Способ обработки образца клеточной суспензии электрическим током для генетических исследований и устройство для его осуществления

 

Использование: в биотехнологии, а именно для введения различных молекул в клетки микроорганизмов. Сущность заключается в том, что определяют общее сопротивление клеточной суспензии и задают величину импульсного тока через клеточную суспензию, форму и длительность электрического импульса, а затем определяют амплитуду напряжения импульса с учетом общего сопротивления клеточной суспензии и заданной амплитуды тока. При этом заявляемое устройство снабжено измерителями активного сопротивления и емкости клеточной суспензии и мощным усилителем напряжения одиночного импульса с малым коэффициентом искажений, источник одиночного импульса позволяет существенно варьировать формой последнего, а кювета представлена полипропиленовой пробиркой однократного применения, содержащей электроды из полированной нержавеющей стали, причем кювета размещается в штативе, погружаемом в ледяную баню, за счет чего устраняется зависимость формы и длительность электрического импульса от электрических параметров клеточной суспензии, а также термостатирование последней при 0С. 2 с. п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для введения различных биологических молекул/гл. образом, нуклеиновых кислот/ в клетки микроорганизмов/феномен электротрансформации - см. , напр. , Тюрин М. В. Электротрансформация бактерий. Антибиотики и химиотерапия. 1992, т. 37, N 5, с. 52-55/.

Известны способы обработки клеточных суспензий с помощью импульсов электрического тока с целью введения в клетки различных биологических молекул.

Недостатками способов являются следующие их элементы. Так, при планировании экспериментов по электропорации клеток исследователи задают определенные амплитуды напряжений импульсов и приблизительную их длительность. Однако известно что движение заряженных частиц (биомолекул) в жидких средах полностью определено величиной электрического тока в соответствующих средах, Поэтому без информации о токе или общем сопротивлении данного образца клеточной суспензии подобные эксперименты и их результаты неинформативны. Кроме того, обычно в распоряжении экспериментаторов есть единственная форма электрического импульса - прямоугольная или экспоненциально убывающая. В большинстве случаев невысокое суммарное сопротивление образцов клеточных суспензий приводит к существенному непредсказуемому изменению формы базового импульса и изменению его фактической длительности, что практически невозможно воспроизвести при повторении подобных экспериментов.

Известны устройства для осуществления описанных способов, содержащих источник одиночного импульса и кювету с расположенными в ней электродами.

Общим недостатком подобных устройств является отсутствие условий для надежного термостатирования клеточной суспензии в процессе обработки импульсным электрическим током, поскольку спектрофотометрические кюветы в толстостенных пластмассовых держателях являются плохими проводниками тепла (тепловая энергия Джоуля), и при прохождении импульса тока клеточная суспензия нагревается. Однако количество выделенного в импульсе тепла пропорционально общему сопротивлению данного образца клеточной суспензии, которое традиционно не учитывают. В итоге полученные результаты не пригодны для эффективного сравнения и статистического анализа и носят характер единичных явлений, а поэтому трудно воспроизводимы. В силу названных причин существующие устройства для обработки клеточных суспензий электрическими импульсами не позволяют эффективно оптимизировать протоколы способов обработки для клеток различных типов.

Наиболее близким техническим решением к заявленному устройству является Progenetor^TM II Electroporation Unit PG 2000, выбранный в качестве прототипа.

Техническим результатом заявляемого изобретения является устранение зависимости формы и длительности импульса от электрических параметров клеточной суспензии и обеспечение разнообразных форм электрического импульса, прикладываемого к клеточной суспензии, а также надежное термостатирование последней в физиологических для клетки условиях (0^оС) в процессе обработки электрическим импульсом.

Указанная цель достигается тем, что определяют общее сопротивление клеточной суспензии на основе данных измерения активного сопротивления и емкости и задают 1) величину импульсного тока через клеточную суспензию и 2) форму и длительность импульса, а затем определяют амплитуду напряжения электрического импульса с учетом общего сопротивления клеточной суспензии и заданной амплитуды тока электрического импульса.

При этом заявляемое устройство снабжено измерителями активного сопротивления и емкости клеточной суспензии и мощным усилителем напряжения одиночного импульса с малым коэффициентом искажений формы напряжения импульса, усилитель напряжения импульса связан с источником одиночного импульса и электродами, а измерители активного сопротивления и емкости клеточной суспензии подключены к источнику одиночного импульса, обеспечивающего возможность произвольно варьировать формой импульса независимо от электрических параметров клеточной суспензии, а кювета представляет собой полипропиленовую пробирку, размещаемую в штативе, погружаемом в ледяную баню.

