Способ получения суммы фенольных соединений

 

Использование: в фармацевтической промышленности, касается производства лекарственных средств из растительного сырья. Сущность изобретения: наземную часть молочая грузинского Euphorbia Ibeiica обезжиривают хлороформом в аппарате Со2 кслета до исчезновения зеленой окраски хлороформа, вытекающего из аппарата, и подсушивают сырье. Затем осуществляют одновременное измельчение и экстрагирование 96%-ным этиловым спиртом при соотношении сырья: -экстрагент 1:15-1:20 методом вихревой экстракции, затем экстрагируют методом непрерывной экстракции горячим 96%-ным этанолом для менее 30 мин. Полученный экстракт отделяют от шрота фильтрованием, фильтрат упаривает под вакуумом и высушивают. Положительный эффект: упрощение и сокращение продолжительности процесса, увеличение выхода и повышение активности целевого продукта.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 А 61 К 35!78

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2 1) 4868606/14 (22) 25.09,90 (46) 07.06,93. Бюл. ¹ 21 (71) Пятигорский фармацевтический институт (72) В.А.Компанцев, Н,Ш.Кайшева и

М,Н.Ивашев . (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 709091, кл, А 61 К 35/78, 1977.

{54) СПОС06 ПОЛУЧЕНИЯ СУММЫ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИИ (57) Использование: в фармацевтической промышленности, касается производства лекарственных средств из растительного сырья, Сущность изобретения: наземную часть молочая грузинского Euphorbla ibe6ca обезжиривакл хлороформом в аппарате СоИзобретение относится к фармацевтической промышленности и касается производства лекарственных средств из растительного сырья.

Цель изобретения — упрощение и сокращение продолжительности способа, увеличение выхода целевого продукта, повышение активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что способ получения суммы фенольных соединений из надземной части молочая грузинского (Euphorbla lberlca) осуществляют путем обезжиривания сырья хлороформом в аппарате Сокслета методом непрерывной экстракции (до исчезновения зеленой окраски хлороформа, вытекающего из экстрактора аппарата Сокслет) с последующим

"подсушиванием" сырья под тягой. затем одновременно осуществляют измельчение

„„Я „„1819618 А1 кслета до исчезновения зеленой окраски хлороформа, вытекающего из аппарата, и подсушивают. сырье. Затем осуществляют одновременное измельчение и экстрагирование 96%-ным этиловым спиртом при соотношении сырья: .экстрагент 1:15-1:20 методом вихревой экстракции, затем экстрагируют методом непрерывной экстракции горячим 96%-ным этанолом для менее

30 мин. Полученный экстракт отделяют от шрота фильтрованием, фильтрат упаривает под вакуумом и высушивают. Положительный эффект: упрощение и сокращение продолжительности процесса, увеличение выхода и повышение-активности целевого продукта. и экстрагирование сырья 96%-ным этиловым спиртом при соотношении сырье: экстрагент в интервале 1:15 — 1:20 способом вихревой экстракции, затем экстрагируют методом непрерывной экстракции горячим

96%-ным этанолом не менее 30 мин. далее экстракт отделяют от шрота фильтрованием через бумажный фильтр,- фильтрат упаривают под вакуумом и высушивают остаток при

70ОС. . В литературе мы не нашли сведений об аналептическом действии флавоноидов, В предлагаемом способе вихревая экстракция сырья осуществляется в приборе

"Мельэкстрактор", где одновременно происходит два процесса: измельчение и экстракция; причем, благодаря наличию двух пар ножей, расположенных горизонтально и под углом 45 к рабочей оси прибора, 1819618 измельчение сырья идет по всем направлениям с разрывом клеточных стенок, что способствует дополнительно извлечению полифенолов не только из межклеточного, но и из внутриклеточного сока, а следовательно, зто способствует увеличению выхода целевого продукта. За счет высокой скорости перемешивания в максимально короткий срок наступает равновесие в сис10 теме сырье: экстрагент, что значительно сокращает . продолжительность технологических процессов.

Дальнейшее экстрагирование сырья в аппарате Сокслета горячим этанолом спо15 собствует максимальному извлечению суммы.фенольных соединений из сырья.

Способ поясняется следующими приме-. рами конкретного выполнения.

