Способ определения свободной воды в биологических тканях

 

Использование: в области медицины, в частности к гистологии. Сущность изобретения: образец исследуемой биологической ткани погружают в 96° этанол и термостатируют в течение часа, затем регистрируют изменение объема системы ткань-этанол (AV) через каждые 10 минут до момента его стабилизации, измеряют плотность воды (р). Весь процесс ведут в изотермических условиях , а расчет массы свободной воды (т) в исследуемом образце осуществляют по формуле m ( Способ прост в использовании и позволяет определить свободную воду в плотном образце биологической ткани . 1 табл.

(!9) (! !) (5!)5 8 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4865677/14 (22) 21.06,90 (46) 07.09.93. Бюл. М 33-36 (71) Смоленский государственный медицинский институт (72) Глотов В. А. (73) Смоленский государственный медицинский институт (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНОЙ ВОДЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ (57) Использование: в области медицины, в частности к гистологии. Сущность изобретения: образец исследуемой биологической

Изобретение относится к области техники гистологических и гистохимических исследований и может найти применение для количественного определения свободной воды в кусочках органов и тканевых образованиях одновременно с окончанием их фик. сации в этаноле.

Известен способ определения свободной воды в различных тканях организма, который основан на измерении объема воды при замораживании. Известно, что связанная вода вымерзает при температуре ниже . -20 С. Это позволяет выморозить при более высокой температуре интерстициальную и внутриклеточную свободную воду. Определение свободной воды проводят при помощи дилятометра Елекоева, состоящего из двух частей: сосудика емкостью 2,5-3 мл и манометра, изготовленного из микропипетки емкостью 0,1-0,2 мл. Исследуемую плотную ткань помещают в сосудик и заливают толуолом. При кристаллизации свободной воды ее объем увеличится примерно на 107{,. ткани погружают в 96 этанол и термостатируют в течение часа, затем регистрируют изменение объема системы ткань-этанол (Ж/) через каждые 10 минут до момента его стабилизации, измеряют плотность воды {0).

Весь процесс ведут в изотермических усло. виях, а расчет массы свободной воды (m) в исследуемом образце осуществляют по !

/ ° формуле m . Способ прост в испольэовании и позволяет определить свободную воду в плотном образце биологической ткани. 1 табл.

Указателем изменений объема служит толуол, помещенный в манометр над исследуемой тканью. Вымораживание свободной воды проводят в двух ваннах с температурой -7 и -17 С, одновременно ставится контроль с толуолом. После вымораживания С свободной воды определяют уровень толуо- C) ла в манометрах и по специальной методике, С) по этим данным рассчитывают количество (Л свободной воды в исследуемом образце. с

Недостатком этого способа является С) сложность его осуществления, он не может быть применен в практике гистологических и гистохимических исследований, так как в процессе определения свободной воды в изучаемом образце происходят необратимые нарушения целостности клеток, что является неприемлемым.

Цель изобретения — упрощение процесса определения количества свободной воды в плотных кусочках биологических тканей без их предварительного механического разру((!ения.

2000570

Цель достигается тем, что в способе определения свободной воды в биологических тканях согласно изобретению при изотермических условиях при 20-23 С образец погружают в 96 этанол и термостатируют, регистрируют изменение объема системы ткань — этанол ЛЧ от времени до момента его стабилизации, определяют плотность р воды при температуре фиксации, а.расчет массы m свободной воды в исследуемом обрэзце осуществляют по формуле I

m- ЬЧ р/0,0771.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Известно устройство для фиксации биологической ткани. содержащее сосуд с герметичной крышкой, узел подачи фиксирующего раствора, связанный с сосудом, и отводной патрубок со шкалой„размещенный в зоне горловины. Это устройство позволяет определить время окончания процесса фиксации образца биологической ткани в этаноле по динамике уменьшения объема системы ткань — этанол в иэотермических условиях, Устройство для фиксации биологической ткани (самопроизвольная утечка этанола иэ устройства после его зарядки не должна превышать 0,002 см /сут), приспособления для зарядки устройства (хлорвиниловые трубки, шприц Жане), этанол (96 ), исследуемый образец биологической ткани объемом не менее 0,1 см и не более 0,5 см з з (при обьеме образца менее 0,1 см способ

„э не работает из-за малой величины ЬЧ, а при объеме образца более 0,5 см удлиняется з время определения свободной воды свыше

4 ч помещают в термастат (ультратермостат) с погрешностью регулировки температуры не более 0,1 С и термостатируют их в течение t ч для выравнивания температур компонентов системы и устройства, при этом температура устанавливается равной температуре исследуемого образца биологической ткани (обычно 20-23 С). Образец биологической ткани укладывают на дно сосуда устройства и последнее герметично закрываютт.

