Штамм опухолевых клеток рабдомиосаркомы крысы, используемый в качестве модели для изучения процессов органотропного метастазирования и скрининга противоопухолевых препаратов

 

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: штамм получен путем длительной массовой селекции /64 цикла/ на понижение метастатического потенциала и темпов формирования метастазов на основе высокозлокачественного аффинитетного штамма РА-23. Депонирован в ВОНЦ АМН СССР под N 10010. Штамм пассируется на белых беспородных крысах путем внутривенного введения суспензии одиночных клеток через 25 - 29 суток. По сравнению с известным штамм обладает значительно более низкой метастатической активностью, замедленными темпами формирования и роста легочных метастазов, пониженной плоидностью и низким содержанием маркерного поверхностного белка р58, необходимого для реализации опухолевыми клетками способности к метастазированию. При использовании штамма вместе с прототипом он представляет собой модель для выяснения роли наследственных и ненаследственных изменений в популяции опухолевых клеток. 2 ил.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано как модельный объект для исследований по цитологии, генетики и экспериментальной онкологии с целью выяснения роли наследственных и ненаследственных факторов, влияющих на реализацию опухолевыми клетками способности к метастазированию.

В настоящее время наилучшие результаты исследования фенотипических особенностей опухолевых клеток, обеспечивающих формирование метастазов, достигнуты при использовании пар опухолевых штаммов, связанных общностью происхождения, но отличающихся друг от друга по признаку "метастатический потенциал" (МП). Известны пары штаммов мышиных меланом В16, К-1735, мышиной фибросаркомы UV-2237 [1] крысиной аденокарциномы Вsp733 [2] и т.д. Однако, во всех этих случаях исходным служил штамм с низким МП и из него в результате нескольких ступеней селекции (10-15 шагов) получали высокозлокачественный аналог. Для этих штаммов характерно не очень большое различие по МП между парами штаммов и высокая частота метастазирования в другие органы (15%). Кроме того, неизвестны такие парные штаммы клеток с высоким и низким МП на основе опухолей скелетных мышц (рабдомиосарком).

Однако, в процессе селекции на высокий МП были утеряны варианты с низкой способностью к метастазированию, без которых невозможны многие эксперименты по изучению роли наследственных и ненаследственных факторов, необходимых для реализации способности опухолевых клеток к формированию метастазов.

Целью предлагаемого изобретения является получение парного штамма клеток к высокозлокачественному штамму рабдомиосаркомы клеток рабомиосаркомы РА-23.

Предлагаемый штамм был получен в результате длительной (65 циклов) обратной селекции индивидуальных легочных метастазов (на понижение метастатического потенциала).

Для процедуры обратного отбора были использованы суспензии опухолевых клеток, выделенные из индивидуальных метастазов, имеющих, как известно, уницеллюлярное происхождение. В каждом цикле отбора реклонированию подвергали, как правило, 10 клонов. Для определения метастатического потенциала клетки каждого клона прививали 3 крысам, причем прививочная доза при тестировании всех клонов данного пассажа была одинаковой. На ранних этапах отбора эта доза составляла 1 2х10³ клеток на животное, на поздних 1-2х10⁵. В следующий пассаж отбирались только субклоны тех клонов, которые дали наименьшее количество метастазов. Подсчет опухолевых узлов проводили на ранних этапах селекции через 17-18 сут после инъекции, в дальнейшем этот срок был увеличен до 25-28 сут. В результате указанной селекции был отобран штамм РА-24, обладающий пониженным МП. Штамм хранится в банке перевивных штаммов ВОНЦ АМН РФ, регистрационный N 10010.

Особенности культивирования штамма в условиях in vitro. Штамм культивировали на ростовой среде 199 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, 2 мМ глутамина, 200 ед/мл пенициллина и 0,4 мг/мл стрептомицина. Культивирование проводили при 37^оС в герметично закрытых флаконах без подачи СО₂. Кратность рассева 1:2 при пересеве через 72 ч. Посевная доза клеток 2х10⁵ на мл. Криоконсервацию проводили в среде 199 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки и 10% диметилсульфонидоксида при концентрации 1х10⁶ клеток на мл. Жизнеспособность клеток после размораживания 88-90% Ростовые характеристики штамма. Прививаемость животным при внутривенных инъекциях 100-200 тыс клеток на крысу 94% при подкожном введении 1х10⁶ клеток 100% аффинитет к легочной ткани (метастазы формируются только в легких) 100% клоногенная способность варьирует в пределах 5х10^-6 2х10^-4. Время от внутривенного введения клеток до формирования легочных метастазов весом 10-20 мг 25-28 сут.

Морфологические характеристики штамма.

Опухолевая масса метастазов состоит из беспорядочно переплетающихся между собой и бессистемно расположенных пучков веретеновидных клеток. Ядра имеют палочковидную форму, содержат, как правило, одно ядрышко. Соотношение размеров ядра и цитоплазмы 1:2. По своим морфологическим характеристикам штамм РА-24 представляет низкодифференцированную рабдомиосаркому.

Особенности штамма.

Полученный штамм РА-24 отличается от родительского штамма РА-23 по комплексу признаков: величина МП снижена более чем в 100 раз (если для исходного штамма величина МП составляет 6х10^-2, то для полученного она составляет 5х10^-6-2х10^-4); новый штамм характеризуется как триплоидный (ДИ=1,56) в отличие от тетраплоидного РА-23 (ДИ=2,04). Разброс по числу хромосом от 46 до 59, в модальном классе 51-52 хромосомы (для исходного штамма эта величина соответствует 69-70); количество маркерного поверхностного белка р58, необходимого для реализации опухолевыми клетками способности с метастазированию, снижено по сравнению с исходным штаммом примерно в 1,5 раза. По показателям радиоустойчивости штамм РА-24 характеризуется сравнительно высокой радиоустойчивостью клеток (D_o 2,4 Гр) и низкой репарационной способностью клеток (D_o 1,1 Гр). Значения основных параметров кривой выживаемости клеток РА-24 после их облучения в диапазоне доз 1-10 Гр равны D_o 2,4 Гр, D_g1,1 гр, n 2, что несущественно отличается от показателей радиочувствительности клеток штамма РА-23 (D_o 2,4 Гр, D_g 1 Гр, n 1,5).

