <О

ОЪ CD

ОЪ !С

CD D) С!Ъ

СЧ CD

СО

CV Ф

С) LD

СЪ вЯ

Z

Ф

О.

В

cL

С о ч

l

I

S ч ш

>Я

° 0

Щ Я! Ф- о

„— Щ

Ф Cg

1о

CD

LQ и

ОЭ

Е

Е

13 о> !Е

lII о

X о

CD

СЧ

СО

L0 и

)Я

l- X и щ Ф Z

lCI CCI

Щ Q.

Щ S Ф

> с

ОЪ О о

СО ш о. о

Ъ I»!

» 2 т

S 1I» о о

)- Ф Ф и>

CL >!!

0 в

Щ и

СО

)Я

X

l т

Щ

Ф

Е с

3 о

Е

CL

lЕ

Е о

О о

Ю

С4

С Ъ

Ф

СЪ.

;>

IЩ

СЪ.

Ф

Е

Ф

IS

С с

Ф х с

CII т

Щ х

X х

Щ

ОЪ с о

CCI с о

CQ

l»

C!) о . о

Ф ч

Ф

Q. о !

Я о

X о с

CCI

СЪ.

Ф

S

Е

Щ

CD

СЧ л

LO и

Q)

)Я

Ф

М

М о

CL ч

Cl3

Е

Е

3 » о о

D. о о о

Ф

l

С1 I СО

ОЪ О

СО ОЪ

С) <О (О С Ъ !С - С"Ъ CV

CD С) CV ф CD CD

ОЪ О СЪ

<О

1817471

Таблица 2

Характер роста штаммаВСБ-726 при высокой плотности популяции (модельные опыты ) Таблица 3

15 1817471 16

Таблица 5

Характеристика роста штамма ВСБ-726 в периодическом режиме культивирования при температуре 32-40 С (камеральные опыты ) Содержание сырого проВыход от заданного этаУдельная

Накопление

Время накопления, ч

Температура

Штамм биомассы г/л скорость роста, ч культивирования,оС теина нола

63

63

56

63.9

63.2

60,1

58.1

77,8

78,0

78,0

71,8

0,За

0.37

0.38

0,33

12,4

13.2

12,8

10,2

13

16

32

36

38

Таблица о Вь;хпд биомассы и содержание е нев сырого протеина при культивировании в режиме хемостата дрожжеа ВСВ-726 и ВСВ-бб!

Таблица 4

Характеристика раста штамма ВСБ-726 в режиме рн-акустостата

Таблица 7

Активность роста атаммаВСБ-726 на мине.ральной среде, содержащей виноматериалы в качестве источника углеродного питания

С ufllls

ВС6-651, мезофил ьный штамм

С. krusel

ВСБ-896, известный термотолерантный штамм

С. ufilis

ВСБ 826, новый штамм

32

37

39

34

38

13

19

21

16

16

17

9,1

6,0

3,6

1,5

12,8

12,9

6,4

3,0

0,31

0,32

0.33

0.13

0,33

0,35

0,18

0,13

74

74

57

73.5

37,7

70,5

70,1

1817471

Таблица 8

Показпгепи непрерывного процесса еырагдивания дрожжей ВСБ-726 в режиме хемостатв

Этэноп-ректификат

Смесь виномате1п1алое с добавлением зтанолв.Показатели

Виноматеривлы

90 г

14,7

16.3

19.6

24.0

24.0

24.0

68.0

83,5

61.2

1.2

1.63

1.47

60.8 59.8

62.1

61.4

61,4

Концентрация остаточного этанолв. мг/л сле и отс. отс. спе ы отс.

Таблица 9

Активность роста ВСБ-726 на гидролиэате древесины при температуре 37 C (. модельные опыты ) Концентрация эбс.сухик дрожжей, r/ë

Концентрация алкоголя в среде, r/n

Выпад от абсолютного алкоголя. $

Удельный раскод абс.алкоголя,r/ï

Содержание в биомассе сырого протеина. ть

15.5

24,0.

67,8

1,54

13,3

24.0

63.0

1,59

1817471

Таблица 10

Аминокислотный состав белка дрожжевой биомассы штамма Candida цйИз ВСБ-726

Таблица 11

Составитель Т,Полянская

Техред М. Моргентал

Редактор Н.Козлова

Корректор М.Керецман

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 1445

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения Штамм дрожжей Candlda uf Ills

ШТАММ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA КМП У-263-продуцент белковой био

UFILIS - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКОВОЙ БИО-, 50, МАССЫ