Способ получения иммуносорбента для связывания группоспецифических антител - и - -агглютининов

 

Изобретение относится к медицинской химии и иммунологии, конкретно к биоспециолитическим сорбентам для удаления из крови, плазмы, сыворотки, а также препаратов крови антител с групповой специфичностью A и B. Цель изобретения упрощение способа и улучшение качества сорбента. Для этого аминопропилированный макропористый носитель сначала обрабатывают поли(4-нитрофенилакрилатом) или поли(4-нитрофенилметакрилатом) с М.М. 4 80 кДа в количестве 40 50 мг на 1 г носителя в диметилформамиде или диметилсульфоксиде, а затем аминоалкилгликозидом дисахарида A(B) в количестве 2 10 мкмоль.

Изобретение относится к медицинской химии и иммунологии, конкретно к биоспецифическим сорбентам, представляющим собой твердые носители с иммобилизованными на них синтетическими олигосахаридами. Такие сорбенты предназначены для удаления антител с групповой специфичностью А и В/ α и β-агглютининов/ из крови, плазмы, сыворотки, а также препаратов крови, например, при получении антирезусных диагностических сывороток.

Цель изобретения упрощение способа и улучшения качества сорбента.

П р и м е р 1. Получение сорбента В.

К 1 г аминопропиллированного макропористого стекла (МПС) прибавляют раствор 40 мл поли/4-нитрофенилакрилата/ в 2 мл ДМФА, выдерживают, периодически встряхивая, в течение 15 ч, промывают ДМФА. К полученному активированному носителю прибавляют раствор 3 мг /7,5 мкмоль/ /3-аминопропил/-3-0-/α -D-галактопиранозил/- β -D-галактопиранозида в 2 мл ДМФА, выдерживают в течение суток, периодически встряхивая, затем прибавляют 0,4 мл этаноламина, через 2 ч промывают сорбент ДМФА, затем этанолом, эфиром, высушивают. Полученный сорбент содержит 7,5 мкмоль, дисахаридного лиганда на 1 г МПС. Перед использованием полученный сорбент промывают водой, затем рабочим буферным раствором.

П р и м е р 2. Получение сорбента А.

К 1 г аминопропилированного МПС прибавляют раствор 50 мг поли/4-нитрофенилметакрилата/ММ 4 кД в 2 мл ДМФА, выдерживают, периодически встряхивая, в течение 15 ч, промывают ДМФА. К полученному активированному носителю прибавляют раствор 4 мг /7,5 мкмоль/ /3-аминопропил/-3-0-/ α -D-N-ацетилгалактозаминил/- β-D-галактопиранозида в 2 мл воды, выдерживают в течение суток, периодически встряхивая, затем прибавляют 1 мл 20%-ного раствора аммиака, через 2 ч промывают сорбент водой, затем ацетоном, гексаном, высушивают. Полученный сорбент содержит 10 мкмоль дисахаридного лиганда А на 1 г МПС.

П р и м е р 3. Получение сорбента В.

К 1 г аминопропилированного МПС прибавляют раствор 45 мг поли/4-нитрофенилакрилата/MM 80 кД в 2 мл ДМФА, выдерживают, периодически встряхивая, в течение 15 ч, промывают ДМСО. К полученному активированному носителю прибавляют раствор 0,8 мг /2 мкмоль/ /3-аминопропил/-3-0-/ α -D-галактопиранозил/- β-D-галактопиранозида в 2 мл ДМСО, выдерживают в течение суток, периодически встряхивают, затем прибавляют 0,5 г Триса /основание/, выдерживают, встряхивая, 15 ч, промывают ДМСО, ацетоном, пентаном, высушивают. Полученный сорбент содержит 2 мкмоль дисахаридного лиганда B на 1 г МПС.

П р и м е р 4. Определение степени десорбции лиганда с сорбента.

Бесполимерный вариант /сорбент Ф/.

К 0,5 г аминопропилированного МПС в 5 мл 0,1 М бикарбонатного буфера /рН 8,4/ добавляют раствор 1,2 мг ФИТЦ в 0,1 мл ДМФА, перемешивают в течение 15 ч при 20^оС, промывают водой.

Полимерный вариант /сорбент ФП/.

К 0,5 активированного полимером МПС, емкостью 100 мкмоль/г в 5 мл 0,1 М бикарбонатного буфера прибавляют раствор 1,2 мг ФИТЦ в ДМФА, выдерживают 15 ч при 20^оС, прибавляют 0,2 мл этаноламина, через 2 ч промывают водой.

