Штамм клеток растительной ткани женьшеня - продуцент гинзенозидов

 

Использование: биотехнология, в частности культура растительных клеток - продуцентов биологически активных веществ. Сущность изобретения: получен штамм клеток растительной ткани женьшеня - продуцент гинзенозидов, обеспечивающий повышенный выход указанных веществ при соотношении, близком к соотношению гинзенозидов и природном корне женьшеня.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения биологически активных метаболитов растительной ткани женьшеня, выращиваемой в искусственных условиях, и может быть использовано в медицинской, пищевой промышленности, в парфюмерии, в других отраслях производства, где могут найти практическое применение продукты метаболизма женьшеня.

В 50-е годы было установлено, что культивирование изолированных клеток женьшеня в искусственных условиях позволяет получать метаболиты, образуемые растением женьшеня в естественных условиях. С этого времени довольно интенсивно проводятся работы, направленные на совершенствование методов управляемого культивирования клеток женьшеня и, в частности, по изысканию высокопродуктивных штаммов клеточных культур.

Описан целый ряд штаммов клеточных культур женьшеня, активно развивающихся на плотных средах.

Однако, разработка техники суспензионного культивирования клеточных культур снизила интерес к методикам выращивания клеточных культур поверхностным способом.

Известны многочисленные штаммы клеток женьшеня, способные к росту в суспензионных условиях.

К сожалению, в большинстве случаев описания штаммов не сопровождаются информацией о продуктивности штаммов, в том числе о спектре образуемых метаболитов, что затрудняет оценку их пригодности для промышленного использования.

Описан штамм клеток женьшеня R-1, образующий порядка 3,3 мг гинзенозидов на 1 г сухой биомассы.

Этот штамм получен в результате трансформации клеток женьшеня плазмидами Agrobacterium rhizogenu и его использование для получения препаратов медицинского назначения нежелательно. Кроме того штамм R-1 культивируют только на агаризованных средах.

Описаны штаммы клеток женьшеня Pg-1 и Pg-4, накапливающие 3,2-9,5 мг гинзенозидов в 1 г сухой биомассы.

Упоминаемые штаммы представляют собой культуры изолированных корешков, а не каллусных клеток и их промышленное выращивание требует использования нестандартного оборудования.

Штамм Pg-4, растущий также в виде каллусной культуры и синтезирующий до 6,5 мг/г гинзенозидов, имеет низкий индекс роста (2,89) и большую продолжительность цикла выращивания в суспензионной культуре (28 сут).

Известен высокопродуктивный штамм клеток женьшеня, накапливающий до 33 мг/г гинзенозидов.

Относительным недостатком этого штамма является то, что соотношение биосинтезированных им гинзенозидов существенно отличается от соотношения этих наиболее ценных биологически активных веществ в корне натурального женьшеня. Кроме того, индекс роста этого штамма довольно низок (1,5), а продолжительность цикла выращивания велика (28 сут).

Запатентован штамм клеток женьшеня Halle-E, который может культивироваться в суспензионных условиях с продолжительностью цикла выращивания 14-16 сут.

Содержание гинзенозидов в клеточной биомассе оценивается количественным анализом агликонов и поэтому сделать вывод о соответствии состава гинзенозидов в культивируемых клетках составу гинзенозидов в натуральном корне женьшеня не представляется возможным.

В качестве наиболее близкого аналога предлагаемого штамма (прототипа) выбран используемый в промышленных масштабах штамм клеток женьшеня ИФРЖ-1, поскольку предлагаемый штамм также предназначен для промышленного использования.

Штамм-прототип выращивается на жидких и плотных средах, индекс его роста составляет 8,8-9, длительность цикла культивирования 14 сут.

Авторы штамма ИФРЖ-1 не приводят данных о количественном и качественном составе гинзенозидов, по исследованиям других авторов гинзенозиды в этом штамме не обнаружены или встречается в следовых количествах (0,015 мг/г).

Недостаток штамма-прототипа состоит в очень низком выходе гинзенозидов.

Цель изобретения изыскать штамм клеток женьшеня, способный к активному росту в суспензионных условиях, образующий повышенное количество гинзенозидов, соотношение которых близко к соотношению гинзенозидов в натуральном корне женьшеня.

