Штамм бактерий кlевsiеllа рnеuмоniае, используемый для получения фимбрий

 

Использование: медицинская микробиология , диагностический препарат , антисыворотка, фимбрии К. pneu- moniae. Сущность изобретения: новый штамм Klebsiella pneumoniae TUCK № 206 стабильно продуцирует фимбрин. Его использование упрощает способ получения фимбрий как антигенного препаратаГПолучают фимбрии путем выращивания на жидкой или плотной питательной среде осаждением биомассы, дезинтеграции на механическом дезинтеграторе и центрифугированием при 10000 в течение 30 мин. Супернатант содержит фимбрии КФА-1, дает реакцию агглютинации с антисывороткой в титре 1:32-1:64. 4 пр. 1 табл сл С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (l9> (> 1> (51)5 С 12 N 1/20, A 61 К 39/02 (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к биотехнологии, и может найти применение в технологическом процессе получения Фимбрий. Последние могут быть использованы для получения специфических антисывороток и созданию на их основе диагностических препаратов.

Цель изобретения - изыскание штамма, стабильно продуцирующего фимбрии, использование которого упрощает способ получения фимбрий как антигенного препарата.

Отечественных аналогов зарегистрировано не было. Лтамм К. pneumoпрае был выденен из клинического материала больного диареей, депонирован в коллекции Государственного научноисследовательского института станГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ã1) 4892801/13 (22) 19. 11. 90 (46) 23.11.92. Бюл. ti 43 (71) Ростовский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены и

Ростовский медицинский институт (72) Л.Д.Мартыненко, Я.П.Землянкина. и Г.А.Вилков (73) Ростовский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены (56) 01 L. D.Ñ.//I. Ned. Nicrobiol.

1985. - V. 20, И 20. — Р. 203-204. (54) ШТАММ БАКТЕРИИ KLEBSIELLA PNEUМОМ1АЕ, ИСПОЛЬЗУЕМЬ1Г1 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

ФИМБРИЙ (57) Использование: медицинская микробиология, диагностический препарат, антисыворотка, Фимбрии К. pneumoniae. Сущность изобретения: новый штамм Klebsiella pneumoniae TUCK

Ю 206 стабильно продуцирует фимбрин.

Его использование упрощает способ получения фимбрий как антигенного препарата. Получают Фимбрии путем выращивания на жидкой или плотной питательной среде осаждением биомассы, дезинтеграции на механическом дезинтеграторе и центрифугированием при

10000 в течение 30 мин. Супернатант содержит Фимбрии КФА-1, дает реакцию агглютинации с антисывороткой в титре 1:32-1:64. 4 пр. 1 табл. дартизации и контроля медицинских и

1 биологических препаратов им. Л„А.Тарасевича aa tf 206.

Свойства штамма K. pneumnn4ae ,)

11 206.

Морфологические признаки. Грамотриц атель ные короткие палочки, непод-, О

1 вижны, жгутиков и опор не образуют. С)

При окраске в тушевом препарате по

Бурри установлена продукция капсулы,размер которой достигает до 1/2 диаметра тела бактериальной клетки.

Электронно-микроскопические данные; палочки с закругленными концами, размер клетки - длина 1,81>-0, l9 мкм при

m=953, ширина 1,04(-0,03 мкм при m= .

=95 Б. При просмотре более 2000 клеток жгутики не обнаружены.

Бактериальные клетки имеют фимбрии, процент клеток несущих фимбрии

1777607 составляет 88,01-96,76 при Р =0,05 (l 953, 0,1726). Фимбрии располагаются перитрихиально более 100 на каждой клетке.

Культуральные признаки. На мясопептонном бульоне через 3 ч при

37 С наступает легкое диффузное помутнение среды, через 16-18 ч - помутнение с легкой пленкой. На плотных питательных средах через 18 ч при

37+0 5 С образуют колонии, которые выглядят следующим образом: на среде Эндо: колонии темнорозового цвета (лактозопозитивные) с более темной окраской в центре, выпуклые с легким металлическим блеском, маслянистые, диаметр колоний

1,5-2,0 мм. Признаков диссоциации нет. 20 на среде К: колонии светло-жел2 того цвета с более выраженной окраской в центре, куполообразные, маслянистые, диаметр колоний 1,0-1,5 мм.

