Штамм дрожжей рiснiа pinus - продуцент алкогольоксидазы

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения. В результате многостадийного мутаненеза штамма Pichia pinus МНЧ дикого типа получен штамм Pichia pinus ВКПМ У-928, отличающийся от исходного штамма культурально-морфологическими признаками и требующий для оптимального биосинтеза алкогольоксидазы наличия в среде биотина и метанола. Удальная активность внеклеточной алгокольоксидазы составляет 0,09 ед/мг клеток, 0,08 ед/мл культуральной жидкости, или 2,91 ед/мг белка культуральной жидкости.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СКИХ

РЕСПУБЛИК

<я>s С 12 N 1/16, 9/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

llPI ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 и..,,,",,""- ж.К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ч 4 О (), Ql (21) 4751394/13 (22) 23.10,89 (46) 23,10,92. Бюл. N 39 (71) Львовское отделение Института биохимии им. А.B.Ïàëëàäèíà (72) В.И.Титорен ко, Е. Ю, Сапожен кова и

А.А. Сибирный (56) Veenhuis M., van Dijken J.P. Harder W.

Adv. Microbiol. Physiol. 1983, 24, р. 1 — 82.

Giuseppin М.1 .F., чап Eijk Н.H„3.

Hellendoorn M. van Almkerk J.W. Appl.

Microbiol. Biotechnol, 1987, 27, р. 31-36. (54) ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PINUSПРОДУЦЕНТ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма метилотрофных дрожжей Pichia pinus АОС-З, способного секретировать алкогольоксидазу в среду.

Алкогольоксидаза — фермент, катализирующий окисление кислородом воздуха метанола, этанола и некоторых других первичных спиртов до соответствующих альдегидов с образованием перекиси водорода (1).

Наиболее близким к предлагаемому является получения препаратов алкогольоксидазы при помощи штамма Hansenula

polymorpha CBS 4732, при котором разрушение клеточной стенки дрожжей достигается путем инкубации клеток с раствором литического фермента зимолиазы (2). Зимолиаза является дорогостоящим ферментом; для получения активных препаратов алкогольоксидазы необходимо удалять присутствующую в получаемых бесклетачных экстрактах каталазу. Все указанные недо„„!> ) „„1770357 А1 (57) Использование: биотехнология. Сущность изобретения. В результате многостадийного мутаненеза штамма Pichia pinus

МНЧ дикого типа получен штамм Plchia

pinus ВКПМ У-928, отличающийся от исходного штамма культурально-морфологическими признаками и требующий для оптимального биосинтеза алкогольоксидазы наличия в среде биотина и метанола.

Удальная активность внеклеточной алгокольоксидазы составляет 0,09 ед/мг клеток, 0,08 ед/мл кул ьтурал ьн ой жидкости, или

2,91 ед/мг белка культуральной жидкости, статки могли бы быть устранены при обнаружении штаммов, секретирующих алкогольоксидазу (но не каталазу) в среду.

Целью изобретения является выделение штаммов метилотрофных дрожжей, секретирующих алкогольоксидазу в среду.

Предлагается новый штамм метилотрофных дрожжей Pichia pinus АОС-З, секретирующий алкогольоксидазу (но не каталазу) в среду.

Штамм дрожжей P.pinus АОС-3 получен при помощи многостадийного мутагенеза штамма Р,pinus MH 4 дикого типа с использованием специальных селекционных приемов.

Предлагаемый штамм P.pinus АОС-3 хранится в коллекции отдела биохимической генетики Львовского отделения Института биохимии им, А.В.Палладина АН УССР и депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов во ВНИИ Генетика (коллекционный номер Y-928).

1770357

Условия культивирования и накопления алкогольоксидазы в культуральной жидкости и в клетках штамма AOC-3 представлены следующим примером.

Пример.

Штамм P.pinus AQC-3 выращивают до середин ы экспонен циал ьной фазы роста (до биомассы клеток 1 мг сухого веса/1 мл среды) в среде следующего состава (из расчета на 1 л среды); метанол — 10 мл, мочевины—

3 г, КН; РΠ— 8 г, Na>HPO4 — 12, 43 г, Mg S04

7H20 — 0,5 г, CaCI — 0,1 г, дрожжевой экстракт — 0,5 г, рН среды — 6,4. Мочевину в виде 30 -ro водного раствора стерилизуют автоклавированием отдельно от питательной среды, После стерилизации в среду добавляют мочевину и метанол.

Кул ьти в и рова н ие ведут на качал ке (200 об/мин) при 30 С в течение 54 часов в колбах объемом 750 мл, содержащих 200 мл питательной среды. Клетки осаждают центрифугированием, затем определяют активность алкогольоксидазы в культуральной жидкости и пермеабилизированных дигитонином клетках. В указанных условиях активность алкогольоксидазы в пермеабилизированных клетках составляет

116.0 нмоль .мин .мг клеток, а в культуральной жидкости — 0.08 ед/мл или 2,91 ед/мг белка культуралькой жидкости, т.е. в среду культивирования секретируется

44,7% от общего количества синтезируемой в клетке алкогольоксидазы, Активность каталазы не обнаруживается в культуральной жидкости.

