Способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: для получения комплексного ферментного препарата, содержащего кислую протеазу и α -амилазу, используют продуцент штамм ВКМf-55, который выращивают на агаризованной соево-глюкозной среде с сернокислым натрием и хлористым кобальтом. Через 5 - 7 сут. конидиями гриба засевают жидкую ферментационную среду следующего состава, мас. %: глюкоза 3,0 - 3,2; крахмал 3,0 - 3,2; кукурузный экстракт 1,2 - 1,25 (по сухому остатку); соевая мука 2,0 - 2,2; сернокислый аммоний 0,20 - 0,25; углекислый кальций 0,25 - 0,30; водопроводная вода остальное до 100%. Глубинное культивирование проводят в течение 3 сут. По окончании ферментации протеолитическая активность культуральной жидкости при рН 3,0 составляет 10 - 12 ГЕ/мл, амилолитическая - 7 - 8 АЕ/мл. Выделение ферментного комплекса проводят из фильтрата культуральной жидкости осаждением этиловым спиртом при температуре 5 ± 1^oС с последующей лиофилизацией раствора фермента. 3 табл.

Изобретение относится к медицинской промышленности, в частности к микробиологическому синтезу ферментов медицинского назначения.

Известен способ получения комплекса протеаз и α-амилазы с использованием Aspergillus oryzae ВКПМ F-369 получением сначала мицелиального посевного материала, затем глубинного культивирования при температуре 27-28^оС в течение 4-5 сут. В этом способе не указано, комплекс каких протеаз продуцирует штамм Aspergillus oryzae F-369, при каком рН определяют комплексную протеолитическую активность [2] В статье этих же авторов, опубликованной в 1989 г. в журнале "Микробиология" (т. 58, в. 3, с. 475-479), указано на то, что общую протеолитическую активность различных популяций Aspergillus oryzae, в том числе и популяции N 32 [2] определяли в культуральной жидкости модифицированным методом Ансона с гемоглобином при рН 4.7 и выражали в мг тирозина в мл.

Комплекс протеаз с рН-оптимумом 4,7 известного способа может быть использован в кожевенной промышленности или в сельском хозяйстве.

Известен способ получения ферментного препарата α-амилазы амилоризина П10 Х [1] включающий культивирование штамма Aspergillus oryzae 3 в поверхностных условиях, экстракцию фермента водой с последующим его осаждением из клеточного экстракта этиловым спиртом и лиофилизацию влажного осадка. На основе амилоризина П10 Х ВВЭЗФП выпускает медицинский препарат "Ораза". В этом способе с помощью поверхностного культивирования продуцента Aspergillus oryzae-3 удается получить лишь один фермент α-амилазу, при этом не синтезируется кислая протеаза, необходимая для расщепления пищевого белка в желудке при нарушениях в пищеварении (гнилостной диспепсии).

В предлагаемом способе получения комплексного ферментного препарата, включающем культивирование продуцента Aspergillus oryzae c последующим выделением ферментов осаждением этиловым спиртом и лиофилизацией, в качестве продуцента используют штамм Aspergillus oryzae BKMF-55, выращенный на агаризованной среде состава, соевая мука 1,0-1,2; глюкоза 2,0-2,2; сернокислый натрий 0,05-0,06; хлористый кобальт 0,00010-0,00015; углекислый кальций 0,20-0,25; агар-агар 2,0; водопроводная вода до 100 при температуре (27 ± 1)^оС в течение 5-7 сут.

Конидии гриба вносят в ферментационную среду состава, глюкоза 3,0-3,2; крахмал 3,0-3,2; кукурузный экстракт 1,20-1,25; соевая мука 2,0-2,2; сернокислый аммоний 0,20-0,25; углекислый кальций 0,25-0,30; водопроводная вода до 100% и проводят глубинное культивирование при температуре (27 ± 1)^оС в колбах Эрленмейера на качалке (200 об/мин) в течение 3 сут.

Штамм Aspergillus oryzae ВKMF-55 получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР.

