Штамм гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l., испольуемый для получения моноклональных антител к дигоксину

 

Использование: клиническая биотехнология, разработка иммуноаналитических систем для определения дигоксина в крови. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, который продуцирует моноклональные антитела (МКА) к дигоксину. Штамм D-22 получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/с с клетками миеломы Х63 Ag. 865.3. МКА относятся к подклассу IgGI, константа аффинности антител составляет 5·10⁹M^-1 МКА специфически связываются с дигоксином, их перекрестная реактивность с аналогами данного лекарственного препарата составляет 8,9% 2 ил. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (мкАТ) к дигоксину.

Сердечный глигозид дигоксин обладает узким терапевтическим интервалом, из-за чего при его применении возможны нежелательные побочные токсические явления. Для повышения безопасности и эффективности терапии необходим контроль за концентрацией препарата в организме больного и индивидуальный подбор дозы. Это стало возможным после появления доступных иммуноаналитических методов для измерения концентрации этого препарата в крови. Для иммуноанализа дигоксина необходимы высокоспецифические антитела, которые при этом должны быть и высокоаффинными. Поэтому получение антител к дигоксину нужного качества является довольно сложной задачей. Свойства поликлональных антител варьируют от животного к животному и только некоторые антидигоксиновые сыворотки оказываются пригодными для анализа, например из 30 кроликов только один давал сыворотку нужного качества (Butler V P, 1977 Pharmacological Reviews 29(2) 103-184). Большие возможности для получения антител с заданными свойствами открываются при использовании гибридомной технологии. Поэтому в нескольких лабораториях было предпринято несколько попыток получения моноклональных антител к дигоксину (J. Immunol. 129,3,1165-1172, (1982); Int. J. Immunol. 5,5,397-402, (1983); Methods Find. Exp. Clin. Pham. 12,4,265-271 (1990); Molecular Immunology, 22,4,477-488 (1985), US Patent 4803167, 1989).

Во всех работах для получения конъюгатов дигоксина с белками использовали один и тот же метод, который еще ранее показал свою эффективность при получении поликлональных антител к дигоксину (Smith T.W. Biochemistry 9/2, 331-337, 1970). Используемые линии мышей и миеломных линий варьировались. Описаны моноклональные антитела с аффинностью от 10 до 10 М. Однако при описании антител не всегда дается полная характеристика их специфичности и тем более пригодности для иммуноанализа.

Наиболее полно охарактеризованы антитела, полученныe группой американских исследователей Mudgett-Hunter M, Anderson W, Haber E, Margolies M N, (J. Immunol. 129,3,1165-1172, (1982); US Patent 4803167, 1989), поэтому их способ выбран нами в качестве прототипа.

В качестве прототипа выбран способ получения моноклональных антител к дигоксину, в котором для получения гибридом авторы иммунизировали мышей линии А/J конъюгированным антигеном дигоксина с человеческим сывороточным альбумином и спленоциты сливали с клетками миеломной линии SP2/0-Ag14 (Патент США 4803167, 1989). Полученные моноклональные антитела имеют константу аффинности 1,3˙10⁹ М^-1 и дают значительные перекрестные реакции с другими гликозидами, заявленные антитела взаимодействуют с дигоксигенином только в 2,7 раза слабее, чем с дигоксином, т.е. перекрест составляет 37% Между тем для целей иммуноанализа особенно важно отсутствие перекрестных реакций с метаболитом дигоксина дигоксигенином.

Целью данного технологического решения было получение гибридных культивируемых клеток мыши линии BALB/с, продуцирующих мкАТ, обладающие высокой аффинностью и специфичностью и пригодные для разработки иммуноаналитических тест-систем для определения концентрации дигоксина в биологических жидкостях.

Для получения гибридомных клеток, продуцирующих мкАТ, сливали клетки мышиной миеломной линии Х63.Ag 865.3 и сплентоциты мыши линии BALB/c, иммунизированной конъюгированным антигеном дигоксина с гемоцианином из моллюска keyhole limpet.

Мыши иммунизировались в течение 3-4 месяцев, периодически сыворотка животных анализировалась на присутствие антител к дигоксину.

Анализ осуществляли твердофазным иммуноферментным методом, в качестве антигена использовали конъюгированный антиген дигоксина с бычьим сывороточным альбумином. У животных с высоким титром антител к дигоксину брали селезенки и выделяли из них клетки для слияния.