После выравнивания температур производят зарядку устройства этанолом до средней части шкалы отводного патрубка.

Шакала патрубка должна иметь цену деления не более 0,002 см, а сам патрубок должен представлять из себя капилляр.

Через равные промежутки времени(1020 мин) регистрируют по шкале патрубка уровень фиксатора и отмечают его значение на трафике зависимости уровня фиксатора от времени. Регистрацию уровня фиксатора продолжают до тех пор, пока на графике не появится "плато", т.е. прямая, параллельная оси времени, По графику определяют величину hV, равную разности начального и конечного уровней фиксатора в устройстве.

По справочным таблицам определяют плотность воды о при температуре системы ткань — этанол и по формуле! рассчитывают количество свободной воды в исследуемом образце.

Предложенный способ определения свободной воды в биологических тканях основывается на следующих известных данных.

Вода в биологических тканях подразделяется на следующие типы: а) первый гидратационный слой воды; б) второй гидратационный слой. структура воды в котором несколько раэупорядочена по сравнению с обычной водой: в) псевдожидкая вода, имеющая структуру обычной воды. Типы воды б) и в) важны для транспорта солей в мембранах, для диффузии красителей в волокнах и для процессов жизнедеятельности клеток растительных и животных тканей (классификация Лука), Под слоем а) понимают связанную воду, под слоями б) и в) — свободную воду. Между связанной и свободной водой отсутствует резкая граница. поэтому различные методы измерений, основанные на регистрации разных физических явлений, дают различные соотношения в тканях между свободной и связанной водой.

В процессе фиксации биологической ткани в этаноле происходит взаимная диф40 фуэия воды из ткани в этанол и этанола в ткань, Принцип действия этанола на биологическую ткань как фиксатора основан на отнятии воды и осаждении белков.

45 Химическое строение белков нарушается этанолом минимально. Создаются новые стериохимические конфигурации белковых функциональных групп, так как происходит сжатие белковых молекул, потерявших сольватные оболочки.

Гистологические и гистохимические данные свидетельствуют о том, что после удаления иэ ткани этанола большинство молекул белков восстанавливает свое строение(обратимые реакции осаждения белков), хотя многие энзимы (дегидрогеназы) не восстанавливаются; при фиксации в этаноле происходит сильное сморщивание цитоплазмы клеток и менее выраженное сморщи2000570 вание ядра клеток; отмечен парадоксальный факт: чем выше концентрация этанола. тем менее выражено сморщивание биологической ткани, минимальное сморщивание наступает при фиксации в абсолютном 5 спирте; при длительном выдерживании биологической ткани в этаноле в ней происходят необратимые изменения: изменяется пластичность, что проявляется в ухудшении резки, резко ухудшается способность ткани 10 окрашиваться.

Восстановление строения белков после отнятия этанола, неравномерное сморщивание компонентов клетки при фиксации в этаноле. необратимые химические и физи- 15 ко-химические изменения ткани при длительном нахождении в этаноле могут быть объяснены тем, что при фиксации в этаноле (в течение оптимального времени фиксации) из биологической ткани уходит в этанол 20 только свободная вода, а при передержке в этаноле постепенно за счет диффузии вымывается оставшаяся связанная вода, что приводит к необратимым изменениям в биохимических структурах тканей. Описанный 25 парадоксальный факт объясняется тем, что, во-первых, диффузия этанола в ткань реально существует: во-вторых, что диффузия зависит от концентрации этанола: чем она выше, тем больше этанола проникает в 30 ткань, Таким образом, по косвенным гистологическим и гистохимическим данным можно сделать вывод, что из биологической ткани при фиксации в этаноле в течение оптималь- 35 ного времени фиксации, которое равно времени от начала фиксации до того момента, как на графике, отражающем динамику уменьшения объема системы ткань — этанол, появляется "плато". выходит только 40 свободная вода, Изменение объема системы ткань — этанол в процессе фиксации объясняется физико-химическим феноменом неаддитивности обьемов воды и этанола, с одной стороны, и 45 их смеси — с другой.

