Способ получения гипериммунной сыворотки против кампилобактериоза телят

 

Использование: биотехнология, поливалентная гипериммунная сыворотка против кампилобактериоза телят. Сущность изобретения: в качестве животных - продуцентов используют телят 8 - 12 месячного возраста, из исходных штампов C. jejni ВГНКИ N 169 / 17, ВГНКИ N 79, ВГНКИ N 80 отдельно готовят живые и убитые 0,5% формалина вакцины, гипериммунизации телят осуществляют живой и инактивированной вакцинами шестикратно с интервалами между инъекциями 3 - 4 сут. При этом убитые вакцины вводят подкожно в дозе 20 - 30 млрд. микробных тел, живые в возрастающих дозах : 30 - 40, 50 - 60, 80 - 90, 100 - 120 млрд. микробных тел соответственно с последующим их снижением до 80 - 90 и 50 - 60 млрд. микробных тел в заключительных инъекциях. Отбор крови производят при титрах сывороток не менее 1 : 1600 - 1 : 3200 на 7 - 10 день после последней инъекции. После контроля сыворотки смешивают в равных пропорциях. 2 табл.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности ветеринарной микробиологии, и относится к способам получения поливалентной гипериммунной сыворотки против кампилобактериоза новорожденных телят.

Современные достижения мировой науки по вопросам кампилобактериозной инфекции у крупного рогатого скота, в особенности в странах с развитым животноводством (США, Англии, Канаде, Австралии, ФРГ, Скандинавских странах и др. ) характеризуют ее как комплексный процесс с участием патогенных кампилобактерий видов C. fetus и C. jejuni.

Установлено значение вида C. jejuni в этиологии острых диарейных желудочно-кишечных заболеваний (ОЖКЗ) животных и человека. Обзор данных ВОЗ, за 1984 г, а также работы исследователей последних лет со всей очевидностью свидетельствуют о широком распространении ОЖКЗ, обусловленных видом C. jejuni во многих странах. Установлено эпидемиологическое значение животных и продуктов животноводства в механизме заражения населения, в особенности заболевания детей.

Культуры кампилобактерий вида C. jejuni, как правило, выделяются у больных новорожденных телят, а также из крови, молозива и влагалищной слизи коров-матерей больных телят.

В условиях выраженной очаговости инфекции и постоянного суперинфицирования новорожденные телята 1-10 дневного возраста тяжело переболевают острыми желудочно-кишечными расстройствами, сопровождающимися профузными поносами, в тяжелой форме часто с примесью крови.

Как свидетельствуют данные исследований, применение антибиотиков и других общепринятых медикаментозных средств не дает желаемых результатов в борьбе с кампилобактериозом телят. А специфические средства и методы лечения в нашей стране не разработаны.

Ряд зарубежных исследователей предлагает использование штаммноспецифической сывороточной бактерицидной активности, как важного фактора в защите организма против C. jujuni в тканях и кровяном русле.

Было установлено, что антитела, образовавшиеся при активной иммунизации или введенные вместе с сывороткой, поступают в просвет протока полового тракта и др. органов оказывая бактерицидные воздействия на возбудителя болезни [1] В то же время нами не установлено в доступной литературе данных по изготовлению и испытанию защитной эффективности специфической кампилобактериозной сыворотки для лечения ОЖКЗ, обусловленного видом C. jejuni.

Аналогом нашей разработки является специфическая противокампилобактериозная сыворотка при защите от инфекции, обусловленной видом C. fetus [2] Для изготовления вакцины был использован штамм N 14858 подвида C. fetus (группа А-1), который был выделен из вагинально-цервикальной слизи коровы.

Для иммунизации были использованы 3 телки в возрасте 3-х лет породы Герефорд, которые были гипериммунизированы 3-х кратно с месячным интервалом подкожными инъекциями убитой вакцины в дозе 3 мл содержащей 82 мг сухого вещества антигена в полном адъюванте. Через месяц были проведены еще две подкожные инъекции вакцины с 2-х недельным интервалом в дозе 5 мл, содержащей 100 мг сухого вещества без адъюванта. Через 7 дней после последней инъекции от каждой телки было взято от 2-х до 3-х л крови. Титры агглютинации сывороток от 3-х телок после гипериммунизации диапазон от 10,240 до 40,980.