Миеломная линия Х63.Ag8.653. стабильная миеломная линия, не секретирующая иммуноглобулины, была выбрана в качестве второго партнера для слияния. Слияние клеток проводили с использованием полиэтиленгликоля. Отношение числа селезеночных клеток к числу миеломных клеток варьировали от 5:1 до 1:1. После слияния клетки разбавлялись и культивировались в селективной среде, содержащей аминоптерин, гипоксантин и тимидин до появления растущих клонов. Супернатанты анализировали твердофазным иммуноферментным методом, в качестве антигена использовали конъюгат дигоксин-БСА, антитела обнаруживали с помощью кроличьих антител к IgG мыши, меченных пероксидазой хрена, так что выявились только клоны, продуцирующие антитела класса G.

Дополнительный анализ синтезируемых антител производили по ингибированию дигоксином и его аналогами связывания антител с сорбированным конъюгатом дигоксин-БСА. Положительные клоны повторно клонировали. Из положительных клонов был выбран клон D22, продуцирующий антитела наиболее аффинные и с минимальной перекрестной реактивностью по отношению к аналогам дигоксина. Кафф антител D22 составляет 5 10 М, что превышает Кафф аналога. Клон продуцирует антитела, относящиеся к подклассу IgG1. Важной характеристикой гибридомы D22 является ее стабильность и способность расти в асцитных опухолях.

Для получения больших количеств антител гибридные клетки вводили внутрибрюшинно мышам, предварительно сенсибилизированным пристаном. Антитела из асцитных жидкостей выделяли ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе. На основе полученных мкАт был разработан метод иммуноферментного определения дигоксина, позволяющий определять дигоксин в 10 мкл сыворотки крови с большой точностью и специфичностью.

Кроме того пригодность полученных антител для иммуноанализа оценивали, используя их в ките фирмы Boehringer Mannhaim, где они также продемонстрировали хорошие результаты.

Штамм получают следующим образом.

1. Иммунизация.

Мышей линии ВАLB/c, самок, иммунизировали внутрибрюшинно 100 мкг конъюгированного антигена дигоксин-гемоцианин, полученного известным способом (Smith T. W. Biochemistry 9/2, 331-337, 1970), суспендированного в 100 мкл физиологического раствора и 200 мкл полного адъюванта Фрейнда. Инъекцию повторяли через 6 недель и далее через 2-4 недели с неполным адъювантом. Через 7 дней после последней иммунизации у мышей брали кровь и сыворотки анализировали на присутствие антител твердофазным иммуноферментным методом. Для завершающей иммунизации отбирали мышей, в сыворотках которых обнаруживали наибольший титр антител к дигоксину. За 3 дня до гибридизации таким мышам вводили по 100 мкг антигена без адъюванта.

2. Твердофазный иммуноферментный метод обнаружения антител к дигоксину.

Конъюгированный антиген дигоксин-БСА, полученный по тому же методу, что и дигоксин-гемоцианин, растворяли в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,6 в концентрации 0,3 мкг/мл и сорбировали на полистироловых 96-луночных планшетах по 100 мкл на лунку, при 4^оС в течение ночи, затем твердую фазу отмывали 0,05% -ным раствором тритона Х-100 и водой. В лунки вносили по 90 мкл 0,01 М натрий-фосфатного буфера, содержащего 0,15 М NaCl, 0,05% твин-20 и 0,2% БСА (буфер А). В первую лунку вносили 10 мкл сыворотки и далее делали серию десятикратных разведений до конца ряда. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре планшет промывали и вносили в каждую лунку по 90 мкл кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, меченых пероксидазой хрена, растворенных в буфере А. Планшет инкубировали 45 мин, отмывали и для измерения ферментной активности добавляли субстратный раствор (4 мкл 30% Н₂О₂ и 4 мг ортофенилендиамина на 100 мл 0,1 М натрий цитратного буфера pH5), по 90 мкл, через 10 мин для остановки ферментативной реакции добавляли по 45 мкл 10%-ного раствора серной кислоты и измеряли поглощение при 492 нм.

3. Гибридизация.

У иммунизированной мыши брали селезенку в стерильных условиях и готовили суспензию спленоцитов. Клетки миеломной линии Р3-Х63.Ag8.653 отмывали средой без сыворотки и сливали со спленоцитами в соотношении 1:1, используя 30%-ный полиэтиленгликоль 6000, 1 мл. Слившиеся клетки отмывали бессывороточной средой, суспендировали в 50 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 5-10 5 М 2-меркаптоэтанола, 1 мМ пируват натрия, 100 единиц пенициллина и стрептомицина, 4-10-7 М аминоптерина, 10-4 М гипоксантина, 1,6 10-5 тимидина и разливали в 96-луночные планшеты, содержащие фиддерный слой мышиных перитониальных макрофагов по 50 мкл в лунку. Через неделю планшеты начинали сканировать ежедневно, супернатанты от активно растущих клонов отбирали и анализировали на присутствие антител к дигоксину. Активные клоны переносили в 24-луночные планшеты, часть клеток замораживали.