При глубинном культивировании на ферментационной среде вышеуказанного состава штамм Aspergillus oryzae BKMF-55 выделяет в культуральную жидкость два фермента кислую протеазу и α -амилазу. По окончании ферментации протеолитическая активность культуральной жидкости (по гемоглобину) при рН 3,0 составляет 10-12 ГЕ/мл, амилолитическая 8 АЕ/мл.

Отличиями предлагаемого способа по сравнению с известным являются: использование нового штамма Aspergillus oryzae BKMF-55, продуцирующего в определенных условиях культивирования 2 фермента кислую протеазу и α-амилазу; выращивание посевного материала на агаризованной среде состава, соевая мука 1,0-1,2; глюкоза 2,0-2,2; сернокислый натрий 0,05-0,06; хлористый кобальт 0,00010-0,00015; углекислый кальций 0,20-0,25; агар-агар 2,0; водопроводная вода до 100% при температуре (27 ± 1)^оС в течение 5-7 сут.

культивирование продуцента в глубинных условиях на среде состава, глюкоза 3,0-3,2; крахмал 3,0-3,2; кукурузный экстракт 1,20-1,25; соевая мука 2,0-2,2; сернокислый аммоний 0,20-0,25; углекислый кальций 0,25-0,30; водопроводная вода до 100% при температуре (27 ± 1)^оС в течение 3 сут.

Указанные отличия позволили на 3 сут. культивирования продуцента Aspergillus oryzae BKMF-55 осуществлять биосинтез двух ферментов: α-амилазы и кислой протеазы с оптимумом действия при рН 3,0. Содержащаяся в препарате кислая протеаза с рН 3,0 необходима для расщепления пищевого белка при различных желудочно-кишечных заболеваниях. Именно такой рН необходим для переваривания белковой пищи в желудке. Содержание же α-амилазы в получаемом препарате достаточно для проявления его лечебного действия.

П р и м е р 1.

Стадия I. Биосинтез ферментного комплекса.

Гриб Aspergillus oryzae BKMF-55 выращивают при температуре (27 ± 1)^оС в течение 5 сут. на агаризованной среде состава, Соевая мука 1,0 Глюкоза 2,0 Сернокислый натрий 0,05 Хлористый кобальт 0,0001 Углекислый кальций 0,2 Агар-агар 2,0 Водопроводная вода До 100 Конидии гриба в количестве 5 мл 1-миллиардной взвеси в физиологическом растворе вносят в колбы со 100 мл ферментационной среды состава, Глюкоза 3,0 Крахмал 3,0 Кукурузный экстракт 1,2 (по сухому остатку) Соевая мука 2,0 Сернокислый аммоний 0,20 Углекислый кальций 0,25 Водопроводная вода До 100 рН среды до стерилизации 6,7-6,8 Культивирование микроорганизма проводят в глубинных условиях в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл на качалке (200 об/мин) в течение 3 сут.

Культуральную жидкость (1100 мл) фильтруют через бумажный фильтр и получают 1000 мл нативного раствора с протеолитической активностью 10 ГЕ/мл и амилолитической активностью 8 АЕ/мл.

Протеолитическую активность определяют, используя в качестве субстрата 2% -ный раствор гемоглобина (рН 3,0) по модифицированному методу Ансона ("Биохимия" 37, вып. 1, 1972, с. 198-208). Амилолитическую активность определяют, используя в качестве субстрата 1%-ный раствор крахмала (рН 5,0) по ФС 2639-89.

Стадия 2. Выделение ферментного препарата.

Выделение ферментного препарата из нативного раствора Aspergillus oryzae BKMF-55 осуществляется осаждением 95% -ным этиловым спиртом. Все операции проводят при температуре (5 ± 1)^оС, так как при более высокой температуре снижается выход ферментов, снижение температуры ниже 4^оС не дает положительного эффекта.

К 1000 мл нативного раствора добавляют 500 мл этилового спирта до его конечной концентрации 30-35% и выдерживают 2 ч.