По результатам испытания эффективности 4-е привитые телки с титрами 2,560 были устойчивыми к контрольному заражению. У 5-й телки с титром сыворотки 2,560 культура кампилобактерий была выделена из влагалищной слизи на 6-й день после введения сыворотки. По результатам опыта все телки обработанные сывороткой с титрами 2,560 и выше были устойчивыми к контрольному заражению и не были инфицированными.

Целью изобретения является повышение специфической активности поливалентной гипериммунной сыворотки против кампилобактериоза новорожденных телят, обусловленного видом.

Поставленная цель достигается тем, что для получения поливалентной гипериммунной сыворотки против кампилобактериоза новорожденных телят, обусловленного видом C. jejuni путем гипериммунизации животных продуцентов инактивированной и живой культурами вакцинных штаммов с последующим забором крови и отделением сыворотки, в качестве животных-продуцентов используют телят 8-12 месячного возраста, из исходных штаммов N 169/17, М-2, ТЛ-1, отдельно готовят живые и убитые 0,4% раствором формалина вакцины, гипериммунизацию телят осуществляют живой и инактивированной вакцинами шестикратно с интервалами между инъекциями 3-4 сут, причем инактивированную вакцину вводят подкожно в дозе 20-30 млрд. микробных тел, живую вводят в возрастающих дозах соответственно 30-40; 50-60; 80-90; 100-120 млрд. микробных тел. Затем вводят два раза вакцины в сниженных дозах соответственно 80-90 и 50-60 млрд. микробных тел. При этом подкожные инъекции осуществляют на 30-40 мин ранее внутривенных. Взятие крови производят при титрах сывороток не менее 1:1600-1: 3200 +++ и ++++ на 7-10-й день после последней инъекции вакцины. При необходимости повторное взятие производят через 10-14 дней при сохранении титров сывороток. После проведения контрольных исследований на иммунологическую активность и стерильность полученные сыворотки смешивают в равных пропорциях.

Забор крови производят исходя из расчета 10-16 мл на 1 кг веса животного.

Соответствие заявляемого технического решения критерию "новизна" подтверждается новой совокупностью существенных признаков, отличающих его от прототипа.

Заявитель считает, что заявляемое техническое решение соответствует критерию "существенные отличия", поскольку аналогов, содержащих признаки, отличающие заявляемое решение от прототипа не обнаружено.

В результате выполненных исследований для получения поливалентной гипериммунной противокампилобактериозной сыворотки для телят подобраны 3 штамма C. jejuni (NN 169/17, ТЛ-1, М-2), выделенных от крупного рогатого скота и по поверхностно-оболочечным (термолабильным) антигенами гетерологичных между собой: 1. Штамм N 169/17/ (серотип I) вида C. jejuni (авт.св. СССР N 1360192); 2. Штамм N ТЛ-1 (серотип 2) вида C. jejuni, выделен в 1987 году в проблемной лаборатории Ленветинститута из головного мозга теленка 2-х дневного возраста совхоза "Красная Звезда" Ленинградской области. Штамм депонирован в музее ВГНКИ N 79 (справка N 6533/37 от 4.12.89 г).

3. Штамм N М-2 (серотип 3) вида C. jejuni, выделен в 1988 г в проблемной лаборатории Ленветинститута из влагалищной слизи коровы: "Магнолия" совхоза "Осьминский" Ленинградской области. Штамм депонирован в музе ВГНКИ N 80 (справка N 6532/37 от 04.12.89 г).

В серии комиссионных опытов, проведенных в Ленветинституте и ВГНКИ были изучены культурально-биохимические и антигенные свойства культур ТЛ-1 и М-2.

В ходе выполненных исследований было установлено, что культуры ТЛ-1 и М-2 по морфологическим и культурально-биохимическим свойствам соответствуют характеристикам вида C. jejuni согласно определителя микробов Bergey's 1984 г (1).

Клетки культур ТЛ-1 и М-2 не окрашиваются по Граму, обладают выраженной подвижностью, каталазной активностью. Культуры образуют сероводород на ПЖА с 0,02% цистина и не образуют на МПБ, растут на ПЖА с 1% глицина и 4 и 10% желчи, не дают роста на селективной питательной среде с 3,5% поваренной соли по уколу в 0,5% агаре. Редуцируют 0,2% селенит натрия и нитраты, не редуцируют нитриты. Культуры не ферментируют углеводы (глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, маннит), растут на ПЖА при 37^оС, не растут на ПЖА при 25^оС. На ПЖА с 30 мг налидиксовой кислоты рост отсутствует.

