Способ получения щелочной фосфатазы

 

Использование: изобретение относится к энзимологии, конкретно к способу получения фермента - щелочной фосфатазы, используемого для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных заболеваний, а также для лечения расстройств опорно-двигательного аппарата. Сущность изобретения: селезенку крупного рогатого скота гомогенизируют в воде при рН 0,5 - 9,0, смесь центрифугируют, высаливают надосадочную жидкость хлоридом натрия при 2 - 6°С, взятым из расчета 10 - 12% от объема раствора, растворяют активную фракцию в воде из расчета 0,1 - 0,2 объема воды к массе сырья, обессоливание проводят диализом с последующей очисткой целевого продукта осаждением и переосаждением из расчета 4 - 6 объемов этилового спирта при 0 - 4°С и сушкой. 1 табл.

Изобретение относится к энзимологии, конкретно к способу получения фермента - щелочной фосфотазы, используемого для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных заболеваний, а также для лечения расстройств опорно-двигательного аппарата.

Известны способы получения щелочной фосфотазы путем аэробной ферментации штаммов Escherichia coli [1] или Achromobacter lyticus [2] на сложных питательных средах.

Недостатками этих способов являются их длительность и невысокая активность целевого продукта (100-120 ед/мг белка).

Известен способ получения щелочной фосфатазы из кишечника крупного рогатого скота [3].

Однако удельная активность фермента также не превышает 150 ед/мг белка.

Наиболее близким к заявленному является способ получения щелочной фосфатазы из сгустков крови, остающихся после выделения γ-глобулина [4].

Согласно этому способу сырье гомогенизируют в воде при рН 5,4, затем гомогенат центрифугируют, из надосадочной жидкости высаливают сначала балластные белки, а затем целевой продукт путем последовательного добавления возрастающих концентраций сернокислого аммония, после чего целевого продукт очищают диализом, хроматографией на геле гидроокиси алюминия, повторным диализом и сушат.

Недостатки известного способа заключаются в его многостадийности (16 стадий) и сложности в техническом исполнении, длительности (около 95 ч), незначительном выходе (0,2-0,5% к массе исходного сырья) и низкой удельной активности фермента (130-160 ед/мг белка).

Целью изобретения является упрощение и интенсификация технологического процесса, увеличение выхода и удельной активности щелочной фосфатазы.

Это достигается тем, что в способе получения щелочной фосфатазы, включающем гомогенизацию сырья в воде, центрифугирование, высаливание надосадочной жидкости, растворение активной фракции в воде, обессоливание диализом, очистку и сушку, в качестве сырья используют селезенку крупного рогатого скота (к.р.с.), гомогенизацию сырья проводят при рН 8,5-9,0, высаливание - хлоридом натрия при 2-6^оС, взятым из расчета 10-12% от объема раствора, растворение проводят из расчета 0,1-0,2 объема воды к массе сырья, а очистку - осаждением и переосаждением из 4-6 объемов этилового спирта при 0-4^оС.

Предложенный способ отличается от известного использованием другого сырья и других приемов выделения и очистки целевого продукта. Эти отличия приводят к упрощению и интенсификации технологического процесса, увеличению выхода и удельной активности щелочной фосфатазы. Следовательно, предложенное техническое решение заявителя соответствует критерию изобретения "существенные отличия".

Заявленная совокупность признаков на дачу подачи заявки неизвестна, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения критерию изобретения "новизна".

Использованные в предложенном способе стадии и параметры технологического процесса являются необходимыми и логически обоснованными.

Щелочная фосфатаза является ферментом, продуцируемым различными органами и тканями млекопитающих. Как показали исследования, она содержится в крови, сыворотке, лимфе, печени, кишечнике, но наиболее высокое ее содержание выявлено в селезенке к.р.с. Поэтому этот орган выбран в качестве объекта исследования.

Как и в случае известного способа для извлечения щелочной фосфатазы был использован прием гомогенизации сырья в воде, однако рН среды выбран не 5,4, а 8,5-9,0, поскольку рН 5,4 соответствует изоэлектрической точке фермента, в то время как рН 8,5-9,0 является оптимумом его активности [2].

При осуществлении процесса высаливания щелочной фосфатазы в предложенном способе предусматривается использование не сернокислого аммония, а хлорида натрия, поскольку выбранные концентрации NaCl (10-12% к объему фильтрата) позволяют осадить практически полностью целевой продукт. Кроме того, освобождение от ионов Cl^- при последующем диализе происходит значительно быстрее, чем от ионов SO₄^2-.