В процессе фиксации биологической ткани в этаноле при изотермических условиях происходят объемные изменения в системе ткань — этанол, которые можно 50 количественно описать уравнениями 2 — 5 аддитивности обьемов:

V1 + Ч4 — V5 = (V1 + Ч4 — V5) + ЛЧ: (2)

55 (Ч1+Чг+ Чз) = V;+(Чг V3) — ЛЧ : (3) (V2+ ЧЗ)+ V5= Чг+ ЧЗ+ V5+ ЛЧ; (4) ЛЧ =Ж" — ЛЧ - ЛЧ () I ЛЧ"! > IhV I; (6) I ЛЧ I > I ЛЧЯ I. (7) Соотношение (6) следует из гистологических данных по фиксации ткани в этаноле: при любых концентрациях этанола имеет место сморщивание ткани, т.е. ткань в процессе фиксации в этаноле никогда не возвращается к исходному объему.

Соотношение (7) следует из уравнения (5), где VI — объем свободной воды в ткани.

V-. — объем связанной воды в ткани;

V3 - объем сухого вещества в ткани;

V4 — объем этанола в системе, Vs — обьем этанола, перешедшего в ткань, ЛЧ, ЛЧ, bV, ЛЧ вЂ” дополнения до аддитивности объема системы, () — объем смеси.

В уравнениях 2 — 5 не учитываются объемные изменения, происходящие в системе ткан — этанол при растворении органических веществ ткани в этаноле, так как. вопервых, установлено, что наибольшее значение дополнение до аддитивности из известных бинарных эквимолекулярнык органических смесей имеет система вода— этанол, а все остальные бинарные смеси имеют значительно меньшее абсолютное значение дополнения до аддитивности; вовторых, в этаноле растворяется незначительное количество органического вещества ткани.

При помощи устройства для фиксации биологической ткани регистрируется суммарное значение дополнений до аддитивности в системе ткань — этанол ЬЧ.

В уравнении (2) величина ЛЧ появляетI ся вследствие неаддитивности обьемов воды и этанола и их смеси. В уравнениях (3) и (4) величины ЛЧ и ЛЧ вводятся по аналоII III гии с экспериментальными данными по гидратации сухого белка (эластина). Так как при дегидратации ткани суммарный объем свободной воды, вышедшей из ткани, и оставшейся ткани больше, чем объем ткани до дегидратации, то величина ЛЧ в уравнении я (3) взята со знаком "минус". В уравнении (4) суммарный обьем ткани в этаноле до смешивания больше, чем объем ткани после ее пропитывания этанолом, поэтому величина

ЛЧ имеет знак "плюс".

III

Для дополнений по аддитивности в уравнениях(2) — (5) справедливы следующие соотношения:

2000570

ЛЧ =- ЛЧ . (8) ЛЧ(Ч ) = ЛЧ;

Л(Ч1) = 0,0771 Ч1;

ЛЧ

V1 O-0771 (9) соотношения (6) и экспериментальных данных по регистрации суммарного значения дополнений до аддитивности а системе ткань — этанол при помощи устройства для фиксации биологической ткани. Суммарное значение дополнений до аддитивности имеет знак "плюс".

В уравнении (5) величины ЛЧ и ЛЧ11 взаимно частично гасятся. При фиксации ткани в абсолютном спирте их взаимное гашение будет максимальным, так как чем выше концентрация этанола, тем большее зна 1е11ие будет иметь Vg в уравнении (4), тем большее значение будет иметь величина

111

Ж и т м inåíüøåå значение будет иметь разнос;ь Ы вЂ” ЛЧЯ !, что будетдавать ме11ьшее сморщивание ткани. Это хорошо

СОГЛ Н:,ее ГС Ч 1 1Н;:тОЛОГ ИЧЕС КИМ Па РаДОКса;1ьнь1м ф-,, . г, .. пр.:веденным выше, Из зтога можно сделать следующее заключение: боя.,шая часть значения суммарного до, слнения по аддитивности в системе ткань — этанол приходится на величину bV, ! сбуслосленнyiu выходом свободной воды из ткани в зтанол. Регистрируя величину hV при помощи устройства для фиксации биологи гс cL,кани, фактически в соответствии с,".an с 1ием (5) определяют несколько .шенм «... на:а11 1е ЛЧ . Априорно допус асв . 1." li,.i3lfC ЛЧ вЂ” ЛЧ Пр11

3 11 111 е1 и л р " зтаноле настолько мала, ч;,. л ж б г llë:êå чувствительности шкалы г1аг;.У(;,:,:.-,ройс во, то да уравнение (5) и риl1ет (n д

Сос гн. з ение(8)является основнымдля определения количества свободной воды в эбразцг биологической ткани при помощи устройства для фиксации биологической ткани.