Заявляемый способ обработки клеточной суспензии электрическим импульсом включает: 1/задание амплитуды тока, формы и длительности одиночного импульса, прикладываемого к клеточной суспензии, 2/определение амплитуды напряжения импульса с учетом измеренных электрических параметров клеточной суспензии, 3/обработку клеточной суспензии импульсом заданных силы тока, формы и длительности при термостатировании обрабатываемой клеточной суспензии в ледяной бане, 4/высев обрабатываемой клеточной суспензии на соответствующую питательную среду для выявления в селективных условиях клеток, содержащих введенные электрическим импульсом биологические молекулы.

На чертеже представлена структурная схема устройства для обработки клеточной суспензии электрическим импульсом.

Устройство для обработки клеточной суспензии электрическим импульсом содержит источник одиночного импульса 1 и кювету 2 с расположенными в ней электродами 3, измерители активного сопротивления клеточной суспензии (R) 4 и емкости последней (С) 5, а также высококачественный усилитель напряжения одиночного импульса 6, при этом усилитель напряжения связан с источником одиночного импульса 1 и электродами 3 в кювете 2, а измерители 4 и 5 активного сопротивления и емкости соответственно подключены к источнику одиночного импульса 1, обеспечивающему различные формы электрического импульса, выбираемые с помощью осциллографа 7, а кювета 2 представляет собой полипропиленовую пробирку однократного применения объемом 0,5 см³ с вводимыми в нее электродами 3 из полированной нержавеющей стели, размещаемую в штативе, погружаемом в ледяную баню, при этом индикация напряжения электрического импульса отображается на индикаторе цифрового вольтметра 8.

П р и м е р 1. Для обработки клеточной суспензии микроорганизмов прямоугольным импульсом положительной полярности длительностью 5 мс и амплитудным значением тока через микробную суспензию 50 мА 50 мкл клеточной суспензии вносят в полипропиленовую пробирку 2 и измерителями 4 и 5 определяют активное сопротивление и емкость клеточной суспензии соответственно. Учитывая заданную амплитуду тока и общее сопротивление клеточной суспензии при заданной длительности электрического импульса, определяют необходимую величину амплитуды напряжения одиночного электрического импульса по формуле: U= I/, где U - величина амплитуды напряжения одиночного импульса; I - амплитудная величина тока через клеточную суспензию, задается; R - активное сопротивление клеточной суспензии, измеряется; C - емкость клеточной суспензии в кювете, измеряется; f - величина, обратная длительности одиночного импульса, которая задается.

Установив эту амплитуду на усилителе напряжения импульса 6 с помощью цифрового вольтметра 8, обрабатывают клеточную суспензию, термостатированную в ледяной бане, одиночным импульсом прямоугольной формы, заданных амплитуды тока и длительности. Затем электроды 3 извлекают из кюветы 2, приливают к клеткам жидкую питательную среду, в которой клетки подращивают на протяжении нескольких часов для экспрессии введенных биомолекул, в этой среде переносят на соответствующую плотную селективную питательную среду для отбора клеток микроорганизмов, содержащих введенные электрическим импульсом биомолекулы.

П р и м е р 2. Для обработки клеточной суспензии микроорганизмов синусоидальным импульсом положительной полярности источник одиночного импульса 1 переводят в положение "Синусоидальные импульсы", устанавливают длительность импульса, ориентируясь с помощью осциллографа 7, соответствующую 10 мкс, и задают амплитудное значение тока через суспензию клеток 200 мА. Далее последовательность действий соответствует описанию примера 1.

П р и м е р 3. Для обработки клеточной суспензии микроорганизмов треугольным импульсом положительной полярности источник одиночного импульса 1 переводят в положение "Треугольные импульсы", и, ориентируясь с помощью осциллографа 7, устанавливают длительность импульса 10 мкс и задают амплитуду тока через суспензию микробных клеток 5 А. Далее последовательность действий соответствует описанию примера 1.

