Способ определения уровня морозоустойчивости озимой пшеницы

 

Использование: сельское хозяйство, селекция озимой пшеницы. Сущность изобретения: способ основан на существовании связи между интенсивностью ростовых процессов и уровнем морозоустойчивости у озимой пшеницы. Семена исследуемых сортов проращивают при 20°С и 16-часовом освещении в течение 5, 7 и 10 и 15 сут. и далее подвергают их двуфазному закаливанию по стандартной методике. О степени морозоустойчивости сортов судят по активности ИУК-оксидазы - ключевого фермента, принимающего участие в осуществлении регуляции роста растений. Наиболее надежные результаты на уровне способа оценки уровня морозоустойчивости сортос и селек- . ционных форм можно получить, подвергая анализу завершившие вторую фазу, закаливания 7-суточные проростки. Самая высокая активность ИУК-оксидазы обнаружена у сортов с высокой устойчивостью, наиболее низкая - у слабоморозоустойчивых сортов. Отобранные формы могут быть включены в селекционную проработку с целью создания сортов с высокой морозоустойчивостью . 4 табл. (/ С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 А 01 G 7/00

ГОСУДАРСТВЕН-ОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4926278/13 (22) 08.04.91 (46) 23.06.93. Бюл. М 23 (71) Всесоюзный селекционно-генетический институт (72) В.И.Бабенко и С.H.Áoéêî (56) Сысоев А.Ф., Красная T.Ñ. Изменение активности некоторых окислительных ферментов в проростках пшеницы при закаливании их к низким температурам. ДАН

СССР, 1967, т. 173, М 2, с. 472.

Колоша О.И., Костенко И.И. Активность бетафруктофуранидаэы как показатель морозоустойчивости растений. Сб. Методы оценки устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды. Л.. Колос, 1976, с.

151, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ MQРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ ОЗИМОЙ flLUEHVlЦЫ (57) Использование: сельское хозяйство, селекция озимой пшеницы. Сущность изобретения . способ основан на существовании

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции озимой пшеницы.

Общеизвестно, что в районах культурного земледелия периодически происходит гибель посевов озимой пшеницы под влиянием низких зимних температур. Связанная с этим явлением необходимость весеннего пересева вымерзших площадей яровыми культурами наносит народному хозяйству ощутимый экономический ущерб. .Ж 1822666 А1 связи между интенсивностью ростовых процессов и уровнем морозоустойчивости у озимой пшеницы. Семена исследуемых сортов проращивают при 20 С и 16-часовом освещении в течение 5, 7 и 10 и 15 сут. и далее подвергают их двуфазному закаливанию по стандартной методике. О степени морозоустойчивости сортов судят по активности ИУК-оксидазы — ключевого фермента. принимающего участие в осуществлении регуляции роста растений. Наиболее надежные результаты на уровне способа оценки .уровня морозоустойчивости сортос и, аелек.ционных форм можно получить. подвергая анализу завершившие вторую фазу. закаливания 7-суточные проростки. Самая высокая активность ИУК-оксидазы обнаружена у сортов с высокой устойчивость о, наиболее низкая — у слабоморозоустойчивых сортов.

Отобранные формы могут быть включены в селекционную проработку с целью создания сортов с высокой морозоустойчивостью. 4 табл.

С тем. чтобы уменьшить риск зимней гибели озимой пшеницы. селекционеры издавна работают над повышением уровня ее мороэоустойчивости. Одним из обязательных компонентов работы в этом направле. нии является экспериментальное определение устойчивости к низким отрицательным температурам селекционного материала.

Наиболее надежные и хорошо воспроизводимые результаты получают в результате промораживания в морозильных камерах.

1822666 растений при отрицательных температурах, близких к критическим значениям, Однако использование такого способа требует наличия специального оборудования, площадей для отращивания промороженных растений и др., т.е. экономически явно не выгодно, так как связано с большими затратами, включая затраты энергетического характера.

По этой причине специалисты в области физиологии растений предпринимают настойчивые попытки разработать косвенные методы определения морозоустойчивости озимых культур, не связанные со столь значительными затратными механизмами.

Исследовательскую деятельность в этом направлении нельзя назвать безуспешной, так как к настоящему времени благодаря предпринятым усилиям создан ряд косвенных методов определения уровня морозоустойчивости озимых культур . К их числу относятся и немногочисленные подходы к разработке ферментативных способов.

Так, авторы одной иэ научных разработок считают, что повышенная активность дегидрогеназ после закаливания озимой пшеницы может служить одним из показателей ее морозоустойчивости.