Результаты изучения антигенной структуры (табл.1) свидетельствуют о том, что штамм ТЛ-1 и М-2 принадлежат к различным серовариантам, и по поверхностно-оболочечным антигенам гетерологичны между собой и штаммом N 169/4.

Способ получения поливалентной гипериммунной сыворотки против кампилобактериоза новорожденных телят.

1 этап. Получение бакмассы вакцинных штаммов вида N 169/17, ТЛ-1 и М-2 для гипериммунизации групп продуцентов крупного рогатого скота.

а) Д ля гипериммунизации телят готовят живую и убитую 0,4%-формалина вакцину из штаммов N 169/17, ТЛ-1, М-2. Посев культур штаммов вначале проводят на полужидкий агар (ПЖА). Для этого берут 1-2 ампулы лиофилизированной культуры, добавляют в них 2 мл изотонического раствора хлористого натрия, а затем при помощи пастеровской пипетки производят рассев на ПЖА. Посевы культур на ПЖА помещают в эксикаторы или термостаты с заменой воздуха на 10-15% углекислым газом. Культивируют при 37,5-38^оС в течение 48 ч.

б) Типирование культур вакцинных штаммов для приготовления расплодки.

Культуры 2-х суточного роста проверяют по результатам микроскопического исследования и отбирают наиболее типичные по морфологическим признакам колонии, затем рабочие культуры проверяют в РА с моноспецифическими сыворотками на антигенную активность и проводят контрольное их типирование по культурально-биохимическим свойствам согласно таксономическим тестам определения микробов (1). Для расплодки вакционного штамма отбирают культуры, которые наиболее соответствуют видовым характеристикам по результатам типирования.

в) Расплодка и получение матрицевой культуры. Расплодку готовят в пробирках с ПЖА и культивируют по п. "А". Через 48 ч после посева культуры штаммов N 169/17, ТЛ-1 и М-2 контролируют по интенсивности роста, проверяют ее на чистоту и морфологические свойства и засевают на бактериологические колбы-матры с мясо-пептонным печеночным агаром (МППА). Культивирование матр с посевами производят в термосах по п. "а". Односуточные культуры штаммов на матрах смывают изотоническим раствором поваренной соли. Полученную бакмассу разливают в 2 колбы- для приготовления живой и убитой вакцины из одной серии. Для инактивации в одну из колб добавляют 0,4% формалина и выдерживают 48 ч в термостате при 37,5-38^оС периодически взбалтывая. Другую часть бакмассы оставляют в нативном состоянии и хранят в холодильнике при 12^оС. Рабочую концентрацию обеих вакцин (убитой и живой) доводят до 30 млрд.м.т. в 1 мл и после контроля убитой на стерильность и иммуногенность, а живой на типичность морфологии и иммуногенность, используют для гипериммунизации телят-продуцентов. При этом живую вакцину готовят с таким расчетом, чтобы использовать для однократной иммунизации животных в течение 5-7 дней.

II этап.

а) Подбор телят-продуцентов и способ гипериммунизации.

Для получения поливалентной гиперммунной сыворотки против кампилобактериоза телят используют телят 8-12 мес. возраста, хорошей упитанности, благополучных по бруцеллезной и кампилобактериозной инфекциям. Сыворотка, полученная от телят-продуцентов является гомологичной, поэтому значительно дольше не выводится из организма и почти не вызывает анафилаксических явлений.

Гипериммунизацию телят проводят по схеме, разработанной в проблемной лаборатории ЛВИ (табл. 2). В течение всего цикла иммунизации устанавливают наблюдение за общим состоянием животных. Интервалы между инъекциями составляют 3-4 суток. Гипериммунизацию телят проводят методом подкожного введения инактивированной вакцины и внутривенного живой в соответствующих дозах. При этом подкожная иммунизация должна на 30-40 мин опережать внутривенную для предупреждения явлений анафилаксического шока.

При подкожной иммунизации каждую дозу вакцины для инъекции разводят в 10 мл изотонического раствора поваренной соли, при внутривенной в 100 мл упомянутого раствора. Введение вакцины прекращают при наличии титров РА специфических антител на иммунизирующий штамм в разведении 1:1600-1:3200.

б) Получение и контроль поливалентной гипериммунной сыворотки против кампилобактериоза телят.

