Ингибитор вируса герпеса простого i типа
Авторы патента:
Использование: медицина. Сущность изобретения: применение в качестве ингибитора вируса герпеса простого I типа фермента L-лизин- -оксидазы. Фермент подвергает необратимому окислительному дезаминированию аминокислоту L-лизин. 2 табл.
Изобретение относится к медицине.
Известно вещество, используемое в качестве ингибитора герпеса - ацекловир [1]. Однако этот препарат закупается за рубежом и для ингибирования вируса его необходимо применять в относительно больших дозах. Другие широкораспространенные наиболее эффективные противогерпетические препараты представляют собой ациклонуклеозиды типа ацекловира и флаваноиды, из которых активным в отношении ВГП-1 является лютеолин [2]. При концентрации этих препаратов 50-100 мкг/мл ингибиторный эффект, оцененный по снижению ЦПД/50 ВГП-1 на клетки, культивируемые ин витро, составляет 3,5-4 х х102. Целью изобретения является повышение специфичности вещества и снижение цитопатического действия. Это достигается тем, что в качестве ингибитора вируса герпеса простого типа используют фермент L-лизин--оксидазу. Фермент L-лизин--оксидаза обладает следующими свойствами: субстратная специфичность: подвергает необратимому окислительному дезаминированию аминокислоту L-лизин, высокая степень субстратной специфичности по отношению к основному субстрату L-лизину, значение константы Михаэлиcа-Км равно 1,40,1 10-2 мМ (субстрат L-лизин). рН-оптимум каталитической активности равен 7, 4, изоэлектрическая точка - Р равна 4,25, мол.м. по данным гель-фильтрации на сефадексе - 200 и гель-электрофореза равна 11439 кДа, молекула фермента состоит из двух идентичных субъединиц с мол. м. 60 кДа каждая, при 60оС и рН 7,4 через 2 ч инкубации в плазме крови человека и трис-НСl буфере фермент сохраняет 75% и 68% активности соответственно, ингибиторами фермента являются 4-азо-DL-лейцин и 6-диазо-5-оксинорлейцин, в замороженном или лиофилизованном виде фермент хранится в течение года без падения ферментативной активности. Для изучения ингибирующего действия L-лизин--оксидазы на экспрессию антигенов вируса герпеса простого 1 типа (ВГП-1) была использована чувствительная к репродукции вируса клеточная линия почек зеленой мартышки verо. Клетки культивировали ин витро на стандартной методике на среде РРМI, содержащей 100 ед/мл ампициллина (натриевой соли) и 10% сыворотки крупного рогатого скота. Клетки выращивали в стандартных стеклянных пробирках при 37оС. Посевная доза составляла 5х105 клеток в 1 мл культуральной среды. После образования сплошного монослоя (контроль под световым микроскопом) клетки заражали ВГП-1 из расчета 1 и 0,1 БОЕ/клетку (бляшкообразующая единица), далее культуральную среду удаляли, к монослою клеток добавляли указанные дозы вируса в 1 мл среды РРМ1 1640 и инкубировали с вирусом при 37оС в течение 30 мин. Далее вирусосодержащую жидкость удаляли, клетки трижды промывали средой и затем добавляли культуральную среду, содержащую ЛО. Результаты определения цитотоксичности на клетках приведены в табл.1. Проба на цитотоксичность считалась положительной, если количество мертвых клеток в опыте превышало на 5% их количество в контроле. Через 24 ч культуральную среду в пробирках удаляли и клетки снимали со стекла в лизирующем буфере следующего состава: 8% додуцилсульфат натрия, 30% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол в 1,25 М трис-НСl буфере рН 6,8. Лизаты прогревали при 100оС в течение 1 мин, после чего содержащиеся в лизатах белки разделяли электрофорезом в 0,5 мм блоке 12% полиакриламидного геля в присутствии 0,1% додуцилсульфата натрия по методу Ламли. Процедуру электрофореза проводили в течение 18 ч при напряжении 50 В. Электроперенос белков на нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 0,45 мкм осуществляли при силе тока 400 мА в течение 1,5 ч. Для предотвращения неспецифической сорбции нитроцеллюлозные мембраны блокировали 0,55% твин-20 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ-Т) в течение 1 ч, добавляли поликлональные иммуноглобулины против ВГП-1 в разведении 1 : 200 в ФСБ-Т и инкубировали в течение 18 ч. Несвязавшиеся иммуноглобулины удаляли (трехкратная промывка ФСБ-Т), инкубировали с конъюгатом пероксидаза - антивидовые иммуноглобулины в течение 1,5 ч, отмывали ФСБ-Т и затем окрашивали диаминобензидином или хлорнафтолом по стандартной методике. Параллельно на модели перевиваемых клеток vero проводили определение задержки размножения ВГП-1 различными концентрациями L-лизин--оксидазы. Эффект оценивали по цитопатическому действию ВГП-1 на клетки. Титр вируса составлял 10-7 ЦПД/50, исходная доза заражения 1 БОЕ/клетку, время инкубации 24 ч. Результаты представлены в табл.2. Как видно из полученных результатов, концентрация ЛО 10-2 Е/мл (0,3 мкг/мл) вызывает снижение цитопатического действия ВГП-1 на клетки, культивируемые ин витро, примерно в 100000 раз и активно подавляет экспрессию вирусных антигенов. Таким образом, можно сделать вывод, что высокоочищенные препараты L-лизин--оксидазы являются более эффективными агентами, подавляющими репродукцию ВГП-1 по сравнению с ацекловиром и лютеолином.