Вместе с тем следует учитывать, что наиболее полное формирование осадка, а следовательно, и максимальное выделение щелочной фосфатазы достигаются при высаливании в условиях низких температур (2-6^оС). При более высоких температурах процесс высаливания в значительной степени замедляется.

Очистку целевого продукта в предложенном способе проводят путем последовательного осаждения и переосаждения из 2-4 объемов этилового спирта при 0-4^оС, что позволяет в более полной степени освободиться от примесей белковой и небелковой природы в отличие от хроматографии на геле Al(OH)₃, используемой в известном способе.

Важно подчеркнуть, что другие осаждающие соединения, такие как ацетон или этилацетат, не приводят к положительному результату, поскольку целевой продукт при этом подвергается денатурационным изменениям, влекущим за собой снижение его удельной активности.

П р и м е р 1. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2 л воды, подщелоченной 1 н. раствором NaHCO₃ до рН 8,5, при 20^оС в течение 1 ч. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин, надосадочную жидкость отделяют и к 2 л раствора добавляют 200 г NaCl (10% от объема раствора), смесь перемешивают до растворения соли и выдерживают при 2^оС в течение 4 ч. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин, растворяют в 100 мл воды (0,1 объема к массе сырья) и центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость отделяют и диализуют против воды при 20^оС в течение 18 ч. 100 мл диализата вливают в 400 мл этилового спирта, предварительно охлажденного до 0^оС, выдерживают 2 ч, осадок отделяют, растворяют в 100 мл воды, центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин, надосадочную жидкость отделяют, вливают в 400 мл этилового спирта, охлажденного до 0^оС, выдерживают 2 ч, осадок отделяют и сушат в вакууме. Получают 20 г (выход 2% к массе сырья) щелочной фосфатазы с удельной активностью 450 ед/мг белка (удельную активность щелочной фосфатазы определяли по количеству фосфора, отщепляемого от β-глицерофосфата).

П р и м е р 2. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2,5 л воды, подщелоченной до рН 8,75, при 22^оС в течение 1,5 ч. Смесь центрифугируют 10 мин, надосадочную жидкость отделяют и к 2,5 л раствора добавляют 275 г NaCl (11% от объема раствора), смесь перемешивают до растворения соли и выдерживают при 4^оС 6 ч. Осадок отделяют центрифугированием 10 мин, растворяют в 150 мл воды (0,15 объема к массе сырья) и центрифугируют 10 мин. Надосадочную жидкость отделяют и диализуют против воды при 22^оС в течение 21 ч. 150 мл диализата вливают в 750 мл этилового спирта, охлажденного до 2^оС, выдерживают 5 ч, осадок отделяют, растворяют в 150 мл воды, центрифугируют 10 мин, надосадочную жидкость отделяют, вливают в 750 мл этилового спирта, охлажденного до 2^оС, через 5 ч осадок отделяют и сушат в вакууме. Получают 22,5 г (выход 2,25% к массе сырья) щелочной фосфатазы с удельной активностью 505 ед/мг белка.

П р и м е р 3. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 3 л воды, подщелоченной до рН 9,0, при 25^оС в течение 2 ч. Смесь центрифугируют 10 мин, надосадочную жидкость отделяют и к 3 л раствора добавляют 360 г NaCl (12% от объема раствора). Смесь перемешивают до растворения соли и выдерживают при 6^оС 8 ч. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 200 мл воды (0,2 объема к массе сырья) и центрифугируют 10 мин. Надосадочную жидкость отделяют и диализуют против воды при 25^оС 24 ч. 200 мл диализата вливают в 1200 мл этилового спирта, охлажденного до 4^оС, через 8 ч осадок отделяют, растворяют в 200 мл воды, центрифугируют 10 мин, надосадочную жидкость отделяют, вливают в 1200 мл этилового спирта, охлажденного до 4^оС, через 8 ч осадок отделяют и сушат в вакууме. Получают 25 г (выход 2,5% к массе сырья) щелочной фосфатазы с удельной активностью 560 ед/мг белка.

При изменении заявленной совокупности существенных признаков положительный эффект не достигается, что подтверждается сравнительными примерами 4-15.

П р и м е р 4. 1 кг измельченной селезенки свиной гомогенизируют в 2 л воды, подщелоченной до рН 8,5, и далее поступают, как в примере 1. Получают 9,4 г щелочной фосфатазы (выход 0,94% к массе сырья) с удельной активностью 400 ед/мг белка.