Цель достигается в результате селекционной работы, приведшей к изолированию штамма клеток женьшеня ДАН-25, отвечающего предъявляемым к нему требованиям.

Штамм клеток женьшеня ДАН-25 был получен из корня шестилетнего растения женьшеня, выращенного в естественных условиях на Дальневосточной зональной опытной станции.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур высших растений Института физиологии растений Российской Академии Наук под коллекционным номером 49.

Штамм поддерживается методом пересевов, может расти как на плотных (агаризованных), так и на жидких средах. Прошел в культуре 58 пассажей без утраты основных свойств.

Предлагаемый штамм имеет следующие основные характеристики.

Морфолого-культуральные признаки.

Представляет собою агрегированную довольно рыхлую клеточную массу со специфическим запахом и горьковатым вкусом. Окраска от светло-желтой до темно-желтой вплоть до коричневой. В редких случаях наблюдается формирование корешков белого цвета длиной 1-2 см.

Индекс роста составляет 2,1-5,0 по сырой и сухой биомассе.

Количество живых клеток в суспензии 50-90% Культивируют при 26^оС, влажности 60-90% в темноте на жидких или плотных средах следующего состава, мг/л: Калий азотно-кислый 2400-2700 Кальций хлористый 640-665 Магний серно-кислый 360-375 Калий фосфорно-кислый однозамещенный 160-180 Аммоний серно-кислый 160-180 Кислота борная 6,0-6,4 Марганец серно-кислый 21,5-23,0 Цинк серно-кислый 8,0-9,0 Натрий молибденово- кислый 0,2-0,3 Тиамин хлорид 0,18-0,22 Инозит 80-120 Гидролизат казеина 40-60 Индолил-3-масляная кислота 1,8-2,2 Кинетин 0,07-0,12 Сахароза 30000-35000 Железо серно-кислое 26-28 Трилон Б 36-38 Пиридоксин 0,4-0,6 Калий иодистый 0,8-0,9 Кобальт хлористый 0,02-0,03 Медь серно-кислая 0,02-0,03 Никотиновая кислота 0,4-0,6 Цистеин 0,4-0,6 Агар 7000-8000 Жидкая среда имеет тот же состав, но не содержит агара.

Содержание солей дано в рассчете на их кристаллогидраты.

Культивирование проводят в стеклянных колбах объемом 750 и 250 мл при уровне заполнения свежей средой 1/4-1/5.

При выращивании на жидкой среде перемешивание обеспечивается помещением на качалку с 90-110 об/мин.

Цитологическая характеристика.

Каллусная и суспензионная культуры состоят из меристемо- и паренхимоподобных клеток, значительное число клеток имеет промежуточные признаки, характерные для обоих типов клеток.

Клетки овальной или вытянутой формы. В суспензионной культуре могут присутствовать отдельные клетки неправильной формы выгнутые, грушевидные и др. Корнеподобные клеточные структуры включают клетки со спиральным утолщением стенок.

Средние размеры каллусных клеток 48/1˙36/0 мкм/ максимальный диаметр 110 мкм/ минимальный диаметр 14 мкм.

Суспензия состоит главным образом из агрегатов, отдельные клетки встречаются и составляют менее 6% максимальные размеры агрегатов 3-4 см.

Митотическая активность характеризуется одновершинной кривой. Максимальные значения митотического индекса 1,5-2,5% наблюдали на 7-10 сутки культивирования.

Кариологическая характеристика.

Количество хромосом в клетках вариирует от 21 до 91, модальный класс не выражен, среднее число хромосом 47.

Характеристика продуктов вторичного метаболизма.

Штамм продуцирует гинзенозиды (гликозиды тритерпеноидов даммаранового ряда) Rg1, Rg2, Re, Rb1, Rb2, Rd, Rf, Ng-R2 и Rc, характерные для корня женьшеня. Набор гинзенозидов в течение цикла роста вариируется. Общее содержание гинзенозидов в биомассе составляет в среднем 7,1 мг/г сухой биомассы.

Соотношение групп Rb/Rg составляет в среднем 1.

Выход гинзенозидов в среду не наблюдается.