Таким образом, реализация заявляемого способа обработки клеточной суспензии с помощью заявляемого устройства обеспечивает высокую стандартность получаемых результатов, возможность их статистической обработки, а также - при оптимизации конкретного протокола обработки для определения клеток - высокий выход клеток, содержащих введенные в них электрическим импульсом биологические молекулы.

Заявляемое устройство имеет ряд положительных свойств, благодаря которым воспроизводимость экспериментальных данных характеризуется высокой стабильностью и повторяемостью. Сюда относятся стабилизация параметров одиночного импульса за счет применения ТТЛ-микросхем и кремниевых высокочастотных малошумящих транзисторов с высоким коэффициентом передачи тока; существенный запас усилителя напряжения одиночного импульса при перегрузке по току и напряжению (короткое замыкание в кювете - электропробой) за счет использования в конечном усилительном каскаде импульсного генераторного тетрода ГМИ-83В, работающего в импульсном режиме; малое искажение усиливаемого импульсного напряжения при различных электрических параметрах клеточной суспензии, обеспечивающее независимость формы усиливаемого импульса напряжения от названных параметров нагрузки за счет осуществления питания ГМИ-83В от высоковольтного накопителя емкостью 100 мкФ и более и больших постоянных времени в цепях обеих сеток ГМИ-83В; отсутствие дополнительных защитных устройств, обычно предназначенных для мониторинга перегрузок оконечных усилительных каскадов по току и/или напряжению. Известно, что подобные защитные устройства служат частой причиной искажений выходного сигнала и нередко вызывают сбои в работе устройств, что заставляет разработчиков указанных устройств контролировать прохождение каждого импульса через клеточную суспензию, что дополнительно усложняет дизайн приборов в целом с учетом особенностей контроля высоковольтных импульсов; возможность произвольно подводить к микробной суспензии импульсы весьма разнообразной формы: базовые прямоугольные с длительностями фронтов не более 1 мкс, близкие к полуволне синусоиды, треугольные, сглаженные треугольные, импульсы в виде неравнобедренных трапеций, трапеций с модулированными ВЧ-гармониками фронтами, модулированные ВЧ-гармониками полуволны синусоид, четверти волн синусоид, экспоненциально возрастающие импульсы, пачки затухающих ВЧ-синусоидальных колебаний в пределах заданной длительности импульса и т. д. Следует отметить, что последнее свойство открывает ранее неизвестные возможности, связанные с дозированным вводом электрической энергии в систему клетки-биологические молекулы. Подобный подход до настоящего времени не нашел отражения в исследованиях и теоретических разработках отечественных и зарубежных исследователей, работающих в области бактериальной или иной электротрансформации. (56) Gene Zapper ^TM 450/2500 Electroporation System. IBI Catalog, 1990, p. 2.

Bio-Rad Gene Pulser ^R Electroporation System. Bio-Rad Katalog P. March 1990, p. 135-136.

Г. В. Зевеке и др. Основы теории цепей. М. : Энергоатомиздат, 1989, с. 77.

Progenetor ^TM II Electroporation Unit PG200. Hoefer Scientific. Instruments Catalog 1990-1991, p. 68-69.

Формула изобретения

1. Способ обработки образца клеточной суспензии электрическим током для генетических исследований, предусматривающий воздействие на образец клеточной суспензии импульсным электрическим током, отличающийся тем, что измеряют активное сопротивление и емкость образца клеточной суспензии, задают амплитуду электрического тока, его форму и длительность импульса и определяют амплитуду напряжения импульса электрического тока с учетом общего сопротивления электрическому току, проходящему через образец клеточной суспензии, и заданной амплитуды этого электрического тока, а обработку клеточной суспензии электрическим током осуществляют при этой амплитуде напряжения.

2. Устройство для обработки образца клеточной суспензии электрическим током для генетических исследований, содержащее источник одиночного импульса электрического тока и кювету с расположенными в ней электродами, отличающееся тем, что оно снабжено измерителями активного сопротивления и емкости образца клеточной суспензии и усилителем напряжения одиночного импульса, при этом последний связан с источником одиночного импульса и электродами, а измерители активного сопротивления и емкости подключены к источнику одиночного импульса, служащего для обеспечения различных форм импульса независимо от электрических параметров образца клеточной суспензии, а кювета представляет собой полипропиленовую пробирку, размещаемую в штативе, погружаемом в ледяную баню.

РИСУНКИ

Рисунок 1