Элюция.

Через сорбенты Ф и ФП пропускают в течение суток в замкнутом контуре следующие растворы: фосфатно-солевой буфер /рН 7,4/; 1%-ный раствор аммиака; глицин-солянокислый буфер /рН 2,8/.

Отбирают равные объемы элюатов, измеряют флуоресценцию полученных растворов. При всех значениях рН сорбент ФП показывал значения флуоресценции меньше, разница составляла 10-50 раз.

П р и м е р 5. Удаление антител с групповой специфичностью В из сыворотки крови доноров.

5 мг сухого сорбента, полученного по примеру 1, промывают водой, затем фосфатно-солевым буфером /ФСБ/, выдерживают при 4-20^оС с 0,5 мл сыворотки крови доноров группы крови А или 0 в течение 1-3 ч. Титр сыворотки определяли до и после сорбции стандартным методом солевой агглютинации.

Десорбцию антител проводят, промывая несколько раз сорбент буферным раствором 1%-ного аммиака /pH 9/ или глицин-солянокислым буфером /pH 3/, затем промывают водой, спиртом, сорбент высушивают. После этого сорбент можно хранить или использовать повторно для сорбции антител. Неспецифическая сорбция не наблюдалась совсем или составляла 1 ступень.

П р и м е р 6. Удаление антител с групповой специфичностью А из сыворотки крови доноров.

50 мг сухого сорбента А, полученного по примеру 2, промывают водой, затем ФСБ, выдерживают при 4-20^оС с 0,5 мл сыворотки крови доноров группы крови В или О в течение 1-3 ч. Титр сыворотки определяли до и после сорбции стандартным методом солевой агглютинации. Десорбцию проводили, как описано в примере 5.

Принципиальное преимущество предлагаемого способа от прототипа заключается в том, что лиганды присоединены к носителю не непосредственно, а при помощи полимера, причем полимера гибкого, что позволило заменить трисахариды на дисахариды, которые значительно проще синтезировать (9 стадий вместо 15).

В отличие от использованных в прототипе ацилазидов аминоалкилгликозиды дисахаридов стабильны. Благодаря многоточечному связыванию полимер /а вместе с ним и ковалентно присоединенный к нему лиганд/ прочнее примерно на два порядка присоединен к носителю, чем при присоединении без полимера. Это показано в специально проведенных экспериментах с флуоресцентно меченым лигандом, присоединенным двумя сравниваемыми способами /проводилась многочасовая элюция в замкнутом контуре при различных значениях рН/. Равномерно распределенные по поверхности МПС молекулы полимера в значительной степени предотвращают разрушение элементов крови при проведении сорбции. Кроме того сорбент, полученный предлагаемым способом, можно использовать многократно, более 9 раз, после регенерации кислым /pH 3/ или щелочным /pH 9/ буферным раствором. Сорбенты выдерживают длительное более 1,5 лет хранение в сухом виде, стерилизацию спиртом. Синтез стабильно воспроизводится.

Прямое сравнение сорбентов, полученных данным способом, с синсорбами (Канада), т. е. прототипом, показало их лучшую сорбционную активность, меньшую неспецифическую сорбцию, большую долговечность /количество циклов регенерации/.

Неспецифической сорбции, т. е. сорбции анти-А антител сорбентом В /или наоборот/ практически не наблюдалось. В то же время специфическая сорбция составляет 3-4 ступени /ступень-логарифм₂ титра сыворотки, т.е. снижение титра на 4 ступени означает снижение концентрации антител в 16 раз/, в способе-прототипе специфическая сорбция составляет 2-3 ступени.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ ГРУППОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ α- и β -АГГЛЮТИНИНОВ путем присоединения группоспецифического олигосахарида крови A (B) к макропористому носителю, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и улучшения качества сорбента, аминопропилированный макропористый носитель сначала обрабатывают поли(4-нитрофенилакрилатом) или поли(4-нитрофенилметакрилатом) мол. м. 4 80 кДа в количестве 40 50 мг на 1 г носителя в диметилформамиде или диметилсульфоксиде, а затем аминоалкилгликозидом дисахарида A (B) в количестве 2 10 мкмоль дисахарида на 1 г носителя в тех же растворителях или воде, затем гидрофильным амином или аммиаком.