Сравнительная характеристика предлагаемого и некоторых известных штаммов клеток женьшеня, показывающая преимущества предложенного штамма, приведена в нижеследующей таблице.

Результаты показывают, что штамм ДАН-25 среди изученных обладает свойствами, наиболее благоприятными для его промышленного использования.

П р и м е р 1. Штамм ДАН-25 культивируют на твердой питательной среде, указанного ниже состава, мг/г, пересевая на свежую среду каждые 30 сут: Калий азотно-кислый 2550 Кальций хлористый 665,0 Магний серно-кислый 375,0 Тиамин хлорид 0,22 Инозит 120,0 Гидролизат казеина 60,0 Калий фосфорно-кислый однозамещенный 180,0 Аммоний серно-кислый 180,0 Кислота борная 6,4 Марганец серно-кислый 23,0 Цинк серно-кислый 9,0 Натрий молибденово-кислый 0,3 Калий иодистый 0,9 Кобальт хлористый 0,03 Медь сернокислая 0,03 Индолил-3-масляная кислота 2,2 Кинетин 0,12 Сахароза 350000 Железо серно-кислое 26,0 Трилон Б 38 Пиридоксин 0,6 Никотиновая кислота 0,6 Цистеин 6,0 Агар 8000,0 Посевной материал высевают на твердую питательную среду в количестве 60 г/л того же состава. Культивирование проводят в колбах объемом 250 мл, заполненных 50 мл агаризованной питательной среды в темноте при 26^оС. Всего используют 20 колб.

На 35 сутки выращивания биомассу снимают с поверхности твердой питательной среды, взвешивают и анализируют на состав гинзенозидов. Всего собирают 252,3 г сырой (12,7 г) сухой биомассы. Индекс роста составляет 4,2 и 4,5 по сырой и сухой биомассе, соответственно.

Среднее содержание гинзенозидов составляет 8,55 мг/г воздушно-сухой биомассы, анализ состава показывает наличие следующих гинзенозидов: Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Re, Rf, Ng-R2, Rg2. Соотношение групп Rb/Rg составляет 1,3.

П р и м е р 2. Для получения посевного материала штамм ДАН-25 выращивают в жидкой питательной среде того же состава, что указан в примере 1, но без агара. Культуру пересевают каждые 14 сут.

Посевной материал в количестве 80 г/л вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, заполненные 100 мл жидкой питательной среды. Всего используют 10 колб, размещенных на качалке с числом оборотов 100 об/мин. Культивирование проводят в течение 16 сут в темноте при 26^оС.

После завершения культивирования собирают 265 г сырой (15 г сухой) биомассы, индекс роста составляет 3,3 и 3,6 по сырой и сухой биомассе, соответственно. Среднее содержание гинзенозидов составляет 12,1 мг/г воздушно-сухой биомассы, спектр гинзенозидов включает следующие вещества: Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rf, Rd, Ng-R2 и Rg2. Соотношение групп Rb/Rg составляет 0,87.

П р и м е р 3. Для получения посевного материала штамм ДАН-25 выращивают в жидкой питательной среде, указанной в примере 1, но не содержащей агара, в колбах объемом 750 мл, помещенных на качалку (100 об/мин). Культуру пересевают каждые 14 сут. Посевной материал в количестве 80 г/л (20 колб) вносят в ферментер объемом 12 л, заполненный 4 л свежей жидкой питательной среды. Культивирование проводят в темноте при 26^оС, числе оборотов мешалки 100 об/мин и расходе воздуха 25 л/л ч в течение 14 сут. По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды на фильтре. Всего получают 1084 г сырой (61,8 сухой) биомассы. Индекс кода составляет 2,3 и 2,4 по сырой и сухой биомассе, соответственно. Биомасса содержит гинзенозиды Rb1, Rb2, Rg1, Rg2, Rf, Re, Rc, Ng-R2 и Rd. Общее количество гинзенозидов составляет 5,4 мг/г сухой биомассы, соотношение групп гинзенозидов Rb/Rg 0,92.

Формула изобретения

Штамм клеток растительной ткани женьшеня ВСКК-ВР N 49 - продуцент гинзенозидов.

РИСУНКИ

Рисунок 1