Пример 1. 100 r надземной части молочая грузинского подвергали обезжири20 ванию в аппарате. Сокслета с 0,5 л хлороформа до тех пор, пока хлороформ, вытекающий из экстрактора аппарата Сокслета, не станет бесцветным. Затем сырье

"подсушивали" в вытяжном шкафу до удале- 25 ния остатков растворителя, после чего сырье загружали в прибор "Мельэкстрактор" ° заливали 1,5 л "96 -ного этилового спирта (комнатной темпера гуры) и перемешивали s приборе "Мельэкстрактор" при

30 скорости. вращения измельчающих ножей

8000 обор./мин в течение 5 мин. Затем сырье с экстраген1ам переносили из стакана прибора "Мельэкстрактор" s аппарат Со35 кслета и далее в нем экстрагировали сырье методом непрерывной зкстракции при температуре кипения этилового спирта в течение 30 мин. Затем экстракт отделяли от шрота фильтрованием через бумажный фильтр, Фильтрат упаривали примерно до

50 мл под вакуумом и сушили остаток в вакуум-сушильной шкафу.

Выход суммы фенольных соединений

27,65 к сырью, т.е. 27,65 r из 100 г сырья.

Общая продолжительность процесса—

2 ч.

Целевой продукт- сумма фенольных соединений из молочая грузинского — представляет собою порошок бурого цвета со специфическим запахом и горьковато-кис-. 50 лым вкусом; растворим в воде, этаноле. вытекающий из экстрактора аппарата Сокслета, не станет бесцветным. Затем сырье

"подсушивали" в вытяжном шкафу до удаления остатков растворителя, после чего сырье загружали в прибор "МельэкстракПример 2. 100 r надземной части молочая грузинского подвергали обезжириванию в аппарате Сокслета с 0,5 л хлоро- форма до тех пор, пока хлороформ, 55 тор", заливали 1 л 90 -ного этилового спирта (комнатной температуры) и перемешивали в приборе ."Мельэкстрактор" при скорости вращения измельчающих ножей

6000 обор./мин в течение 3 мин. Затем сырье с экстрагентом переносили из стакана прибора "Мельэкстрактор" в аппарат Сокслета и далее в нем экстрагировали сырье методом непрерывной экстракции при температуре кипения этилового спирта в течеwe 15 мин. Затем экстракт отделяли от шрота фильтрованием через бумажный фильтр. Фильтрат упаривали примерно до

50 мл под вакуумом и сушили остаток в вакуум-сушильном шкафу, Выход суммы фенольных соединений составляет 27,56® к сырью, т.е. 27,56 r из

100 г сырья, Общая продолжительность процесса 2 ч.

Пример 3. 100 г надземной части молочая грузинского подвергали обезжириванию в аппарате Сокслета с 0,5л хлороформа до тех пор, пока хлороформ, вытекающий из зкстрактора аппарата Сокслета. не станет бесцветным. Затем сырье "подсушивали" в вытяжном шкафу до удаления остатков растворителя, после йего сырье загружали в прибор "Мельэкстрактор", заливали 2 л

96 -ного этилового спирта (комнатной температуры) и перемешивали в приборе

"Мельэкстрактор" при скорости вращения измельчающих ножей !0000 обор./мин в течение 8. мин. Затем сырье с экстрагентом переносили из стакана прибора "Мельэкстрактор" в аппарат Сокслета и далее в нем экстрагировали сырье методом непрерывной экстракции при температуре кипения этилового спирта в течение 45 мин. Затем экстракт отделяли от шрота фильтрованием через бумажный фильтр. Фильтрат упаривали примерно до 50 мл под вакуумом и сушили остаток в вакуум-сушильном шкафу при

70оС

Выход суммы фенольных соединениИ составляет 27,64 к сырью, т,е. 27.64 г из

100 r сырья.

Общая продолжительность процесса 2 ч.

Пример 4(по способу-прототипу). 100

r измельченной надземной части молочая грузинского заливали смесью хлороформ:спирт (9:1) в количестве 1 л и экстрамровали на кипящей водяной бане 6 ч.

Полученные экстракты (6-кратная экстра-. кция) объединяли (5,5 л); упаривали на водяной бане до 1/10 (0,5 л) объема. а затем . проводили доотгонку в вакууме досуха. Остаток растворяли в 20 мл этанола, прибавляли 60 мл дистиллированной воды, перемешивали и кипятили 30 мин с водяным холодильником. Далее остывший раствор

1819618

10

20

35

55 декантировали с образовавшегося осадка (повторили 4 раза), Полученные водно-спиртовые вытяжки обьединили и упаривали в вакууме досуха.

Выход целевого продукта составил 9,17

r, или 9,17;(, к сырью.

Общая продолжительность способа — 48 ч.

Нами изучена зависимость выхода суммы фенольных соединений от ряда технологических параметров (табл. 1, 2, 3).

Из табл. 1 следует, что оптимальным соотношением сырье: экстрагент является предел 1:15-1:20, при этом обеспечивается наибольший выход суммы фенольных соединений.