В качестве прототипа может служить описание определения мороэоустойчивости на основе анализа активности-фруктофуранидазы у растений, Однако как эти, так и иные научные разработки, основанные на определении активности ферментов в процессе охлаждения растений, отличаются тем недостатком, что они сложны по своему выполнению, требуют для своего осуществления высокой квалификации исполнителей, а главное, дают результаты, недостаточно надежно воспроизводимые и точные. Укаэанные недостатки не позволяют широко испольэовать известные ферментативные способы для оценки селекционного материала на морозоустойчивость. Положительное их значение заключается в расширении существующих познаний о природе свойства морозоустойчивости озимых и, что важнее, в обоснованности дальнейших поисков более тесной взаимосвязи между морозоустойчивостью и функциональной деятельностью ферментов, играющих ключевую роль в жизнедеятельности растений.

Известно, что рост — один из процессов, в первую очередь реагирующих на изменение температуры, а ключевым ферментом, регулирующим интенсивность этого процесса, является ИУК-оксидаза, которая вызывает ингибирование функциональной деятельности ростстимулирующего гормона — ИУК. Это обстоятельство обрело черты новой идеи использования ИУК-оксидазы в качестве показателя уровня мороэоустойчивости озимой пшеницы.

Возникшая идея сделала возможным выдвинуть задачу разработки лабораторного экспрессного способа, который бы отвечал требованиям ускорения и повышения

10 точности определения морозоустойчивости озимой пшеницы и упрощения его осуществления по сравнению с существующими ферментативными способами. В качестве показателя, характеризующего уровень ус"5 тойчивости озимой пшеницы к низким температурам. фигурировала величина активности рострегулирующего фермента—

ИУК-оксидазы.

Пример осуществления способа. Для

20 получения опытных проростков семена озимой пшеницы проращивали в песчаной культуре при 20 С и 16-часовой длине дня в течение 5, 7, 10 и 15 суток. Питательным субстратом служил разведенный вдвое рас25 твор Арнона-Хоглэнда. Равновоэрастные проростки по классической методике подвергали первой фазе закаливания при 2 С и круглосуточном освещении в течении 5 дней и далее второй фазе закаливания при -2 С в

30 темноте также 5 суток.

Объектом исследования служили сорта озимой пшеницы, обладающие неодинаковой морозоустойчивостью: Одесская 16, Ульяновка (высокая), Одесская 51, Миронов35 ская 808 (выше средней), Обрий, Беэостая 1, Спартанка, Грана (средняя), Сан-Пасторе, Русалка (низкая).

Ферментную вытяжку с ИУК-оксидазной активностью получали по методике Гам40 бурга из навески свежей ткани надземной части проростков 1г, которую растирали в охлажденной ступке с 10 мл 0,02 M фосфатного буфсра рН 6.1. После 30-минутной экспозиции в холодильнике гомогенат

45 центрифугировали при 8 тыс об/мин в течение 10 минуг. Для отделения ферментной вытяжки от ингибиторов эндогенной природы использовали гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25. Первые 2,5 мл

50 элюата отбрасывали, а следующие 6 мл собирали для определения ИУК-оксидаэной активности.

С этой целью готовили реакционную смесь(1 мл раствора 2,4-дихлорфенола, 1 мл

55 раствора MnCI, 2 мл раствора ИУК, 4 мл 0,02

M фосфатного буфера и 2 мл ферментной вытяжки), прокачивали ее на лабораторной качалке в темноте при 26 С. Далее отсюда через 10, 20, 30, 40 и 60 мин отбирали по 1 мл реакционной среды и переносили в про1822666 бирку с 2 мл реактива Сальковского. Окраска здесь развивается в течение 60 минут.

Перед началом колориметрирования пробирки центрифугиронали при 1 тыс об/мин в течение 5 минут.

Колориметрирование проводили на фотоколориметре при зеленом светофильтре (максимум пропускания при 490 ммк). По полученным отсчетам строили кривую динамики разрушения ИУК. Для рассчета ферментатинной активности испольэовали весь прямолинейный участок кривой, т.е. тот отрезок времени, в тече сие которого разрушение происходило с постоянной скоростью.

Рассчет активности проводили по соответствующей формуле.

Проведенные исследования показали (табл.1), что контрольные растения, пе подвергавшиеся закаливанию, после выращивания при 20 С и 16-часовой длине дня не обнаруживали дифференциаци о по признаку морозоустойчиности. l lpn этом никакой законол|ерной связи между активностью

ИУК-оксидазы и уровнем ллорозоустойчивости не было отмечено у опытных растений разного возраста.

Это обстоятельство не вызывает удивления, так как давно известно, что свойство морозоустойчиности проявляется только после охлаждения (закаливания) рзстенийл, подавления роста, перестройки регуллторно-метаболических систем н направлении развития защитных физиологических слеханизмов, которые позволяют Ihf выжить при последующем воздействии низких отрицательных температур, Активно нсгет;pyioщие растения даже наиболее морозоустойчиных сортов не способны "сопротивлятьсл" иозлейстни.о мороза, По этой причине поданлясощее большинство методов определения уровня морозоустойчиности озимых культур основано на анализе тех или i1ltèõ физиологических показателей у преднарителы.о прошедших закаливание растений. Обработка опытных растений пониженнои темперэтурой (+2 С) при круглосуточном оснещении н процессе прохождения ими первой фазы закаливания семисуточной продолжительности не привела к выявлению урозня мороэоустойчивости у исследуемых сортов озимой пшеницы по величине активности ИУК-оксидазы (табл.2), Корреляция между активностью ИУКоксидазы и морозоустойчиностью р» этом не проявлялось у проростков разного возраста (от 5 до 15 суток). Исключение составлял лишь очень морозоустойчиный сорт Одесская 16, разновозрастные проросгки кото5

55 рого обладали достоверно наиболее высокой активностью фермента.

