Способ определения численной плотности и объема элементов микроскопических структур в тканях

 

Использование: в области медицины, в частности в области морфологии, и может применяться для определения численной плотности и объема элементов микроскопических структур в тканях. Сущность изобретения: проводят стереоморфометрическое исследование тканей на гистологических срезах с помощью накладных или окулярных сеток и телевизионных анализаторов изображения, при этом производят измерение в срезах доли площади, занимаемой сечениями исследуемых структур, а также количества их сечений на единицу мерной площади и количества пересечений на единицу длины мерной линии при разных величинах толщины проецируемых тканевых слоев, которые подбирают так, чтобы они были сопоставимыми с размерами измеряемых структур и относились друг к другу по толщине оптимально (1: 3) - (2: 3), что при использовании больших увеличений микроскопа достигается в одном гистологическом препарате путем изменения числовой апертуры окуляра от 1,25 до 0,6, а численную плотность изучаемых структур в тканях и их объем рассчитывают по формулам, приведенным в описании и формуле изобретения.

Изобретение относится к области медицины, в частности к области морфологии, и может быть использовано для определения численной плотности и объема элементов микроскопических структур в тканях.

Известен способ измерения численной плотности и объема элементов микроскопических структур с помощью общепринятой стереометрической технологии. Для всех реализуемых в рамках этого способа методик общим недостатком является возникновение проекционных эффектов, снижающих точность измерения. Это накладывает жесткие ограничения на толщину применяемых гистологических препаратов и требует введения специальных поправочных коэффициентов, что не всегда технически выполнимо и часто не обеспечивает достижение нужного результата. Отрицательное влияние на результат измерения оказывает также ограничения по форме исследуемых структур, что требует обязательной предварительной ее оценки и введения дополнительных поправочных коэффициентов, удовлетворительная точность которых не всегда технически достижима.

Целью изобретения является повышение точности измерения численной плотности и объема элементов микроскопических структур в тканях.

Цель достигается за счет устранения ограничений по форме измеряемых структур и исключения артифициального влияния проекционных эффектов, возникновения которых становится необходимым технологическим условием реализации предлагаемого нового способа стереоморфометрического исследования. Поэтому толщину проецируемых в поле зрения микроскопа тканевых слоев (h) подбирают так, чтобы она способствовала большему проявлению проекционных эффектов, т. е. была сопоставимой с размерами измеряемых структур (D - диаметром). Практически целесообразно придерживаться интервала отношения h/D = 1/20 - 3/4, что обеспечивает применение способа для измерения широкого класса структур в обычных гистологических препаратах. Необходимо учитывать, что при изучении обычных гистологических препаратов под большими увеличениями оптического микроскопа толщина проецируемого в поле зрения тканевого слоя ограничивается глубиной резкости микроскопа, а не собственной толщиной препарата.

Положительный эффект достигается за счет улавливания разницы проекционных эффектов одних и тех же структур в тканевых слоях (срезах) разной толщины. Чувствительность способа в этом отношении во многом определяется природой изучаемого объекта, качеством окраски препарата и методикой стереометрического исследования. При использовании стереометрических окулярных и накладных сеток целесообразно обеспечить также оптимальную зону отношения толщины проецируемых слоев (2/3 - 1/3). При использовании современных приборов анализаторов изображения эти требования могут быть менее жесткими.

Способ осуществляется с помощью стереометрических сеток или анализатора изображения путем последовательного измерения в срезах (тканевых слоях) разной толщины доли площади, занимаемой сечениями структуры (Р_р), их количества на единицу этой площади (N_А) и количества их пересечений на единицу длины мерной линии (N_L). Окончательный результат получают по формулам: 1) Nv= и 2) V= , где индексом ' и '' обозначены данные, полученные соответственно в срезах меньшей и большей толщины, а t - отношение большей толщины срезов к меньшей.

При изучении микроскопических структур под большим увеличением микроскопа в оптическую систему вводят объектив с переменой апертурой (типа 06М-90 с параметрами 90 х 1,25 - 0,6 - производства ЛОМО). Измерение производят в случайно взятых полях зрения с использованием последовательно большей (А_max) и меньшей (А_min) числовой апертуры объектива, задавая таким образом переменную толщину проецируемого тканевого слоя (при А_max - меньшую и при (А_min) - большую), которую ограничивает в этом случае глубина резкости микроскопа. Последняя определяется известным расчетным способом и входящую в формулы 1 и 2 величины t находят из уравнения: 3) t = , где λ - длина волны света, n - показатель преломления среды объектива и Г - общее увеличение микроскопа.