Из табл. 2 следует, что оптимальной концентрацией экстрагента — этилового спирта является 96 $. т.к. это обеспечивает наибольший выход суммы фенольных соединений.

Из табл. 3 следует, что максимальный выход суммы фенольных соединений обеспечивается при продолжительности экстрагирования горячим этанолом при продолжительности не менее 30 мин.

Полученная сумма фенольных соединений была подвергнута качественному анализу:

1. Реакция с цинком.в среде соляной кислоты (на флавоноиды) 0,50 г полученной 3 суммы фенольных соединений растворяли в

10 мл 96 (,-ного этилового спирта, к раствору добавляли небольшое количество (30-50 мг) цинковой пыли. Раствор нагревали на водяной бане до кипения и оставляли на 10 мин. Раствор окрашивался в красный цвет, что свидетельствовало о наличии флавоноидов.

2. Реакция на катехины

0.50 r полученной суммы фенольных соединений растворяли в 20 мл воды. а) к 10 мл приготовленного раствора приливали 5 мл 2 -ного раствора хлорного железа, появляется зелено-черное окрашивание (катехины), 4 б) к 10 мл приготовленного раствора добавляли 5 мл 2 -ного раствора ванилина

e ..соляной кислоте, появляется малиновое. окрашивание (катехины).

3) Реакция на антоцианы

0,4 г суммы фенольных соединений растворяли в 10 мл 96 -ном этанола. а) к 5 мл приготовленного раствора добавляли 3 мл 2ф>-ного раствора ацетата свинца. Появление красного осадка свидетельствовало о наличии антоцианов. б) к 5 мл приготовленного раствора добавляли 3 мл 5 -ного раствора карбоната натрия. Появление фиолетового окрашивания свидетельствовало о наличии антоцианов,.

4. Реакция на антраценпроизводные

0,5 r суммы фенольных соединений растворяли в 5 мл 10 -ного раствора едкого натра, кипятили 5 мин. После остывания смесь разбавляли 5 мл воды и фильтровали.

3 мл фильтрата помещали в пробирку, добавляли 3 мл 10 -ного раствора соляной кислоты и 10 мл бензола, Осторожно перемешивали и после расслоения жидкости сливали бензольный слой, фильтруя его через небольшой комочек ваты. Фильтрат встряхивали с 3 мл 10 -ного раствора аммиака. Аммиачный слой приобретал вишневое окрашивание, что свидетельствовало о наличии антраценпроизводных.

5. бумажная хроматография для идентификации флавоноидов и их гликозидов.

0,5 r суммы фенольных соединений растворяли в 20 мл воды и этиловым эфиром извлекали флавонолы. Эфирный слой отделяли от водного раствора, упаривали, В водном растворе содержались гликозиды флавонолов. а) флавонолы в эфирном слое анализировали методом бумажной хроматографии (восходящий способ хроматографирования) в системе растворителей: н-бутанол-уксусная кислота-вода (4 .1:5). Пятна на хроматограмме были идентифицированы по их окраске в УФ-свете и по значениям Рг в сопоставлении с известными стандартными образцами. На хроматограмме было обнаружено 3 пятна с Rr = 0,78; 0,55; 0,58. пятно с Rt = 0,78 имело в УФ-лучах желтую окраску, два других пятна — коричневые окраски.

Пятна в сравнении со свидетелями идентифицированы как кверцетин (81=0,78); гиперозид (Rg = 0,55), изокверцитрин (Rg = 0,58). б) Флавоноловые гликозиды, содержащиеся в водном растворе анализировали методом бумажной хроматографии (нисходящий способ хроматографирования) в системе растворителей: этилацетат-пиридин-вода (2;1:2), проявителем служил кислый анилинфталат. На хроматограмме было обнаружено 1 пятно с R<- 0,175, которое в сравнении с достоверным образцом свидетеля было идентифицировано как галактоза.

Выделенная сумма фенольных соединений подвергалась изучению острой токсичности и аналептическому действию.

Острая токсичность изучалась по методу Кербера на белых мышах при внутрибрюшинном введении исследуемых . соединений в объеме 1 мл водного раствора, Максимальная доза исследуемых соединений, возможная для введения, составившая

6000 мг/кг массы тела животного, не вызывала гибели животных, что позволило считать LO 6000 мг/кг, Согласно классификации токсичности по Сидорову К.К. (1973) исследуемые соединения следует отнести к группе относительно безвредных веществ, Аналег1тическая активность изучалась на модели нембуталового сна. Известно, что большие дозы барбитуратов, в частности, нембутала (25 мг/кг массы тела) вызывают угнетение дыхания и сердечно-сосудистого центра в продолговатом мозге, в внутривенное введение приводит к остановке дыхания и резкому снижению артериального давления.