Формула изобретения
РИСУНКИ
Рисунок 1
Похожие патенты:
Способ получения лизоцимсодержащего продукта // 2021374
Способ получения гидролитических ферментов // 2021372
Изобретение относится к производству ферментов, а именно к способу получения гидролитических ферментов из животного сырья, например, протеаз, нуклеаз
Способ получения лигнинолитических ферментов // 2021371
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности
Способ стабилизации дезоксирибонуклеазы // 2020154
Изобретение относится к энзимологии, конкретно к способу стабилизации фермента дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы) при термической обработке или длительном хранении его водных растворов
Способ стабилизации дезоксирибонуклеазы // 2020154
Изобретение относится к энзимологии, конкретно к способу стабилизации фермента дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы) при термической обработке или длительном хранении его водных растворов
Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано для получения высокоэффективного целлюлолитического ферментного препарата, предназначенного для обработки растительного сырья, получения кормовых и пищевых продуктов из отходов сельскохозяйственного и промышленного производства
Изобретение относится к биохимии, а именно, к способу определения полисахаридов - 1,3- -глюканов, и может найти применение в микробиологической, пищевой промышленности
Иммобилизованная каталаза // 2016901
Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано для научно-исследовательских целей и в производстве препаратов крови для улучшения их качества
Способ получения щелочной фосфатазы // 2016899
Изобретение относится к энзимологии, конкретно к способу получения фермента - щелочной фосфотазы, используемого для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных заболеваний, а также для лечения расстройств опорно-двигательного аппарата
Изобретение относится к цефалоспоринацетилгидролазному гену, белку, содержащему аминокислотную последовательность, кодируемую указанным геном и представляющему собой мультимер, предпочтительно тетрамер или октамер, а также к методу получения указанного белка
Изобретение относится к получению тканевого активатора плазминогена (усовершенствованный АПТ), имеющего пролонгированный биологический полупериод существования, повышенную устойчивость к воздействию тепла и кислот и эффективный в качестве ингибитора воспаления вокруг сайта, где образован тромб
Изобретение относится к биотехнологии и позволяет получить полипептиды, используемые в качестве плазминогенных активаторов, имеющие высокую удельную амидолитическую и фибринолитическую активность
Способ получения биомассы // 2111253
Способ получения коллагеназы // 2112036
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаративной биохимии, и может быть использовано в клеточной биологии, медицинской практике для лечения ожогов, остеомиелитов, пролежней и удаления рубцов коллагена в косметических целях, косметической и парфюмерной промышленности при изготовлении кремов и мазей для омолаживания кожи, в пищевой промышленности для обработки мяса с целью улучшения его качества и питательных свойств, кожевенно-меховом производстве для получения эластичных, тонких и прочных материалов, а также в научно-исследовательской работе для изучения микроструктуры коллагена, при работе с клеточными структурами, а также с различными тканями и органами для индивидуальных интактных клеток
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения белковых гидролизатов из мясного, мясокостного, костного сырья убойных животных, и может быть использовано в пищевой и медицинской промышленности
Способ активации комплекса протеолитических ферментов поджелудочной железы убойных животных // 2112801
Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для получения белковых гидролизатов