Признаков диссоциации нет. 25 на мясо-пептонном агаре: светлые полупрозрачные колонии, легко снимаются, диаметр 1,0-1,5 мм. Признаков диссоциации нет.

Физиолого-биохимические признаки. 3О

Оптимум роста 37,0 -0,5 С, оптимум рН среды — 7,0-7,2, оптимальные усло" вия - аэробные. Активно расщепляет глюкозу с образованием кислоты и газа, а также лактозу, маннит, сахарозу, мальтозу, адонит, инозит, сорбит, ксилозу, рамнозу, декарбоксилирует лизин, утилизирует цитрат и малонат натрия, обладает уреазной активностью, дает положительную реакцию Фо- 40 гес-Проскауэра. Не расщепляет дульцит, не образует сероводород и индол, в реакции метил-рот отрицательна, орнитиндекарбоксилаза, аргениндегидролаза и фенилаланиндезаминаза отсут- 4r„ ствуют.

Агглютинируется "К"-сывороткбй

К 52 и К-54 (набор К-сывороток

УНИИВИС им. И.И.Мечникова).

Чувствительность к антибиотикам.

Цтамм чувствителен к неомицину, мономицину, канамицину, полимиксину, гентамицину, устойчив к стрептомицину, эритромицину, метициллину, тетрациклину, ристомицину, пенициллину, оксациллину, карбенициллину, олеандомицину, линкомицину, фузидину, доксициклину.

Биологические свойства. Адгезивные свойства определяли по методу

Брилис B„l1. с соавт, Г13 с формалинизированными эритроцитами человека

О (1) Rh{+) группы крови. Штамм обладает свойствами адгезии средней степени: индекс адгезии - 4,48 при коэффициенте участия эритроцитов

78, средний показатель адгезии - 3,5.

Вырулентные свойствами LD для белых мышей 4 млрд. м.т.

В реакции агглютинации на стекле, в пробирках, планшетах в макро- и микроварианте штамм К. pneumoniae 206 не агглютинирует эритроциты человека I, II, III, IV групп крови, а так же эритроциты барана, кролика, белой мыши, крысы, морской свинки, золотистого хомячка и петуха.

Фимбрии штамма К„ pneumoniae

206 условно названы КФА-1 (клебсиелла, фимбрии продуцирующие адгезии 1).

Штамм К. pneumoniae V 206 является безжгутиковым стабильным продуцентом фимбрий - КФА-1.

Штамм используют следующим образом.

Пример 1. Культуру штамма К.

pneumoniae V 206 засевают в чашки

Петри с мясо-пептонным агаром или в пробирки со скошенным агаром (рН 7,07,2) и выращивают при 37+0,5 С в течение 18 ч. Одну петлю выросшей на поверхности среды культуры осторожно переносят в каплю стерильной водопроводной воды в чашке Петри и суспвндируют. Полученную взвесь наносят на предметную сетку электронного микроскопа, покрытую формваровой пленкой, обрабатывают парами формалина, контрастируют 1,53-ным раствором молибдата аммония и исспедуют в электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кв и увеличении !800021000 раз. На поверхности бактвриальных клеток обнаруживают фимбрии расположенные перитрихиально,более

100 на каждой бактериальной клетке, Процент фимбрий образующих клеток составляет 94-961.

l1 р и м е р 2. Культуру штамма К.

pneumoniae V 206 засевают в пробирку с 5 мл мясопептонного бульона (рН 7,0j,2) и выращивают при 374-0,5 С в течение 3 ч. Полученный таким образом инокулят вносят Во флаконы объемом 0,5 л со 100 мл мясопептонного

