Способ определения антител к лептоспирам

Авторы патента:

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

Использование: медицинская биохимия , серологические способы диагностики инфекционных заболеваний. Сущность изобретения: в качестве антигена используют комплекс стафилококка Кован 1, с гиперимунной лептоспирозной сывороткой, коньюгированный с каталазой. 1 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4874863/14 (22) 18.10.90 (46) 07.06.93. Бюл. N. 21 (71) Среднсазиатский научно-исследовательский противочумный институт и Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии. (72) H,Â.Рудь, В,А.Шамардин, 8.М.Степанов и IG.П.Солодовников (56) Лаб. дело, вЂ” 1987, N 4, с. 319-321.

Изобретение относится к медицине, в частности, к серологической диагностике инфекционных болезней.

Цель изобретения вЂ” повышение чувствительности иммуноферментного метода при определении пептоспирозных антител.

Укаэанная цель достигается тем, что гипериммунная лептоспирозная сыворотка предварительно адсорбируется на взвесь инактивированных клеток стафилококка штамма Кован 1 и весь комплекс метится .ферментом каталазой.

Заявляемый способ отличается от прототипа сочетанием новых условий: использование взвести стафилококка дпя ориентации . антител к пептоспирам и мечение комплекса стафилакокк-антитела к лептоспирам ферментом каталазой, Эти особенности позволяют улучшить условия связывания антител с антигеном на планшете. что повышает чувствительность метода, повысить содержание каталазы на комплексе, что также повышает чувствительность метода. проводить определение антител к лептоспирам в сыворотках. независимо от их видового происхождения.

„„5U„„ 1820325А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К

ЛЕПТОСПИРАМ (57) Использование: медицинская биохимия, серологические способы диагностики инфекционных заболеваний. Сущность изобретения: в качестве антигена используют комплекс стафилококка Кован 1, с гиперимунной лептоспирозной сывороткой, коньюгированный с катапазой. 1 табл.

При изучении патентной литературы по постановке иммуноферментного метода при определении антител к лептоспирам сходных признаков по существу заявляемого способа авторами не обнаружено. С

fl р и м е р . Приготовление коньюгата по предлагаемому способу. К 1 мл 20 млрд взвеси инактивированного прогреванием в ) кипящей водяной бане в течение 5 мин стафилококка.штамма Кован 1 добавляют 1 мп лептоспирозной сыворотки в разведении

1:20. Смесь перемешивают и выдерживают в течение 60 мин при 40 С после чего триж- C) ды отмывают 0,9%-ным раствором хлорида (,А) натрия путем центрифугирования при 3000 Я об/мин в течение 10 мин. Осадок нагружен- {Л ного антитепами стафилококка ресуспендируют до 1 мл и добавляют каталазу в обьеме .1

1 мл из расчета 5 мг/мл, перемешивают и вносят 0,1 мл 1%-ного водного раствора глутарового альдегида. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 3 ч и трижды отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия, содержащего 0,05% твина-20. Осадок суспендируют в 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. содержащего 0,05% твина-20.

1820325

Для мечения комплекса стэфилококкантитела к лептоспирам нами использована каталазэ. производства США Caibiochom активностью 8512 IU/mg.

Параллельно готовили коньюгаты пероксидэзы хрена с натиглабулиноеыми сыворотками (Горьковский НИИЭМ) по известному способу и кроме того, использовали коммерческую тест-систему (Стаеропольский НПО "Аллерген" ) для определения антител к лептоспирам, На планшеты Ленинградского завода полимеров наносили лептоспироэный радоспецифический антиген в дозе 10 мкг /мл.