П р и м е р 1. Для изучения кинетики роста экспериментальных легочных метастазов суспензии одиночных клеток РА-24 вводили в/в белым беспородным крысам (самкам) (n 60) в дозе 10⁵ клеток на животное. Привитых животных забивали через 14, 16, 18, 22, 24, 26 и 28 сут, экспериментальные метастазы освобождали от ткани легкого и взвешивали на торзионных весах. Контролем служили экспериментальные метастазы, полученные по той же методике от штамма РА-23 (прививочная доза составила 2000 опухолевых клеток на животное; в контроле было использовано также 60 крыс).

Как показывают данные фиг. 1, экспериментальные метастазы РА-24 (кривая 2) растут значительно медленнее, чем экспериментальные метастазы использованного в качестве исходного материала при его селекции штамма РА-23 (кривая 1). Максимальное различие по среднему весу экспериментальных метастазов наблюдалось на 20-25 сут после прививки. Таким образом, у штамма РА-24 резко замедленное формирование экспериментальных метастазов по сравнению с исходным штаммом РА-23.

П р и м е р 2. Для изучения фенотипической гетерогенности популяции опухолевых клеток по признаку "частота клеток с микроядрами", характеризующую степень кариотипической нестабильности опухолевых клеток, суспензию одиночных клеток РА-24 вводили внутривенно белым беспородным крысам (самкам) весом 120-140 г (n 25) в дозе 2х10⁵ на крысу. Через 23 сут животных предварительно усыпленных эфиром декапитировали, экспериментальные метастазы (клоны) освобождали от легочной ткани. Мазки от отдельных экспериментальных метастазов фиксировали метанолом, высушивали и окрашивали по Гимзе. На препаратах, полученных от каждого экспериментального метастаза анализировали по 1000 неповрежденных опухолевых клеток. Частоту клеток с микроядрами выражали в процентах.

Распределение 59 экспериментальных метастазов штамма РА-24 по признаку "частота клеток с микроядрами" представлены на фиг. 2. Хорошо заметен большой размах изменчивости по изучаемому признаку (от 1 до 10%) и хорошо выраженный модальный класс в области 5-6% Среднее значение частоты клеток с микроядрами у штамма РА-24 составило 5,3% По этому показателю штамм РА-24 почти в 4 раза превосходит штамм РА-23, отличающийся высокими показателями злокачественности. Таким образом штамм РА-24 может быть использован для изучения фенотипической гетерогенности популяций опухолевых клеток по признакам, характеризующим нестабильность генома опухолевых клеток.

П р и м е р 3. Как известно, клетки, способные формировать метастазы, составляют лишь небольшую фракцию клеток злокачественной опухоли. Вопрос о том с какой частотой подобные клетки возникают в ходе роста опухоли представляет большой интерес для онкологии. Для определения частоты возникновения метастазирующих клеток суспензию одиночных клеток штамма РА-24 прививали внутривенно как описано выше и в сформировавшихся индивидуальных легочных метастазах (клонах) определяли число опухолевых клеток. После этого суспензию клеток каждого экспериментального метастаза прививали внутривенно 5 крысам (прививочная доза от суспензии клеток каждого метастаза была одинаковой), затем определяли число метастазов сформировавшихся в каждом опыте по реклонированию и просчитывали частоту возникновения клеток с метастатическим потенциалом по формуле Лурия-Дельбрюка (6):r aNln(NCa), где r среднее число метастазов, сформировавшихся при реклонировании, а скорость возникновения наследственных изменений, N среднее число клеток в клоне, С число клонов, параллельно использованных в опытах по реклонированию.

В описанном опыте частота возникновения клеток с метастатическим потенциалом оказалась равной (2,3-0,49)х10^-5 на клетку на поколение, в то время как для штамма РА-23 подобная величина составляет (85,9-35,2)х10^-5. Таким образом, для штамма РА-24 характерно сравнительно низкая частота возникновений клеток, обладающих способностью формировать метастазы, что делает его удобным объектом для изучения агентов, индуцирующих превращение неметастазирующих опухолевых клеток в метастазирующие.

Таким образом, предлагаемый штамм обладает значительно более низкой метастатической активностью (5х10^-6-2х10^-4 по сравнению с прототипом РА-23 (6х10^-2), содержание ДНК в клетках предлагаемого штамма снижено до триплоидного (ДИ=1,56) уровня, у РА-23 (ДИ=1,97-2,04). Число хромосом в клетках модального класса составляет 51-52 (у РА-23 69-70). Темпы формирования клонов замедлились на 9 сут. Экспрессия белка р58 по сравнению с прототипом снижена в 1,5 раза.

Из этого следует, что предлагаемый штамм является удобной моделью для изучения процесса метастазирования, скрининга противоопухолевых препаратов и поиска агентов, подавляющих нарастание кариотипической нестабильности в популяциях опухолевых клеток и тем самым препятствующих их прогрессии.

Формула изобретения

Штамм опухолевых клеток рабдомиосаркомы крысы РА-24 ВОНЦ АМН СССР N 10010, используемый в качестве модели для изучения процессов органотропного метастазирования и скрининга противоопухолевых препаратов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2