Смесь центрифугируют при 6000 об/мин, осадок балластных белков отбрасывают, а к супернатанту добавляют 1500 мл этилового спирта до его конечной концентрации 60-70% и оставляют на 10-12 ч для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием при 6000 об/мин, промывают 100 мл этилового спирта, растворяют в 60 мл воды, вновь центрифугируют, осадок отбрасывают, раствор ферментов лиофилизируют. Получают 3 г препарата с удельной протеолитической активностью 2,0 ГЕ/мг и амилолитической активностью 1,5 АЕ/мг.

Выход по кислой протеазе 60% по α-амилазе 50% Удельная активность (по кислой протеазе) полученного препарата более чем в 4 раза превышает удельную активность аналога зарубежного препарата "Луизим", имеющего активность 0,48 ГЕ/мг.

Удельная амилолитическая активность полученного препарата в 8-9 раз превышает удельную активность препарата "Луизим", имеющего активность 0,17 АЕ/мг, и соответствует амилолитической активности П10Х [1] П р и м е р 2.

Стадия 1. Биосинтез ферментного комплекса.

Биосинтез ферментов штаммом Aspergillus oryzae BKMF-55 осуществляют аналогично примеру 1. Компонентный состав агаризованной среды, Соевая мука 1,2 Глюкоза 2,2 Сернокислый натрий 0,06 Хлористый кобальт 0,00015 Углекислый кальций 0,2-0,25 Агар-агар 2,0 Водопроводная вода До 100.

Компонентный состав ферментационной среды, Глюкоза 3,2 Крахмал 3,2 Кукурузный экстракт 1,25 Соевая мука 2,2 Сернокислый аммоний 0,25 Углекислый кальций 0,3 Водопроводная вода До 100.

Получают 1000 мл нативного раствора с протеолитической активностью 8 АЕ/мл.

Стадия 2. Выделение ферментного препарата. Выделение ферментного препарата из нативного раствора осуществляют аналогично примеру 1. Получают 3,2 г препарата с протеолитической активностью 2,2 ГЕ/мг и амилолитической активностью 1,4 АЕ/мг.

Выход по кислой протеазе 58,7% по α-амилазе 56,0% Варианты осуществления предлагаемого способа приведены в табл. 1 и 2, 3.

Как видно из данных, представленных в табл. 1 и 2, при использовании II, III и IV вариантов агаризованных и жидких ферментационных сред достигается максимальный уровень образования ферментов.

Данные, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что оптимальной температурой культивирования является (27 ± 1)^оС.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, предусматривающий приготовление мицелиального посевного материала продуцента Aspergillus oryzae на среде, содержащей соевую муку, водопроводную воду, и последующее глубинное культивирование полученного посевного материала на ферментативной среде, содержащей соевую муку, водопроводную воду, до достижения максимальной активности, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм гриба Aspergillus oryzae ВКМ F-55, а выращивание спорового материала ведут на среде, дополнительно содержащей глюкозу, сернокислый натрий, хлористый кобальт, углекислый кальций и агар-агар, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Соевая мука - 1,0 - 1,2
Глюкоза - 2,0 - 2,2
Сернокислый натрий - 0,05 - 0,06
Хлористый кобальт - 0,00010 - 0,00015
Углекислый кальций - 0,20 - 0,25
Агар-агар - 2,0
Водопроводная вода - Остальное
при температуре 26 - 28^oС в течение 5 - 7 суток, культивирование посевного материала ведут на ферментативной среде, дополнительно содержащей глюкозу, крахмал, кукурузный экстракт, сернокислый аммоний, углекислый кальций, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Глюкоза - 3,0 - 3,2
Крахмал - 3,0 - 3,2
Кукурузный экстракт - 1,20 - 1,25
Соевая мука - 2,0 - 2,2
Сернокислый аммоний - 0,20 - 0,25
Углекислый кальций - 0,25 - 0,30
Водопроводная вода - Остальное
при температуре 26 - 28^oС в течение 3 суток.

РИСУНКИ

Рисунок 1