Планшеты выдерживали не менее 24 ч при комнатной температуре и трижды промывали 0,9%-ным раствором хлоридэ натрия, содержащего 0,05% теина-20. Кроме того, применяли планшеты. сенсибилизированные лептоспироэным родоспецифическим антигеном, производства НПО "Аллерген", Рабочие разведения полученных коньюгатов определяли путем прямой постановки ИФА (планшет с адсорбированным антитегном + коньюгат в разведениях от

1:50 до 1:3200). Результат ИФА регистрировали визуально, При постановке основных опытов на планшеты с адсорбираеанным антигенам наслаивали гомологические и гетерологические сыворотки от больных с диагнозом лептоспироз, шигеллез, эшерихиоэ, подтеержденными бактериологически. и гипериммунные сыворотки лептоспироэные, шигеллезные и эшерихиозные. Сыворотки наслаивали в объеме 0,1 мл в разведенных от 1:25 до

1:51200. После 60 мин экспозиции планшеты трижды отмывали 0.9%-ным раствором хлоридэ натрия, содержащего 0,05% теина20, Далее в планшеты вносили коныогаты е рабочем разведении: собственного приготовления вЂ” 1: 800, э коммерческие вЂ” согласно инструкции; прилагаемой к тест-системе.

После 60 мин экспозиции планшеты трижды отмывали 0,9%-ным раствором хлорида натрия, содержащего 0,05% теина-20.

Для проявления каталазы в планшеты вносили по 0,025 мл 0,3% раствора перманганата. а перед этим за 30 мин вЂ” 0,0015%ный раствор перекиси водорода. В случае присутствия каталазы происходит разложение перекиси водорода и перманганат калия не теряет своей фиолеговой окраски. В присутствии перекиси водорода перманганат калия эа несколько секунд меняет цвет на ярко желтый. Проявление пероксидазы проводили хромогенной смесью. состоящей из 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода. В случае присутствия пероксидазы цвет в лунках вЂ” коричневый или коричнево-розовый. При отсутствиивЂ” цвет слабо розовый или бесцветный. Проявление фермента в тест-системе проводили согласно инструкции.

Сравнительная чувствительность определения антител и специфичность предлагаемого метода приведены в таблице, Сравнительная чувствительность методов показала преимущества предлагаемого способа в 2-4 раза по сравнению с известным методом определения антител к лептоспирам. Результаты реакции после внесения перманганата калия четкие, появляются через несколько секунд и сохраняются е течение нескольких дней.

Специфичность предлагаемого метода проверена при внесении в планшеты с адсорбированным лептоспироэным антигеном гомологичных и гетерологичных антисывороток(таблица). Как показано, специфичность всех изучаемых методов оказалось достаточно высокой и аналогичной, Таким образом, нами разработано новое техническое решение постановки иммуноферментного метода на основе каталээы, имунной лептоспироэной сыворотки и взвеси стафилококка штамма Кован 1, с более высокой чувствительностью определения антител к лептоспирам.

Формула изобретения

Способ определения антител к nemocпирам, включающий адсорбцию антигена на твердофазном носителе, инкубацию с иммунной сывороткой и визуалиэирующим агентом. отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, е качестве антигена используют комплекс гипериммунной лептоспирозной сыворотки, адсарбироеэннай на инактивированные клетки стафилакокка штамма Кован и коньюгированный с каталаэай".

1820325

Чувствительность и специфичность методов на примере нескольких cvwopOTow гезультат реакции ю окраске в лунках при разек,енин лептослмрозной сыворотки11/Т) Ие тол

Контроль>« . лунки

«4ю

400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 l 2 3 4 к к кр б б б б б б б

Известный к

ПредлагаеВ%М w

w w w w w Р P х р х

Тест-система б б б 6 с с с с

При разведении шнгеллезной сыворотки - 1/т

25 50 100 200 400 800 1600 3200 1 2 3 4 б б б б б б G

Известный б б б б

Предлагаеi%IN P

P P P с с с

Р с с

Р w Р с С

Тест-система с

1 при разведении эшермхиоэной сыворотки I/ò

1 2 3 4

Известмьй б б б 6 б б 6 б б б 6

П редлаг аеi%IN

P Р P Р Р P P P

То хе на планшете Ставропольского 160 ндллерген"

Р w Р прн разведении лептоспнроэной сыворотки

400 800 1600 3200 6400 1с800 25600 51200 1 2 б б 6 6 б б

Известный к к к

tcp

Предлагае >й w w M

P R P w Р ж .м

Тест-систеN8 б б 6 б с с прн разведении шигеллеэной сыворотки 1/Т:

25 50 100 200 400 800 1600 3200

l 2 3 б б б б б. б б 6

Известный

Предлагаемый

Р P P P Р P P P

Тест-систес с с с с с с с с при разведенми эшерихиоэной сыворотки 1/Т б 6 6 6 6 б 6 б

Известньй

Предлагаемьй

Р Р Р D P . P P Р w Р ее в «ее»

П р и и е ч а н м е. к - коричневый цвет, кр - коричнево-розовый, 6 - бесцветный, р - розовый, w - хелтьй, с - сини3.