При титре сыворотки в РА 1:3200 и выше на 7-10-й день после последней инъекции вакцин (антигенов) проводят первое кровопускание, периодически его повторяя через 10-14 дней при сохранении титров сыворотки. Кровь берут при соблюдении условий стерилизации из расчета 16 мл на 1 кг веса животного. Кровь берут в стерильные колбы или цилиндры. Оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре для свертывания. Прозрачную сыворотку сливают и стерилизуют методом фильтрации через фильтры Зейтца. Полученную сыворотку контролируют на иммунологическую активность в РА и стерильность.

Перед расфасовкой поливалентной гипериммунной сыворотки против кампилобактериоза новорожденных телят по флаконам для определения иммунологической активности ставят РА с гомологичными корпускулярными антигенами из штаммов NN 169/17, ТЛ-1 и М-2 и контрольными корпускулярными антигенами I и II-го подвидов. Антигены для РА готовят из 1-2-х суточных культур штаммов N 169/17, ТЛ-1, М-2, как указано в п. "А" и "Б" (этапа I). При наличии агглютинационного титра 1:3200 и выше сыворотка пригодна для применения.

РА ставят по общепринятой методике.

В зависимости от количества животных на каждого из них готовят 3 ряда пробирок последовательно удваивающихся разведений сывороток телят от 1:50 до 1: 6400 на изотоническом растворе поваренной соли, содержащего 0,3% формалина. Кроме того, для контроля антигена готовят 2 ряда пробирок для разведения отрицательной сыворотки и 3 ряда пробирок для разведения позитивных гомологичных подвидовых кампилобактериозных сывороток. Рабочая концентрация корпускулярных антигенов должна быть 1 млрд.м.т. по оптическому стандарту мутности ГИСК им.Тарасевича.

В каждый ряд пробирок с соответствующими разведениями сывороток в объеме 0,5 мл вносят гомологичный антиген по 0,5 мл. После добавления антигена штатив с пробирками встряхивают и выдерживают при температуре 37^оС в течение 24 ч, затем 3-4 ч при комнатной температуре и проводят учет реакции.

Реакцию оценивают по четырехбальной системе в крестах: ++++ (4 креста) 100%-ная агглютинация кампилобактерий при полном просветлении жидкости и образование рыхлого осадка, разбивающегося на хлопья при встряхивании; +++ (3 креста) 75%-ная агглютинация, наличие слабого просветления жидкости и образование рыхлого осадка, разбивающегося на хлопья; ++ (2 креста) 50%-ная агглютинация, слабое просветление жидкости и образование небольшого осадка, также разбивающегося на хлопья; + (1 крест) 25%-ная агглютинация, почти отсутствует просветление жидкости при наличии небольшого осадка, при встряхивании которого заметны отдельные хлопья; (минус) отсутствие просветления жидкости, незначительный осадок, который разбивается при встряхивании в гомогенную смесь.

Для определения стерильности полученной поливалентной гипериммунной сыворотки против кампилобактериоза телят производят бактериологические высевы из каждой колбы с сывороткой на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и агар Сабуро. Все посевы на средах должны оставаться стерильными в течение 10 суток при температуре 37-38^оС (на агаре Сабуро -20-24^оС). После проведения контрольных исследований гомологичные сыворотки штаммов NN 169/17, ТЛ-1 и М-2 смешивают в равной пропорции и разливают по флаконам.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА ТЕЛЯТ, предусматривающий многократные инъекции живой культурой штамма Campylobacter jejnni ВГНКИ N 169/17 с интервалами между инъекциями 3 - 4 суток телятам 8 - 12-месячного возраста с последующим отбором крови при титрах сыворотки не менее 1 : 1600 - 1 : 3200 и отделением сыворотки, отличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности сыворотки, для инъекций дополнительно используют порознь приготовленные инактивированную формалином культуру штамма Campylobacter jejnni ВГНКИ N 169/17 и живые и инактивированные формалином культуры штаммов Campylobacter jejnni ВГНКИ N 80 и Campylobacter jejnni ВГНКИ N 79, инъекции осуществляют шестикратно инактивированной и живой культурами каждого штамма параллельно, при этом инактивированные культуры вводят подкожно в дозе 20 - 30 млрд.кл., живые - через 30 - 40 мин внутривенно в дозах 30 - 40, 50 - 60, 80 - 90, 100 - 120, 80 - 90, 50 - 60 млрд. кл. соответственно на каждую инъекцию, а после отделения полученные сыворотки смешивают в равных соотношениях.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3