77607

Стабильность продукции фимбрий штаммом К. pneumoniae h" 206

Дата исследования

Условия хранения

Голоднь и агар

Лиафилизация

Г фимбрийобразующих клеток

Г Фимбрий=образующих клеток количество фимбрий на

1 клетке количество фимбрий на клетке

24.08.88

t1. 0 l.89

19. 07. 89

10. 01. 90

96,6

96,4

96,2

96,9

96,7

) 100

) 100

96,5

)100

) 100

97,1

)100

)100

96,9

>100

)100

5 17 бульона. Флаконы помещают на шуттельаппарат роторного типа (60 циклов в мин, шаг платформы 45 мм) и культивируют при 37+0,5 С в течение 18 ч ° По окончании культивирования культуру инактивируют азидом натрия 1:10000.

Далее препараты для электронно-микроскопических исследований получают аналогично примеру 1. Количество фимбрий на каждой бактериальной клетке, расположенных перитрихиально, сос" тавляет более 100, фимбрийобразующих клеток - 96:;.

Пример 3. В колбу объемом

3 л, содержащую 300 мл питательной среды вносят 15 мл инокулята, представляющего собой смыв суточной агаровай культуры К. pneumoniae Р 206 (5 млрд. м.т. на 1 мл). Колбу помещают на шуттель-аппарат роторного типа (60 циклов в мин, шаг платформы

45 мм) и культивируют в течение 18 ч при 37+0,5 С. По окончании культивирования культуру инактивируют азидом натрия 1: 10000. Препараты для электронна-микроскопических исследований получают как в примере 1. Количество Фимбрийобразующих клеток составляет 98:;, количество фимбрий на каждой клетке — более 100. Для отделения Фимбрий от поверхности клеток биомассу вначале осаждают центрифугированием . при 5000 об/мин в течение 30 мин при 4 С, затем осао док ресуспендируют в 0,05 M трис-НС1 буфере, рН 7,2 и подвергают обработке на механическом дезинтеграторе

"Virtus" при 20000 Рр2 в течение

5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 в течение 30 мин при 4 С.

Супернатант, содержащий фимбрии, подвергают исследованию в реакциях агглютинации с антифимбриальной сы5 вороткой К. pneumoniae КФА-1 на стекле или в планшетах для иммунологи" ческих реакций с V- или U-образным дном. Для этого на предметное стекло наносят каплю супернатанта, суспендируют с каплей антисыворотки.

При положительной реакции наблюдает ся образование хлопьев и просветление жидкости, титр препарата 1:321:64, Пример 4. Изучение способности штамма K. pneumoniae 11 206 ста" бильно продуцировать фимбрии проводи" ли следующим образом: штамм хранят на полужидком голодном агаре под

20 слоем вазелинового масла при 4 С и лиофильновысушенный, через каждые

6 мес. подвергают исследованию аналогично примеру 1.

Как видно из данных таблицы, штамм

К.pneumoniae Р 206 обладает способ" ностью стабильно продуцировать фимбрии

КФА1.

Таким образом, штамм К,pneumoniae

30 Р 206 является стабильным продуцентом фимбрий КЙА-1, что может быть использовано в производстве фимбрий как антигена, необходимого для получения специфических антисывороток и созда"

З5 нию на их основе диагностических препаратов.

Формула изобретения

Йтамм бактерий К1еЬз. е11а рпелп "

niae ГИСК Р 206, используемьй для получения Фимбрий.

1777607 г

Продолжение таЬлицы

Дата исследования

Условия хранения

Голодный агар

Лиофилизация

96,7.

>100

>100

97,6 100

)100

Редактор И.Козлова

Заказ 4131 Тираж Подписное .ВНИИПИ Государственного комитета, по иэобретенилм и открытиям йри ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Проиэводственно-иэдательский комбинат "Патент", r.ужгород, ул. Гагарина, 101

О1. 08.90

11. 09 90

Н фимбрий- количество Ю фимбрий- количество образукнцих фимбрий на образуацих фимбрий на клеток 1 клетке клеток 1 клетке

96,8

97,4

Составитель О. Гордина

Техред М.Моргентал Корректор 3.Лончакова