П р и м е р 5. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2 л воды, подщелоченной до рН 8,0, и далее поступают, как в примере 1. Получают 18,8г г щелочной фосфатазы (выход 1,88% к массе сырья) с удельной активностью 310 ед/мг белка.

П р и м е р 6. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2 л воды, подщелоченной до рН 9,5, и далее поступают, как в примере 1. Получают 18,5 г щелочной фосфатазы (выход 1,85% к массе сырья) с удельной активностью 275 ед/мг белка.

П р и м е р 7. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2 л воды, подщелоченной до рН 8,5, и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что количество NaCl составляют 8% от объема надосадочной жидкости. Получают 2,4 г (выход 0,24% к массе сырья) щелочной фосфатазы с удельной активностью 380 ед/мг белка.

П р и м е р 8. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в воде, подщелоченной до рН 8,5, и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что количество NaCl составляет 14% от объема надосадочной жидкости. Получают 34 г порошка (выход 3,4% к массе сырья) с удельной активностью 25 ед/мг белка.

П р и м е р 9. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2 л воды, подщелоченной до рН 8,5, и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что высаливание надосадочной жидкости проводят при 0^оС. При этом получают такое же количество щелочной фосфатазы (20 г) с той же удельной активностью (450 ед/мг белка), что и вы примере 1, что свидетельствует о нецелесообразности снижения температуры высаливания.

П р и м е р 10. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2 л воды при рН 8,5 и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что высаливание надосадочной жидкости проводят при 8^оС. При этом осадок формируется только через 12 ч, что приводит к нерациональному удлинению технологического процесса.

П р и м е р 11. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2 л воды при рН 8,5 и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что осадок после высаливания NaCl растворяют в 250 мл воды (0,25 объема к массе сырья). Получают целевой продукт с тем же выходом (2%) и удельной активностью (450 ед/мг белка), что и в примере 1, что свидетельствует о нецелесообразности увеличения количества воды для растворения осадка вследствие излишнего расхода реактивов на дальнейшие технологические операции.

П р и м е р 12. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2 л воды при рН 8,5 и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что осадок после высаливания NaCl растворяют в 50 мл воды (0,05 объема к массе сырья). Пpи этом образуется густая суспензия, не разделяющаяся при центрифугировании, вследствие чего выделение целевого продукта становится невозможным.

П р и м е р 13. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2 л воды при рН 8,5 и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что для осаждения и переосаждения фермента используют 3 объема этилового спирта, охлажденного до -2^оС. При этом осадок плохо формируется, и выход целевого продукта составляет лишь 0,3% к массе сырья.

П р и м е р 14. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2 л воды при рН 8,5 и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что для осаждения и переосаждения фермента используют 7 объемов этилового спирта при 6^оС. Получают целевой продукт с тем же выходом (2%) и активностью (450 ед/мг белка), что и в примере 1, что свидетельствует о нецелесообразности увеличения объема этилового спирта для осаждения щелочной фосфатазы.

П р и м е р 15. 1 кг измельченной селезенки к.р.с. гомогенизируют в 2 л воды при рН 8,5 и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что для осаждения и переосаждения фермента используют ацетон. Получают целевой продукт (выход 2% к массе сырья) с удельной активностью 210 ед/мг белка.

Сопоставительный анализ технико-экономических показателей заявленного объекта и известного способа приведен в таблице.

Из таблицы видно, что как по известному, так и по предлагаемому способу получают щелочную фосфатазу с идентичными характеристиками (оптимум рН). Предлагаемый способ позволяет упростить и сократить более чем в 2 раза технологический процесс, повысить выход целевого продукта в 6,4 раза и его удельную активность в 3,7 раза.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ, включающий гомогенизацию сырья в воде, центрифугирование, высаливание надосадочной жидкости, растворение активной фракции в воде, обессоливание диализом, очистку и сушку, отличающийся тем, что, с целью упрощения и интенсификации технологического процесса, увеличения выхода и удельной активности щелочной фосфатазы, в качестве сырья используют селезенку крупного рогатого скота, гомогенизацию сырья проводят при рН 8,5 - 9,0, высаливание - хлоридом натрия при 2 - 6^oС, взятым из расчета 10 - 12% объема раствора, растворение проводят из расчета 0,1 - 0,2 объема воды к массе сырья, а очистку - осаждением и переосаждением из расчета 4 - 6 объемов этилового спирта при 0 - 4^oС.

РИСУНКИ

Рисунок 1