Контрольные лунки l - без антигена, 2 - без сыворотки, 3 " "Gåç конывгата, 4 - беэ перекиси водорода

Составитель В.Шамардин

Техред M.Mîðãåíòýë Корректор С.Юско

Редактор

Производственно-издательский комбинат Патент . r. Ужгород, у . р

У л.Гага ина, 101

Заказ 2028 Тираж ям и и ГКНТ СССР

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при

113035, Москва. Ж-ЗЬ, Раушская наб.. 4/6

Способ определения антител к лептоспирам

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для получения моноклонального антитела производного анти-гликопротеина

Способ получения эритроцитарного диагностикума для определения ортомиксо-и арбовирусов // 1817026

Способ определения вируса табачной мозаики // 1817025

Способ прогнозирования легочных осложнений в остром периоде черепно-мозговой травмы // 1815610

Изобретение относится к медицине в частности к нейротравматологйи

Способ подготовки препарата для микроскопического исследования иммунокомпетентных клеток с использованием моноклональных антител // 1814074

Способ профилактики криза отторжения кератотрансплантата // 1814073

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано при профилактике кризов отторжения кератотрансплантата

Способ оценки иммунологического статуса рабочих, связанных с вредными летучими веществами // 1813213

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения нарушения иммунологического статуса и предрасположенности к заболеваниям органов пищеварительного тракта

Способ дифференциальной диагностики ревматоидного артрита и системной красной волчанки // 1812500

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и ревматологии

Способ лечения ревматоидного артрита // 1812499

Изобретение относится к медицине, в частности к ревматологии

Способ определения фентанила в водных растворах // 1812498

Способ диагностики ранних отклонений в иммунном статусе новорожденных детей // 2101707

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для диагностики ранних отклонений в иммунном статусе новорожденных

Способ выявления высокоаффинных поли- и моноклональных антител к водонерастворимым гаптенам // 2102080

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к методам иммунохимического определения гаптенов (ксенобиотиков) в образцах биологического происхождения и объектах окружающей среды, и может быть использовано для выявления высокоаффинных поли- и моноклональных антител к водонерастворимым гаптенам

Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi // 2102081

Изобретение относится к предотвращению болезни Лайма у млекопитающих

Устройства для автоматического проведения иммуноанализа за несколько последовательных этапов по меньшей мере одного биологического вещества из множества биологических образцов, способ и реактив для применения указанных устройств // 2102758

Изобретение относится к устройству для автоматического проведения иммуноанализа за несколько последовательных этапов по меньшей мере, одного биологического вещества из множества биологических образцов, а также к способу и реактивам для использования указанного прибора

Способ обнаружения или количественного определения аналита в образце // 2102759

Изобретение относится к анализам и, в частности к катализируемому осаждению репортера через активированный конъюгат для усиления детектируемого сигнала, вследствие чего улучшается детекция и/или количество аналита в образце

Способ обнаружения или количественного определения аналита в образце // 2102759

Способ определения биологически активных веществ в жидкостях и устройство для его осуществления // 2102760

Изобретение относится к области медицины, медицинской техники, ветеринарии, экологии и может быть использовано для определения биологически активных веществ в любых биологических жидкостях, окружающей среде, пищевых продуктах, в частности в диагностике вирусных, бактериальных, паразитарных и соматических заболеваний, а также для контроля эффективности лечения

Способ диагностики спаечной болезни брюшины у детей // 2103689

Изобретение относится к медицине, а именно к детской хирургии и клинической иммунологии, и может быть использовано для диагностики спаечной болезни брюшины у детей, оперированных по поводу острого аппендицита

Способ определения функциональной активности лейкоцитов при беременности // 2103690

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и может быть использовано для оценки состояния иммунной системы беременной женщины

Способ диагностики хронического простатита // 2103691

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использовано для диагностики хронического простатита