Однако этого, бесспорно заслуживающего внимания факта, недостаточно для создания действенной системы оценки морозоустойчивости озимой пшеницы, так как сорта с разным уровнем устойчивости. но меньшей, чем у сорта Одесская 16. нивелировались.

Результаты определения активности

ИУК-оксидазы после прохождения разновозрастными проростками второй фазы закаливания и ри -3ОС н темноте в течение трех суток оказались неоднозначными. Так, у пяти- и десятисуточных проростков активность фермента «е отражала уровень морозоуссойчиности сортов, У 15-суточных пророс кон проявлялась некая тенденция воэл ожности суждения об уровне морозоустойчино ти сортов по актинности фермента. Бо t ñ> ком случае. анализируя проростки такосо возраста, можно достоверно отбирать сорта и селекццониые формы с высокой устойч,ностыю (см. табл. 3).

Предиарительньсе данные снидетельсгвонали о гом, что наиболее надежные результатië tiа уронсiе способа оцеi êè степени морозоустойчиности озимой пшеницы можно получи !, анализируя завершившие вторую фазу закаливания 7-суточные проростки, Длл проверки предан.р |тельно полу i<. I«iых данных опыт с 7 суточными и роросс к » ли был и ронеден повторно с нключе ие, и него дополнителысо трех сортов (та"., ., 1), Раз,точил н активности ферсиента между сортами, «роростки которых подвергали нерпой, :.зе эакзлина»ия, имеются, однако они iiå iiëñòîëько велики, чтобы считать их

"методе;.и и сбными". Скорее, н зтол1 случае их еле,<усг оснести к категории более или менее ",.ivåii;î выраженной тенденции.

l Ь««елее н- дежные результаты, характеризук..цие сущ .ствонаниниа взаимосвязи мороз у.гойчиности с активностью фермента, спосредованные через ростовые процессы, получены н итога анализа 7-суточных проросткон после завершения второй фазы закаливания. Необходимо подчеркнуть, что разрешающая способность технологии подготовки таких проростков к определению у них активности фермента позволяет надежно дифференцировать сорта и селекционный материал озимой пшеницы по признаку морозоустойчиности. При этом н каждом опыте долс ны фигурировать 1-2 сорта с заведомо изн стным уровнем устойчивости (контрол.,). Сравнение исследуемых сортов и форм с контролем, выращенными и эака1822666 ленными в строго аналогичных условиях, позволит проводить селекционную оценку озимой пшеницы на устойчивость к низким отрицательным температурам.

Таблица 1

Степень разрушения ИУК ферментной вытяжкой с ИУК-оксидвэной активностью в надземной части растений озимой пшеницы. обладающей неодинаковой морозоустойчивостью, после выращивания при 20 С и 16-часовой длине дня (мкг ИУК/мин 1г сырой массы) Формула изобретения

Способ определения уровня морозоустойчивости озимой пшеницы, включающий стандартное двухфазное закаливание материала, определение ферментативной активности и оценку уровня морозоустойчивости.по изменению активности по сравнениюс контролем,отличающийся тем, что, с целью упрощения, повышения досто5 верности определения и ускорения селекционного процесса путем сохранения изученных форм для дальнейшей работы, в качестве материала используют 7-суточные проростки, а оценку проводят по измене10 нию активности ИУК-оксидазы.

1822666

Таблица 2

Таблица 3

Степень разрушения ИУК ферментной вытяжкой с ИУК-оксидазной активностью в надземной части растений озимой пшеницы, обладающей неодинаковой морозоустойчивостью, после прохождения второй фазы закаливания при -3 С в темноте (мкг.ИУК/мин 1г сырой массы) Степень разрушения ИУК ферментной вытяжкой с ИУК-оксидазной активностью в надземной части растений озимой пшеницы, обладающей неодинаковой морозоустойчивостью, после прохождения первой фазы закаливания при 2 С и круглосуточном освещении (кг

ИУК/мин 1г сырой массы) 1822666

12

Продолжение табл.3

Таблица 4

Степень раэрушения ИУК ферментной вытяжкой с ИУК-оксидаэной активностью в надэемной части 7-суточных растений пшеницы, обладающей неодинаковой мороэоустойчивостью, при 20 С и 16-часовой длине дня, а также после закаливания (мкг ИУК/мин 1г сырой массы).