Способ выделения антигена 6 возбудителя мелиоидоза
(19) RU (112 2 (51) 5 A{i1K39 02
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ
К ПАТЕНТУ < 083
Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4942087/13 (22) 04.06.91 (46) 15.12.93 Бюп. Мя 45-46 (71) Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (72) Храпова Н.П:, Смирнова В.И.; Пивень Н.Н„Прохватилова ЕВ. (73) Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА 6 ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА (57) Использование: медицина, иммунологические исследования. Сущность изобретения: исходную антигенную смесь пропускают через колонку с монокпонапьными антителами против антигена 6 возбудителя мелиоидоза конъюгированными с
CNBr-сефарозой 4В в течение 40 — 120 мин при концентрации антител 3 — 6 мг/мл геля и при рН среды 82 — 8,5 с последующей десорбцией антигена глицин — HO буфером, рН вЂ” 2,8. 2 ип„1 табл.
2004250
Изобретение относится к медицине и касается получения высокоочищенного анти епа мелиоидозного микроба, антигоена б {Агб).
Известны различные способы выделе-ния антигенных комплексов из микробных клеток возбудителя мелиоидоза, Наиболее простым является способ получения водносолевого экстракта с последующим осаждением антигенов сульфатом аммония.
Липополисахарид Р; pseudomallel может быть извлечен из клеток тремя способами: водно-молевой экстракцией, экстракцией при помощи ЭДТА и горячим водно-фенольным методом по Westphal (Яру. лин P.Ã., Фарбер С,М. Выделение и некоторые свойства липополисахарида возбудителя мелиоидоза, выделенного в Австралии//
Особо опасные инфекционные заболевания: профилактика и биологические свойства возбудителей. Сб. научн. работ. Волгоград.1989. — Вып. 4. — с. 142-145).
Близким является способ получения мелиоидозного антигенного комплекса (антигены 6 и d), пригодного для конструирования высокоактивного мелиоидозного диагностикума. Этот способ включает многоэтапную очистку комплекса антигенов 6+
d, Он не позволяет разделить два названных антигена.
Однако при проведении иммунохимических исследований различных антигенных смесей, дезинтегратов бактериальных клеток, водно-солевых экстрактов, и особенно при идентификации всех компонентов, входящих в их состав, и серотипировании различных культур P. pseudomallei необходимы стандартные моноантигены возбудителя мелиоидоза, соответствующие схеме Пивня Н.Н., Илюхина В.И. Кроме того, наличие референтных йрепаратов моноантигенов позволяет усовершенствовать существующие серологические тест-системы, направленные на выявление специфических антител против
АГб (или любого другого) в сыворотках больных и переболевших мелиоидозом экспериме нтал ьн ых животных и людей.
В ысокоочищенные антигены — необходимый ингредиент проведения. иммунологических исследований по установлению роли конкретного АГ в патогенезе заболевания. В настоящее время ни один из описанных способов очистки антигенных препаратов P. pseudomallel не обеспечивает. получение иммунохимичвски гомогенных антигенов, Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта-антигена 6 возбудителя мелиоидоза.
Цель достигается тем, что смесь водорастворимых антигенов P.pseudomallei подвергают аффинной хроматографии на колонке с моноклональным иммуносорбентом. Иммуносорбент готовят путем конъюгирования активированной CNBr-сефарозы 4В с моноклональными антителами (МКА) 2 F 11.
Штамм-продуцент MKA 2 F 11 депонирован во Всесоюзной коллекции. клеточных куль10 тур под номером ВСКК (1 I) 217Д. На штамм гибридомы PmVd-1 получено авт. св. М
1529724 А1 (заявка 4391112/30-13 от
10.03.88). Коммерческую активированную сефарозу 4В фирмы Pharmacla (Швеция) об15 рабатывают в соответствии с инструкцией фирмы изготовителя. Затем активированный гель смешивают с MKA 2 F 11 при концентрации антител 3-6 мго на 1 мл геля, времени инкубации 40-120 мин и рН среды
20 8,2-8,5. Готовым иммуноклональным иммуносорбентом заполняют хроматографическую колонку, через которую пропускают любую смесь антигенов возбудителя мелиоидоза, диализованную против трис-HCI бу25 фера, рН 8,0. Несвязавшиеся с MKA компоненты смеси элюируют с колонки этим же буфером. Десорбцию специфического антигена 6 производят глицин-HCI буфером, рН 2,8. Очиа енный таким образом
30 АГ6 иммунохимически гомогенен и серологически активен. По химическому составу он представляет собой белковолипополисахаридный биополимер с содержанием белка
167, полисахаридов — 707 и липидов-14, 35 Количество выделенного АГ6 зависит от объема иммуносорбента и величины колонки, нагрузки исходной антигенной смеси на сорбент и от удельного содержания АГ6 в этой смеси.
40 Пример 1. Изучение динамики связывания МКА2 F11 с активированной CNBrсефарозой АВ, Скорость связывания МКА с носителем определяли в течение 2 ч по изменению
45 исходной концентрации белка в супернатанте реагентной смеси.