4. Отбор положительных клонов.

Для отбора положительных клонов использовали твердофазный иммуноферментный метод. Конъюгированный антиген дигоксин-БСА сорбировали в 96-луночных планшетах, как описано в п.2. В качестве положительных контролей использовали сыворотки мышей, содержащие антитела к дигоксину (разведение 1:200), в качестве отрицательных контролей сыворотки неиммунизированных мышей и супернатанты от миеломных линий. Было выявлено 17 положительных клонов. Далее была изучена способность антител, продуцируемых этими клонами, связывать свободный дигоксин. Сродство антител к дигоксину определяли по ингибированию связывания антител с иммобилизованным антигеном в присутствии свободного дигоксина. Было отобрано 3 клона, активно секретирующих антитела к дигоксину. Эти клоны были проанализированы аналогичным образом на способность связывать аналоги дигоксина.

Для дальнейшей работы был выбран клон D22, обладающий наименьшей перекрестной реакцией по отношению к дигоксигенину.

5. Клонирование методом предельных разведений.

Клетки выбранного клона клонировали методом предельных разведений в 96-луночном планшете, содержащем фиддерный слой макро-фагов, из расчета 0,3 клетки на лунку. После появления клонов супернатанты тестировали на присутствие моноклональных антител. Все выросшие клоны продолжали продуцировать антитела к дигоксину.

6. Производство моноклональных антител в виде асцита.

Для получения больших количеств антидигоксиновых антител гибридомные клетки вводили внутрибрюшинно мышам линии ВАLB/с, за 10 дней до того получившим инъекции 0,5 мл пристана, по 3х10 клеток на животное. После появления у мышей асцитных опухолей (через 5-14 дней) собирали асцитную жидкость, клетки удаляли центрифугированием, асцитную жидкость замораживали и хранили при -20^оС. От каждой мыши получали по 5-10 мл асцита, содержащего от 5 до 8 мг/мл антител.

Полученный штамм гибридных культивируемых клеток D22 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК(П) 623 Д.

Штамм характеризуется следующими признаками: Культуральные свойства клона D22.

Клетки культивируются в монослое в концентрации 5-10 клеток/мл, время субкультивирования составляло около 48 ч.

Криоконсервирование гибридомы осуществляется в смеси равных объемов среды RPMI 1640 и телячьей эмбриональной сыворотки, содержащей 15% диметилсульфоксида по 10 клеток в ампуле. Первые трое суток ампулы хранили при -70^оС, затем переносили в жидкий азот. После размораживания клетки не теряли своих ростовых свойств.

Характеристика моноклональных антител: Антитела из асцитов выделялись солевым осаждением сульфатом аммония и последующей хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе в 0,01 М фосфатном буфере, pH 8,2 с использованием градиента NaCl от 0 до 0,5 М NaCl. Гомогенность выделенных антител проверялась с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Антитела, синтезируемые клоном D22, относятся к подклассу IgG1, что определено твердофазным иммуноферментным методом с использованием козьих антител к подклассам мышиного IgG.

Изучение специфичности моноклональных антител D-22.

В планшете с иммобилизованным конъюгатом дигоксин-ЧСА готовили ряд последовательных разведений аналогов дигоксина в буфере А от 10^-6 до 10^-12 М по 50 мкл в лунке. Добавляли к ним по 50 мкл разведения асцита D-22 в буфере А в разведении 1:10 000. Инкубировали 24 ч при 4^оС, отмывали планшет водой и заканчивали анализ как описано в п.2. Перекрестные реакции оценивали по отношению концентраций аналога и дигоксина, вызывающих 50% ингибирование связывания антител с конъюгатом (таблица).

Таким образом, концентрация дигоксигенина, необходимая для 50% ингибирования, превышает концентрацию дигоксина, необходимую для этой цели, в 11,2 раз, или перекрест составляет 8.9% он значительно ниже, чем перекрест антител аналога (37%).

Константа аффинности антител D22 равна 5˙10⁹ М^-1, что превышает Кафф антител аналога (1,3˙10⁹ М^-1).

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Использование полученных моноклональных антител для определения дигоксина в сыворотке иммуноферментным методом.

Конъюгированный антиген дигоксин-БСА растворяли в 0,05 М натрий карбонат-бикарбонатном буфере (pH 9,6) в концентрации 0,3 мкг/мл и сорбировали на полистироловых 96-луночных планшетах фирмы NUNK, по 120 мкл/лунку, при 4^оС в течение ночи, затем твердую фазу трижды отмывали 0,05%-ным раствором тритона Х-100 и высушивали.