Исследование производят с соблюдением общих требований репрезентативности и статической достоверности, принятых в стереоморфометрии. С использованием 100-точечной стереометрической сетки в большинстве случаев требуется не менее 10 полей зрения.

П р и м е р. Для оценки состояния иммунной системы у умершего от механической травмы поставлена задача измерить численную плотность лимфоцитов и объем их ядер в корковом веществе вилочковой железы.

Готовим по общепринятой технологии гистологические препараты вилочковой железы. Устанавливаем оптическую систему исследовательского микроскопа с общим 756-кратным увеличением, снаряженную масляным иммерсионным объективом ЛОМО 06М-90 (90 х 1,25 - 0,6) и измерительным окуляром с окулярной стереометрической сеткой, содержащей измерительные элементы: точки (Р_т), площадь (А_т) и линии (L_Т), - откалиброванной с помощью объект-микрометра. Для данной оптической системы с А_max = 1,25, A_min = 0,6, λ = 0,5 мкм, n = 1,515 и Г = 756 по формуле 3 находим t = 3,1.

Изучаем под микроскопом препарат и в случайно взятом (в пределах коркового вещества) поле зрения производим измерения: 1. При числовой апертуре объектива 1,25 наводим резкость изображения и без перефокусировки производим подсчет точек, пересекающих сечение ядер лимфоцитов, их количество в пределах мерной площади и количество пересечений их мерными линиями.

2. Переключаем числовую апертуру объектива на 0,6 и воспроизводим те же действия.

Переходим последовательно к следующим полям зрения и повторяем в них процедуру, суммируя результат.

В 10 полях зрения при Аmax и Amin на учтенной площади стереометрической сетки подсчитано соответственно 2356 и 2908 профилей ядер лимфоцитов, их пересечений линиями - 1331 и 1658, точками - 248 и 326. При этом общая величина А_т составила по 78880 мкм2, L_т - по 12560 мкм и общее число точек Р_т - по 1000 (для А_max и A_min).

Получаем: N_A' = 2356/78880 = 0,0299 (мкм-2) и N_A'' = 2908/78880 = 0,0369 (мкм-2), N_L' = 1331/12560 = 0,106 (мкм-1) и N_L'' = 1658/12560 = 0,132 (мкм-1) P_p' = 248/1000 = 0,248 и
P_p'' = 326/1000 = 0,326
Подставляем полученные значения в формулы 1, 2 и рассчитываем окончательный результат:
Nv= × =
_{=0.0078 (мкм}-3_{)=7.8/1000 мкм}3;
× = .

Предлагаемый способ позволяет производить с высокой точностью измерения численной плотности и объема структур, приближающихся к физическим телам с односторонне выпуклой поверхностью, что характерно для широкого класса биологических объектов. Это освобождает от необходимости предварительной оценки формы измеряемых структур и расчетов поправочных коэффициентов, принятых в известных методиках стереометрического исследования. Результаты измерения могут быть дополнены точными расчетами (исключающими артифициальные влияния проекционных эффектов) других общепринятых стереометрических показателей. В частности, объемной доли структур в тканях: Vv = = Pp = VNv, которая для приведенного выше примера 27 х 0,0078 = 0,21 = 21% . Дополнительно появляются возможности получения принципиально новых расчетных показателей формы структур в тканях и другие возможности приложения, существенно расширяющие информативность стереометрического исследования.

Способ может быть использован также в металлографии и других прикладных дисциплинах небиологического профиля для решения сходных с медицинской морфометрией стереометрических задач.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛЕННОЙ ПЛОТНОСТИ И ОБЪЕМА ЭЛЕМЕНТОВ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ СТРУКТУР В ТКАНЯХ путем стереоморфометрического исследования их на гистологических срезах с помощью накладных или окулярных сеток телевизионных анализаторов изображения, отличающийся тем, что, с целью повышения точноси способа, проводят измерение доли площади, занимаемой сечениями исследуемых структур, их количество на единицу этой площади и количество их пересечения мерной линией на единицу длины при числовой апертуре окуляра от 0,6 до 1,25, а плотность N_V и объем V рассчитывают по формулам
Nv= ;
V= ,
где P и P - доля площади, занимаемая сечениями элементов структуры в препаратах при меньшей (с индексом ') и большей (с индексом '') толщине проецируемых тканевых слоев;
N и N - соответственно их количество, приходящееся на единицу площади;
- количество их пересечений мерными линиями, приходящееся на единицу длины;
t - отношение большей толщины проецируемых тканей к меньшей.