Способ концентрирования вирусов

 

Использование: вирусология, биотехнология, способы концентрирования вирусов при создании средств профилактики и диагностики вирусных инфекций. Сущность изобретения: вируссодержащая суспензия обрабатывается преципитирующим веществом - полиэтиленполиамином с мол.м. 16000 Д, который добавляют до конечной концентрации 0,05 - 0,2% с последующим отделением осадка и его ресуспендированием в заданном объеме. Полученные концентраты сохраняют свою активность при 4 - 8^oС. 5 табл.

Изобретение относится к вирусологии, точнее к способам концентрирования вирусов, и может быть использовано при изучении их физико-химических и биологических свойств, при создании средств специфической профилактики и диагностики вирусных инфекций сельскохозяйственных животных. Целью изобретения является снижение потерь вирусов и повышение экологичности способа. П р и м е р 1. Суспензию лапинизированного вируса ящура Азия-1 7 пассажа готовят из замороженных тушек крольчат, хранившихся в течение 2 недель при -40^оС. Вирусное сырье измельчают на коллоидной мельнице в смеси с аммиачным буфером (рН 7,6-7,8) в соотношении 1:10. Размол и суспендирование проводят в течение 10 мин (буфер предварительно охлажден до 4^оС). При постоянно включенной коллоидной мельнице в суспензию добавляют 5% хлороформа (объем/объем) и продолжают эмульгирование смеси в течение 15-20 мин. Полученную суспензию осветляют центрифугированием при 2000-3000 об/мин в течение 20-30 мин. Очищенную таким образом от балластных белков и жиров суспензию вируса инактивируют 0,035%-ным формальдегидом при температуре 25-26^оС и рН суспензии 7,8-8,0 в течение 48 ч. Для осаждения вируса в суспензию вносят полиэтиленполиамин (ПЭПА) мол.м. 16000 Д, в конечной концентрации 0,05% и рН суспензии устанавливают в пределах 7,2-7,4. После экспозиции в течение 18-24 ч надосадочную жидкость декантируют, а осадок используют в качестве антигена. Предлагаемый способ позволяет получать 20-50-кратную концентрацию ящурного антигена. П р и м е р 2. Суспензию лапинизированного вируса ящура Азия-1 7 пассажа готовят, очищают от балластных белков и жиров, инактивируют и концентрируют так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что для осаждения вируса в суспензию вносят ПЭПА (мол. м. 16000 Д) в конечной концентрации 0,1% П р и м е р 3. Суспензию лапинизированного вируса ящура Азия-1 7 пассажа готовят, очищают от балластных белков и жиров, инактивируют и концентрируют так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что для осаждения вируса в суспензию вносят ПЭПА (мол.м. 16000 Д) в конечной концентрации 0,2% П р и м е р 4. Энтеровирус свиней 7 серотипа инокулируют в культуре клеток СПЭВ и инкубируют при 37^оС в течение 24 ч. После проявления полного ЦПД матрасы промораживают. К 1000 мл вируссодержащей культуральной жидкости добавляют 50 мл хлороформа, энергично эмульгируют при 4000 об/мин в течение 5 мин. Денатурированный балластный белок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. К надосадочной жидкости добавляют 2 мл ПЭПА (мол.м. 16000 Д), что составляет 0,2% его конечной концентрации, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в 1/10 исходного объема культуральной среды. Полученный препарат титруют на культуре клеток и в дальнейшем используют для диагностических целей. Из данных, приведенных в табл. 1, видно, что увеличение концентрации ПЭПА (мол.м. 16000 Д) приводит к образованию более массивного осадка и сопровождается снижением инфекционности в надосадочной жидкости, что косвенно свидетельствует о преципитации вируса и выпадении его в осадок. Согласно полученным данным наиболее полное осаждение вируса ящура Азия-1 из вируссодержащей суспензии происходит при 0,1 и 0,2%-ной концентрации ПЭПА (мол.м. 16000 Д). Потери вируса в этом случае, судя по инфекционной активности надосадочной жидкости, составляли 0,74 и 0,11% соответственно. Приведенные в табл. 2 данные показывают, что более полное осаждение вируса в процессе концентрирования достигается внесением в очищенную суспензию ПЭПА (мол.м. 1600 Д) в сравнении с осаждением вируса в присутствии ПЭГ в концентрации 10% Различия существенные и статистически достоверны. Данные, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что образцы вакцины, приготовленные из концентрата, полученного предлагаемым способом, в 3 раза эффективнее, чем из препарата, полученного по способу-прототипу. Как видно из табл. 4, эмульсионные вакцины, приготовленные из концентратов, полученных с помощью ПЭПА (мол.м. 16000 Д) формируют напряженный иммунитет у свиней. В табл. 5 представлены данные, свидетельствующие о том, что предлагаемый способ позволяет сократить потери вируса в процессе концентрирования. Предлагаемый способ имеет следующие технико-экономические преимущества по сравнению со способом-прототипом: снижает потери вирусов в 23-36 раз; повышает в 3 раза иммуногенность образцов вакцин из концентрированных препаратов; является экологически безопасным.

Формула изобретения

СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСОВ, включающий добавление в вируссодержащую суспензию преципитирующего агента, отделение осадка с последующим его ресуспендированием в заданном объеме, отличающийся тем, что, с целью понижения потерь вируса и повышения экологичности способа, в качестве преципитирующего агента используют полиэтиленполиамин с мол. м. 16000 Д, который добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,05 0,2%

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 31-2002

(73) Патентообладатель:ЗАО "Венд-2000" (RU)

Договор № 14989 зарегистрирован 30.08.2002

Извещение опубликовано: 10.11.2002        

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 20.02.2005        БИ: 05/2005

---