Очищенные ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе моноклональные антитела окисляли периодатом натрия и метили пероксидазой хрена. Для этого 1 мг пероксидазы растворяли в 0,1 мл воды и добавляли 1 мг периодата натрия в 25 мкл воды. Смесь инкубировали 2 ч в темноте при комнатной температуре, пропускали через 0,5 см слой сефадекса G-25 и смешивали с 4 мг антител в 0,1 М карбонат-бикарбонатного буфера, pH 9,5. Через 3 часа добавили 0,1 мг боргидрида натрия, инкубировали 1 ч и диализовали конъюгат против воды. Затем конъюгат был осажден 75%-ным раствором сульфата аммония, отцентрифугирован и растворен в воде. После диализа против физиологического раствора конъюгат хранили в ЗФР в концентрации 10 мг/мл с добавлением 0,01% мертиолята.

Стандартные растворы дигоксина в сыворотке готовили следующим образом.

Пул донорских сывороток или лошадиную сыворотку 100 мл центрифугировали при 15 т. об/мин, инактивировали при 56^оС, затем пропускали через колонку 1/5 см с активированным углем. Приготовленную таким образом сыворотку фильтровали через мембрану с диаметром пор 3,0 нм. Дигоксин растворяли в ДМСО в концентрации 1 мг/мл и готовили из него стандартные растворы в сыворотке в концентрации 0; 0,5; 1; 2; 5 нг/мл. Стандартные сыворотки разливали в пробирки и лиофильно высушивали, перед использованием стандарты разводили дистиллированной водой.

Анализ проводили следующим образом.

Аликвоты по 10 мкл из сывороток крови больных, получавших дигоксин, и стандартных растворов дигоксина в донорской сыворотке, содержащих известное количество препарата, вносили в лунки планшета и добавляли по 100 мкл раствора конъюгата пероксидаза-антитела в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, 0,05% твин-20 и 0,2% БСА, разведение из концентрации 10 мг/мл 1: 20 000. Смесь вpащательно встряхивали, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, твердую фазу отмывали и приливали в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата (4 мкл 30% Н₂О₂ и 4 мг ортофенилендиамина на 10 мл 0,1 М натрий-цитратного буфера, pH 5,0), инкубировали 10 мин в темноте, детекция при 492 нм. На основании значений поглощения, полученных для стандартных растворов, строилась калибровочная кривая (фиг.1). Все измерения выполнялись в дубликатах. Концентрацию дигоксина в сыворотках больных определяли по калибровочной кривой. Например, величине поглощения 1,0 соответствует значение концентрации дигоксина 1,3 нг/мл. Коэффициент вариабельности для 20 параллельных измерений составлял 6,8% Метод позволяет определять дигоксин в интервале от 0 до 5 нг/мл, минимально определяемая концентрация 0,1 нг/мл. Предложенным методом были проанализированы сыворотки 23 больных, получавших дигоксин. Измеренные концентрации препарата находились в терапевтической области и соответствовали терапевтическому эффекту. Для 10 сывороток был проведен параллельный анализ с использованием набора фирмы Boehringer Mannhaim, коэффициент корреляции результатов 0,94.

П р и м е р 2. Использование антител D22 в наборе для иммуноферментного определения дигоксина фирмы Boehringer Mannhaim.

Использовался набор реагентов фирмы Boehringer Mannhaim для иммуноферментного определения дигоксина. В наборе используются антитела к дигоксину, сорбированные на полистироловые пробирки и конъюгат дигоксин-пероксидаза. Мы заменяли антитела из набора нашими антителами. Для этого антитела, выделенные ионообменной хроматографией, сорбировали на полистироловые пробирки в натрий карбонат-бикарбонатном буфере (pH 9,6) в концентрации 0,3 мкг/мл по 1 мл/пробирку, при 4^оС в течение ночи, затем трижды отмывали 0,05%-ным раствором тритона Х-100 и высушивали. Далее проводили анализ по инструкции фирмы. Параллельно анализ проводился также с использованием набора фирмы. Было измерено 17 сывороток больных, получавших дигоксин. Коэффициент корреляции между измерениями очень высок, 0,98 (фиг.2).

Эти примеры подтверждают возможность использования полученных нами антител для иммуноанализа дигоксина.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus L. ВСКК (II) N 623, D, используемый для получения моноклональных антител к дигоксину.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 15-2001

(73) Патентообладатель:ЗАО "ДИАплюс" (RU)

Договор № 12206 зарегистрирован 28.03.2001

Извещение опубликовано: 27.05.2001