Для расчета количества свободной воды а исслсдуе бом образце по величине Лч необходимо установить характер зависимости

ЛJ(V1). С этой целью было поставлено шесть модельных опытов в устройствах для фиксации биологической ткани, имеющих разный обьем сосуда, Опыт 1. B изотермических условиях при

23 С устройство для фиксации биологической ткани заряжают 96 этанолом до начальной отметки на шкале патрубка. Через узел подачи фиксирующего раствора порциями по 0,2 см вводят в устройство 2,0 см з дистиллированной воды. Одновременно с введением каждой порции по шкале патрубка регистриру от общий объем системы. Иу ходный объем этанола в системе — 51,1 см .

Опыт М 2. То же, что и в опыте М 1, но исходный обьем этанола в системе 51,8 см, 5 Опыт М 3, Исходный объем этанола 51.7 см, Опыт М 4. Исходный обьем этанола 51,8 см.

Опыт М 5. Исходный объем этанола

10 110,4 смз.

Опыт М 6. Исходный объем этанола

109,6 см, Результаты модельных опытов М 1-6 приводятся в таблице.

15 Анализ результатов модельных опытов показывает, что зависимость общего объема системы V«<>.(V>) имеет в интервале значений 0 V> 2,0 см выраженный линейный характер и поэтому ее можно an20 проксимировать функцией вида Чсист.(V1) =

=МЧь где k = Чсист.(V>)/V>, Для каждого модельного опыта находим значения коэффициента К Получаем k1 0,83; k2 = 0,85; ka =

=0,85: k4 = 0,85; k5 = 0.90; ka = 0.88. Иэ опытов

25 следует, что величина ЛЧ при Ч4» (Vi + V

+ чь) в интервале значений 0 < ч1 а 2,0 см практически не зависит от исходного объема этанола V4, В выражение, аппроксимирующее зависимость Чсилт.(Ч)), подставляем

30 вместо коэффициента k его среднее значение, полученное по данным модельных опытов N 1-6 kcp, = 0,86. Получаем следующее выражение:

Чсист.(Ч1) - 0,86 V).

35 Известно, что при смешивании 52 объемов спирта (этанола) и 48 объемов воды получается 96,3 объемов разбавленного спирта.

При этом величина ЛЧ = 3,7 объемов. Зная эту величину и учитывая результаты модель40 ных опытов N. 1-6, можно определить вид зависимости ЛЧ(Ч ) о (%) 3,7 объемов

Vi 48,0 объемов

По справочным таблицам определяем плотность воды р при температуре фиксации, Учитывая соотношениер = m/V из формулы (9), получаем окончательное выражение (1) — формулу расчета массы свободной воды в исследуемом образце биологической ткани.

2000570

Составитель В.Глотов

Редактор А.Кучерякова Техред М.Моргентал Корректор С.Юско

Заказ 3077

Тираж Подписное

НПО " Поиск" Роспатента

113035. Москва, Ж-35. Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Так как интервал температур оптимальной фиксации находится в пределах 2023 С. V4 >> V> и чувствительность устройства для фиксации биологической ткани невысока, то изменением вида зависимости

hV(V>) в этом температурном интервале можно пренебречь. Формула (1) может быть применена без изменений при определении количества свободной воды в образце и при других температурах фиксации этого температурного интервала.

Пример, Плотный кусочек биологическойткаииобьемом0,26см при22 Спогружают в устройство дпя фиксации биологической ткани и заряжают его 96 этанолом до средней части шкалы отводного патрубка. Примерно через 3 ч обьем системы ткань — этанол стабилизируется на графике зависимости уровня фиксации в устройстве от времени появляется "плато".

Величина ЛЧ - 0,015 см . Плотность воды при 22 С / 0,9978 г/см . По формуле (1) определяют массу свободной воды в исследуемом образце:

m-194 мг.

Предложенный способ позволяет определять свободную воду в плотном образце биологической ткани, предназначенном для дальнейшего гистологического, гистохимического или морфометрического исследования, отличается простотой определения свободной воды в образце биологической

5 ткани; в процессе определения свободной воды в образце биологической ткани происходит фиксация последней.

Эти преимущества позволяют использовать предложенный способ в практике

10 гистологических, гистохимических и патологоморфопогических лабораторий.

Формула изобретения

Способ определения свободной воды в биологических тканях. включающий погру15 жение образца плотной ткани в жидкую среду с последующим расчетом количества свободной воды в нем, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения способа, образец погружают в 96 -ный этанол и термо20 статируют в течение 1 ч, затем регистрируют изменение обьема системы ткань-этанол (Л1/) через каждые 10 мин до момента его стабилизации, измеряют плотность воды (р), весь процесс ведут в изотермических усло25 виях, а расчет массы свободной воды (m) в исследуемом образце осуществляют по формуле

m (ЛЧ р) /0,0771.