Эталонным препаратом для сравнения аналептической активности был выбран кофеин-бензоат натрия в дозе 10 мг/кг массы тела (внутрибр1ошинное введение), По современным данным этот препарат 01носится к группе как психотропных, так и к группе аналептических средств. Кофеин-бензоат натрия оказывает аналептическое действие; Ослабляет действие снотворных и наркотических средств, повышает рефлекторную возбудимость спинного мозга, возбуждает дыхательный и сосудодвигательный центры. Это лекарственное средство предложено исппл1.зовать в ка гестае стандарта при изу гении B:IBJIBIrfffgB" ской акr»Bíîñòë.

Эксперимен-.ы были проведены на крысах-самцах массо," 190-240 r. С1, :; 1овременно ставилось несколько серий эксперименmB. В каждой сер1и по ше-.- .. животных (п=-б), Первая серия — контроль (внутрибрюшинно вводили физиологи1аский pc!0TBOp), В горев серия стандартная (внутрибоюшин !О вводили кофе111-1 бензо ат натрия в дозе 10 мг/кг), I ретья серия —.

Опытная .(внутрибрlошинно вводили исследуемы е соединения - ">/Mf.ly фе1 .Ольных 00единений молочал грузинского — в дозе 10 мг/кг). Физиологический.рВВТВор, стандарт и исследуемую сумму фенольных соединений вводили за 30 мин до введения нембутала, Дозы стандарта и исследуемых фенольных соединений подбирались по эффекту LD5o. Результаты экспериментов представлены в табл. 4.

Таким образом, в результате проведен. Ных экспериментов установлено., что кофеин-бензоат натрия снижает продолжительность сна крыс на 26,82;4 по сравнению с контролем, а исследуемая сумма фенольных соединений молочая соответственно — на 50,077, т.е. сумма фенольных соединений молочая проявляет аналептиче5 ску1о активность, превышающую на 23,25 (50,07 — 26,82 = 23,25 )ь) активность стандартного препарата — кофеина-бензоата натрия, Полученные результаты являются достоверно значимыми, 10 Итак, описанный способ обеспечивает:

1. Упрочнение процесса получения суммы фенольных соединений. Способ прост в выполнении, исключает многостадийность, В то время как способ-прототип включает в I5 себя шестикратную экстракцию, четырехкратну10 Об 1аботку ocTGTKB, 2. Продолжительность способа 2 ч, способа-прототипа 48 ч, т.е. 1тродолжительность данного способа в 24 раза меньше

20 продолfкительности известного

3. Повышение выхода целевого продукта. В данном способе выход суммы фенольных сс1единений составляет 27,65;(, к исходному сырью, .то в 3 раза превышает

25 выход продукта в способе-прототипе (9,"7 / ) при использовании в качестве сырья моло IBB грузинского.

4, Повыв1ение активности целевого rfp0"

"фкта Фенольные Г Ое/1инРНИЯ из молочая, 30 полу генные предлагаемым способом, проявляют аналептическую активность, превыша1ощую на 23,25$, таковую активность эталон -;oro препарата — кофеина-бензоата натрия. Кроме того, фенольные соединения

35 мслочая явля10тся относи-:ельно безвредны. ми г1е1цествами, Формула изобретениЯ

С11особ получения суммы фенольных со40 единений из растительного сырья путем экстракции хлорогрормом, спиртом, упаривания и сушки экстракта, о т л и ч а юшийся тем, что, с цель1о упрощения и сокращения продолжительности процесса, 45 уве11иче11ия в-.,хода и повышения активности целевого иродукта, надземную часть моЛочаЯ ГРУЗИНСКОГО EuPhOrbia lberlCB

Одновременно измельчают и экстрагируют

96 -Hb3f4 o NGBHPI спиртом flpH соотноше50 нии сь1рье: экстрагент 1:15 — 1:20 методом вихревой экстракции., затем экстрагируют методом непрерывной экстракции горячим

96;/.-Ным этанолом не менее 30 мин.

1819618

Таблица 1

Влияние соотношения сырья:экстрагент на выход суммы фенольных соединений

Таблица 2

Влияние концентрации этилового спирта на выход суммы фенольных соединений

Таблица 3

Влияние продолжительности экстрагирования горячим этанолом в аппарате Сокслета на выход суммы фенольных соединений с

Таблица 4

Влияние суммы фенольных соединений молочая грузинского на продолжительность нембуталового сна (мин)