Концентрация белка в культуральной жидкости, которую определяют после диализа против 10 мМ КН2Р04/NaOH буфера рН 7,5 (при 4 С в течение 4 часов) методом

Бредфорда, составляет 211 мкг/мл. Активность алкогольоксидазы в диализированной культуральной жидкости равна 2,01 .мкмоль мин мг белка. Культуральную жидкость колнцентрируют следующим образом: 4 мл этой жидкости в диализном мешке помещают в стакан. содержащий 20 г полиэтиленгликоля с молекулярной массой 20000 (ПЭ Г-20000) и инкубируют 6 часов при температуре 4 С. При этом достигается уменьшение обьема культуральной жидкости до 0,1 мл, т,е, концентрирование этой жидкости в 40 раз. Концентрированную культуральную жидкость подвергают электрофорезу в 7,5 /-ом полиакриламидном геле в нативных условиях при напря>кении 200

В и силе тока 24 мА. При окрашивании электрофореграммы с целью детекции белка и активности алкогольоксидазы выявляется одна белковая зона, Rf которой равен Rf

55 алкогольоксидазы, что указывает на гомогенность препарата этого фермента, секретируемого клетками штамма.

Морфолого-кул ьтурал ьн ые свойства.

Вегетативные клетки при выращивании на агаризованном сусле плотность 8ОБ при

30 С в течение 2 — 3 суток имеют круглую или овальную форму размером (2,8 — 4,5) х (3,9—

6,0) мкм. Клетки одиночные, редко встречаются небольшие скопления из 2 — 3 клеток.

Размножение почкованием. В основном расположение почек апикальное, Мицелий или псевдомицелий культура не образует, капсула отсутствует. Включения при просмотре в световом микроскопе выражено слабо. Реакция с диазонием синим отрицательная, Вегетативные споры не образует.

Культура гомоталличная, При длительном культивировании на сусло-агаре (более 2-х недель) около 1 — 2% клеток подвергаются пламогамии и кариогамии с последующим спорообразованием. При споруляции образуются аски с 2-4 шляповидными гаплоидными аскоспорами, что сопровождается накоплением в колонии бурого пигмента, На сусло-агаре после 2 — 3 суток культивирования при 30 С колонии и штрих белые, выпуклые, слегка матовые, с ровными краями, сметанообразной консистенции. легко снимаются петлей, В жидкой среде при выращивании на солодовом сусле плотностью 8 Б при 30 С в статических условиях на 2 — 3 сутки образуется кольцо и островки очень тонкой пленки, а затем осадок клеток белого цвета, При выращивании культуры s указанных условиях на качалке рост отмечается в виде помутнения среды. Окрашивание среды при культивировании не наблюдается.

Физиолого-биохимические свойства.

Тип катаболизма: дыхание. Аэроб. Максимальная температура для роста 33 С, оптимальная температура 30 С, минимальная температура 10 С. Максимум рН для роста

6,8, оптимум — 5,4, минимум — 4,3. Культура осмотолерантна: растет в присутствии 1 М сорбита, Культура обладает незначительной галотолерантностью: в среде с 10% NaCk рост слабый. Рост чувствителен к антимицину А и нистатину, резистентен к циклогексимиду, ампициллину, тетрациклину., В жидкой и плотной среде указанного в примере состава штамм хорошо утилизирует следующие источники углерода: глюкозу, маннозу, маннит, фруктозу, ксилозу, L-арабинозу, целлобиозу, фумаровую кислоту, янтарную кислоту, этанол и метанол, плохо утилизирует мальтозу, раффинозу, рибозу, лимонную кислоту, яблочную кислоту, сорбит. ксилит, не утилизирует трегалозу, ща1,3357

Составитель И.Привалова

Техред М.Моргентал Корректор М.Керецман

Редактор А.Козлова

Заказ 3713 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 велевоуксусную кислоту, D-арабинозу, глицеральдегид, дульцит, L-сорбозу. В качестве источников азота в жидкой и плотной среде указанного в примере состава штамм хорошо усваивает соли аммония, а в той же среде без (МН4)г504 также хорошо утилизирует глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, глутамин, аспарагин, пролин, метиламин и D-аланин, плохо утилизирует D-серин и мочевину, не утилизирует нитраты, Рост штамма в синтетических средах абсолютно зависит от наличия биотина, тиамин частично стимулирует рост. При росте в среде с глюкозой штамм характеризуется отсутствием алкогольоксидазной активности, при росте в среде с метанолом активность алкогольоксидазы в клетках мутанта высокая. При выращивании в среде с метанолом мутантный штамм, в отличие от исходного штамма P.pinus МН4, секретирует алкогольоксидазу. Штамм является прототрофом.

Клетки штамма не содержат плазмид.

Гц пар составляет 39,1 /,, 5 Штамм является не патогенным в опытах не белых мышах.

Штамм P.pinus АОС-3 необходимо хранить на скошенном сусло-агаре при 4"С, пересевы производить через 3 — 4 месяца.

10 Использование штамма позволит наладить в СССР биотехнологическое производство препаративных количеств алкогольоксидазы, используя гораздо более эффективную, по сравнению с используе15 мыми в настоящее время за рубежом, процедуру выделения этого фермента.

Формула изобретения

Штамм дрожжей Pichia pinus ВКПМ У20 928-продуцент алкогольоксидазы.