На фиг. 1 представлены кинетические кривые присоединения МКА к активированной CNBr-сефарозе при различных исходных концентрациях иммуноглобулинов и различных рН среды, где
1- 6 мг MKA на 1 мл сорбента, рН-8,5
И вЂ” 3 мг MKA на 1 мл сорбента, рН-8,5
III — 1,5 мг МКА на 1 мл сорбента, рН-8,5
IV-1,5 мг MKA на 1 мл сорбента, рН-9,5; на фиг. 2 — иммунофореграммы антигенов возбудителя мелиондоза 1,5-ВСЭ P.
pseudomaddel ЧРА, приготовленной методом, ультразвуковой обработки микробных клеток. Концентрация 3 мгl мл. 2,3,4 — фрак2004250 ции, полученные методом аффинной хроматографии на иммуносорбенте с MKA против
АГ6. В продольные канавки внесены поликлональные сыворотки против: а, г — АГ6 5 б — антигенов обеззараженных ацетоном и высушенных микробных клеток
P.mallei 10230. в — антигенов обеззараженных ацетоном .и высушенных микробных клеток P. 10
pseudomalIei VPA, Установлено, что наиболее интенсивное присоединение ТКА против АГ6 к гелю происходит в течение первых 20 мин, через
40 мин оно достигает почти 95, а через 120 15 мин практически заканчивается. Поэтому оптимальное время коньюгирования МКА с активированным гелем равно 40-120 мин.
Пример 2. Определение оптимальных концентраций MKA 2 F 11, конъюгирован- 20 ных с активированным гелем. При подборе оптимальных концентраций МКА 2 F11, необходимых для приготовления активного иммуносорбента, активированный гель конъюгировали с различными. количествами 25 иммуноголобулина при общепринятых значениях рН среды (7,5-9,5). Затем производи- ли расчет эффективности ковалентного связывания MKA с сефарозой (см. табл. 1).
Как следует из данных таблицы, наибо- 30 лее эффективное связывание MKA 2 F11 с активированным гелем осуществляется при рН среды 8,2-8,5 и концентрации антител от
3 до 6 мг на 1 мл сефарозы. Снижение концентрации МКА до 1,5 мг уменьшает эффек- 35 тивность.связывания более, чем на 10, Увеличение рН среды до 9,5, т.е. предельно допустимого значения, незначительно по вышает скорость связывания MKA с сорбентом, но не влияет на эффективность этого 40 процесса (81%).
Поэтому для конкретных МКА оптимальными условиями коньюгирования с активированной сефарозй является следующие: концентрация иммуноглобулинов — 3-6 45 мг на 1 мл геля; рН среды коньюгирования — 8,2-8,5
Пример 3. Изучение условий десорбции специфического антигена с колонки с иммуносорбентом. Разрушение иммунных 50 комплексов с целью элюирования с колонок специфических антигоенов производят phsнообразными по химическому составу бу-. ферными . растворами с широкими диапазоном рН от 2,2 до 11,5. . 55
Оптимальные результаты получены при десорбции АГО6 0,2 M голицин-HCI буфером, рН 2,8, с.0,5 М NaCI. Так, с колонки, объемом 17,5 мл иммуносорбента, нагруженной 4,8 мг сахаров водно-солевого экстракта P pseudomallei 57576, данным буфером элюировали 0,2 мг очищенного
АГ6, что составляло 4,2 выхода от суммарной концентрации сахаров в исходной антигоеннй смеси. В случае снижения рН глицин-НCI буфера до 2,2 результаты опытов были сопоставлены с приведенными выше данными, однако пригодность иммуносорбента для повторного использования резко падала вследствие денатурирующего воздействия более кислой среды на
МКА,-иммобилиэованные на гранулах сорбента. Такой же эффект был отмечен и при использовании щелочного глицин-NaOH буфера, рН 11,5. Поэтому наиболее пригодным для десорбции АГ6 признан глицин-HCI буфер, рН 2,8.
Пример 4. Иммунохимическая характеристика очищенного АГО6.
Гомогенность и специфическая активность очищенного АГ6 подтверждена с помощью реакции иммунодиффузии в геле с поликлональной кроличьей сывороткой против антигенов возбудителя мелиоидоза и преципитирующими моноклональными антителами против АГ6. В обоих случаях зарегистрирована одна линия приципитата.
Очищенный образец идентифицирован с помощью референтной системы антигенов возбудителя мелиодоза в иммунозлектрофорезе. Выделенный антиген по всем критериям схемы Вивня Н.H., Илюхина В,И. соответствовал АГ6.
Таким образом, предлагаемый способ очистки АГ6 возбудителя мелиоидоза с помощью моноклонального иммуносорбента позволяет в процессе контакта смеси различных антигенов с сорбентом и последующей десорбции с негооспецифического антигена быстро и эффективно выделять иммунохимически гомогенный АГ6, пригодный для последующего использования в иммунохимических исследованиях. (56) Лозовой Н.В. Химические и биологические свойства антигенов возбудителя мелиоидоза // Тез. докл. научн. конф. молодых науч. сотрудников, Ростов-на-Дону. — 1964, с. 53-54, Журнал микробиология, эпидемиология и микробиология. — 1981, М 4, с. 78-82.
Ярулин Р.Г., Фарбер.С.М, В кн. Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей. Сб, науч, работ, Волгоград; 1989, вып. 4, с. 142-145.
I ° ° ° Ф Э
° ° 6 1 ° 4 ф ° . ° Ф В 1 ф ° ° е е 2004250 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Заказ 3362 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Составитель О. Шанова Редактор 8, Трубченко Техред M.Mîðlåíòàë Корректор Л. Ливринц
